一种醇脱氢酶及其在合成度罗西汀中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种醇脱氢酶，含有编码该酶的核酸序列的 重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该醇脱氢酶 作为催化剂在不对称合成度罗西汀中间体中的应用。
【背景技术】
[0002] 抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的 主要类型。抑郁症包括单相性抑郁症（即重性抑郁症和精神抑郁症）、适应性障碍、轻微抑 郁症、季节情感性精神障碍（SAD)、经前期焦虑症（PMDD)、产后抑郁症、非典型抑郁症、双相 性精神障碍及躁郁症等多种类型。抑郁症的发病机制尚未完全明确，目前研究认为与遗传、 心理、神经内分泌等因素诱发中枢去甲肾上腺素或5-羟色胺（5-HT)、多巴胺（DA)、乙酰胆 碱（Ach)、神经肽等神经递质含量降低及其受体功能下降有关。近年来研究发现抑郁症还 与谷氨酸（也是一种中枢神经递质）传导功能障碍有关。目前的抑郁症诊断标准都比较 强调精神症状，相对忽视躯体症状。一项国际研究提7K，69 %的抑郁症患者存在躯体症状。 77 %主诉精神症状的抑郁症患者得到诊断，而仅有22 %主诉躯体症状的抑郁症患者得到诊 断。忽视躯体症状导致抑郁症被误诊或漏诊，使患者辗转于其他临床科室寻求治疗，既延误 了患者的诊治，也浪费了医疗资源。世界卫生组织2005年统计，各种抑郁症的患病率约占 全球人口的11 %。在中国，目前抑郁症的患病率约为3%~5%，抑郁症患者估计有3600万 人。与高发病率形成鲜明反差的是，目前全国地市级以上医院对抑郁症的识别率不到20%。 而在现有抑郁症患者中，只有不到10%的人接受了相关药物治疗。抑郁症在我国造成的直 接经济负担约为141亿元，间接经济损失约481亿元，总经济负担达到621亿元。据世界卫 生组织（WHO)发表的《世界卫生报告》显示，抑郁症目前已成为世界第四大疾患，到2020年 抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病。
[0003] 度罗西汀是礼来公司的主打产品，用于治疗成人抑郁障碍。度罗西汀是5-羟色胺 (5-HT)和去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂，能有效治疗抑郁症的情绪症状和躯体症状，弥 补了当前主流抗抑郁药在躯体疼痛症状治疗方面的不足。该药于2004年底在美国首先上 市，2006年全球销售额达到13. 16亿美元，比2005年增长了近1倍。同年，度罗西汀在美 国市场已超越所有抗抑郁药，成为市场增长份额最快的产品。2009年销售额为30. 75亿美 元，同比又增长了 14%。该药物目前由美国礼来公司（EliLilly)和德国勃林格殷格翰公司 (Boehringerlngelheim)联合在全球范围内营销，已在全球70多个国家上市，并于2007年 4月进入我国，商品名为"欣百达"。
[0004] 度罗西汀合成中的关键步骤是手性羟基中间体的构建。美国专利US5023269公 开了一种合成度罗西汀的方法，将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基）-1-丙酮盐酸盐用硼氢 化钠还原，然后通过重结晶来构建。CN101391991公开了 2-乙酰噻吩与多聚甲醛和二甲 胺盐酸盐发生Mannich反应制备3-二甲胺基-1-(2-噻吩基）-1-丙酮盐酸盐的方法。 CN103013898公开了N，N-二甲基-3-氧基-(2-噻吩）-1-丙胺盐酸盐在醇脱氢酶作用下转 化为（s) -N，N-二甲基-3-羟基-2- (2-噻吩）-1-丙胺的方法，其光学纯度可达到97. 5 %。CN103421854公开了 3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙酮在酮还原酶与葡萄糖脱氢酶 的组合作用下转化为（S)-3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇的方法。上述方法或 多或少存在反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵 的辅酶的缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的不对称还原制备（S)-3_二甲氨 基-1-噻吩基-1-丙醇反应中收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添 加了价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的醇脱 氢酶，以及使用该醇脱氢酶催化合成（S)-3-取代胺基-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇，进而进 一步合成度罗西汀的酶-化学合成方法。还提供了编码该醇脱氢酶的核酸序列，含有该核 酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该醇脱氢酶的制备方法，以及该醇脱氢酶在催 化羰基底物不对称还原中的用途。
[0006] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0007]本发明的第一方面提供了一种醇脱氢酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质：
[0008] (a)由SEQIDNo:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0009] SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有醇脱氢酶的功 能，是一种新的醇脱氢酶。
[0010] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
[0011] 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有醇脱氢酶活 性。也就是说，只要由（a)衍生的蛋白质具有醇脱氢酶活性，且衍生方式如上所述，都可以 达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQIDN〇:2所示氨基酸序列的蛋白质（a)分 子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持醇脱氢酶活性。
[0012] (c)与（a)的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有醇脱 氢酶活性的蛋白质。
[0013] SEQIDNo:2所示的醇脱氢酶和其他已知醇脱氢酶，如短小高加索乳杆菌醇脱氢 酶之间的同一性为76%。本发明的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的醇脱氢酶与已知醇脱 氢酶的氨基酸序列的同一性低于80 %，具有显著差异性。
[0014] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0015] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的醇脱氢酶。优选地， 所述核酸是由SEQIDNo: 1所示核苷酸序列组成的。
[0016] 由SEQIDNo: 1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境基因组DNA，其可以从环 境基因组中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得， 也可以全基因人工合成获得。
[0017] 本发明中，SEQIDNo:l所示的基因命名为BYK-CR，全长750bp。其中，其编码序 列（CDS)从第1个碱基起至第747个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序 列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo:2所示。
[0018] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQIDNo:2的氨基酸序列的 核酸序列不仅仅局限于SEQIDNo: 1。本发明的醇脱氢酶基因的核酸序列也可以是编码序 列表中SEQIDN〇:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替 换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过 对核酸序列SEQIDNo: 1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来 制得。
[0019] SEQIDNo: 1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号 序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有 负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全 替换，可提商目标蛋白的表达水平。
[0020] SEQIDNo: 1的同系物还指在标准条件下能够与SEQIDNo: 1所示序列的核酸 进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方 式进行：ColdSpringHarborLaboratoryPress，分子生物学中的通用方案（Current ProtocolsinMolecularBiology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇·lwt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC; 20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6XSSC+0.lwt%SDS溶液，更优选为5XSSC+0.lwt%SDS;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。 [0021 ] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码醇脱氢酶的核酸序列的重组 表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码醇脱氢酶或其突变体的核酸序列 连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的 质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳地，可通