液；滤液在60°C下真空浓缩至约10mL后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4°C蒸馏水中低温透析12h ;透析袋内溶液经60°C下真空浓缩至约50mL后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；
[0030]S102、取150mg龙眼粗蛋白多糖溶于1mL蒸馏水中，在4500r/min的转速下充分离心lOmin，溶解后离心取上清液3mL，以0.3mL/min的流速加入1.6cmX 50cm的SephadexG-100凝胶柱中，并以蒸饱水在0.3mL/min流速下洗脱，采用苯酸硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；
[0031]S103、取150mg龙眼粗蛋白多糖溶于1mL 0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入1mg FITC，于室温下避光搅拌反应24h。反应结束后，在4500r/min的转速下离心1min,取上清液3mL，以0.3mL/min的流速加入1.6cmX 50cm的Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水在0.3mL/min流速下洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；
[0032]S104、采用0.lmol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度0.5 - 200 μ g/mL的多糖样液，分别经0.45 μ m微孔滤膜过滤后自动进样检测；
[0033]检测条件为:
[0034]检测条件:采用高效液相色谱仪结合焚光检测器分析，色谱柱为Ultrahydrogel1000凝胶色谱柱(7.8mmX 300mm, Waters)。色谱分析条件为:流动相，0.10mol/L硝酸钠；流速，0.5mL/min ;柱温，35°C ;荧光检测器，Aex 490nm，Aem 518nm ;进样量，25 μ L ;
[0035]S105、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
[0036]异硫氰酸荧光素(FITC)能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，赋予蛋白多糖稳定的荧光特征，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性。采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器(HPSEC-FD)分析检测龙眼肉蛋白多糖:结合蛋白多糖浓度和峰面积对数建立标准曲线，在I?200 μ g/mL的浓度范围内线性关系良好(R2= 0.998，最低检出限为0.25 μ g/mL，最低定量限为0.85 μ g/mL)，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。故本发明的方法不仅能同时实现蛋白多糖的定性定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
[0037]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括: 步骤一、取龙眼干果肉，加蒸馏水进行匀浆处理，龙眼肉匀浆保温浸提后，抽滤分离滤液；滤液浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于蒸馏水中低温透析；透析袋内溶液真空浓缩后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末； 步骤二、取龙眼粗蛋白多糖溶于蒸馏水中，充分溶解后离心后取上清液加入SephadexG-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品； 步骤三、取龙眼粗蛋白多糖溶于碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素，于室温下避光搅拌反应，反应结束后，离心取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280nm和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品； 步骤四、采用硝酸钠溶液配制系列浓度的荧光标记龙眼肉蛋白多糖样液，分别经0.45 μπι微孔滤膜过滤后采用液相色谱仪结合荧光检测器分析，进行荧光标记龙眼肉蛋白多糖的标准曲线测定； 步骤五、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
2.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤一所述的龙眼肉匀浆在90°C下保温浸提2小时。
3.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤一所述的滤液在60°C下真空浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4°C蒸馏水中低温透析12小时。
4.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，在步骤三中，龙眼粗蛋白多糖溶于0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素后于室温下避光搅拌反应24小时。
5.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤四中采用.0.lmol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度为0.5 - 200 μ g/mL的多糖样液。
【专利摘要】本发明公开了一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，包括龙眼肉蛋白多糖的制备、龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、龙眼肉蛋白多糖的检测。异硫氰酸荧光素能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性，采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器分析检测龙眼肉蛋白多糖，在1～200μg/mL的浓度范围内线性关系良好，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析，最低检出限为0.25μg/mL，最低定量限为0.85μg/mL；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。本发明不仅能同时实现蛋白多糖的定性、定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
【IPC分类】G01N30-88, G01N30-06
【公开号】CN104865333
【申请号】CN201510245943
【发明人】易阳, 王宏勋, 闵婷, 侯温甫, 艾有伟, 王丽梅
【申请人】武汉轻工大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月14日