NA回收试剂盒回收700~800bp区间的目标条带（见图1)，获得一条完整的基因序列， 经DNA测序，全长750bp。
[0051]PCR产物切胶回收后，用Ndel/Xhol酶切后连接到pET28a原核表达载体，并转化 到E.coliBL21 (DE3)感受态细菌，在含有卡那霉素（50μg/mL)的LB平板培养，挑选阳性 菌落（BYK-CR基因工程大肠杆菌）接种到100ml液体LB培养基中进行培养。过夜培养物 转入1L新鲜的LB液体培养基，培养到0D6。。达0. 6~0. 8,加入IPTG至终浓度为100μΜ诱 导重组蛋白表达，降温至30°C继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0. 2ΜρΗ7. 0的 磷酸钠缓冲液洗一次，lg菌体重悬于5mL上述磷酸盐缓冲液中，超声波破碎后，SDS-PAGE检 验表达水平，结果如图2。
[0052] 实施例3
[0053] 酶活测定：在2mL反应液中，加入2mMDKTP为底物，0.ImMNADH为辅因子，再加 入20μL粗酶液，测定2分钟内0D34。的降低速度为ΛΑ34。。酶活计算公式：ΛΑ34(]Χ1000/ (6220X20)，即每mL裂解液的比酶活力。
[0054] 实施例4
[0055] 高密度发酵：将按照实施例2获得的BYK-CR基因工程大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37°C，180~220rpm培养10~16h。将上述培养好的种子培养 液按10% (v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二 钠12. 8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵lg/L、硫酸钠0. 5g/L、氯化钙0. 0152g/L、六水氯化镁 0. 41g/L)中，在20~30°C，300~800rpm，空气流量2~6L/min的条件下培养。培养6~ 10h后，以5~20mL/h的速率流加含60%甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料 培养基数小时至〇D6。。达到20~40时，添加0. 1~ImMIPTG开始诱导。诱导10~20h后， 放罐，5000rpm离心收集菌体。
[0056] 实施例5
[0057] 100gDKTP底物（或其盐酸盐）溶于100mL异丙醇，加入50mM磷酸钠缓冲液至 700mL(用NaOH调pH7. 0)，加入全菌裂解液300mL，30°C搅拌反应24小时，TLC检测反应进 程。反应结束后调PH10. 0,等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到粗产物， 纯度95. 0~97. 0%，摩尔收率85~91%，ee值>99%。
[0058]TLC条件：二氯甲烷：甲醇：氨水=7:0. 55:2滴，碘缸显色。
[0059] HPLC条件：
[0060] HPLC : 15%乙臆+50mM Na3P04 (NaOH调ρΗ7· 0)，流速lmL/min，Agilent Zorbax SB C18柱（4. 6X250mm)，检测波长220和254nm ;HPLC :Shimada，15C ;进样20μL。
[0061]ee值测定：
[0062] Chiralpak AD-H柱，正己烧：乙醇（0· 1 % DEA) = 90:10,0· 8mL/min，220nm， Agilentl260〇
[0063] 实施例6~8
[0064] 基本按照实施例5的方法转化表1中的底物。
[0065]表1各种底物的转化
[0066]
[0067]
[0068] 实施例9
[0069] 100gDKTP底物（或其盐酸盐）溶于200mL水，用1M的NaOH调ρΗ6· 0,加入全菌 裂解液300mL，加入500mL水，加入葡萄糖70g和葡萄糖脱氢酶5000U，0. 5mMNAD+，30°C搅 拌反应16小时，1MNaOH控制反应pH在5. 8~6.0之间，TLC检测反应进程。反应结束 后调PH10. 0,等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到粗产物，纯度95. 0~ 97. 0%，摩尔收率 88 ~92%，e.e.值 >99%。
[0070] 实施例10~12
[0071 ] 基本按照实施例9的方法转化表2中的底物。
[0072] 表2各种底物的转化
[0073]
【主权项】
1. 一种醇脱氢酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质： (a) 由SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 醇脱氢酶活性的蛋白质； (c) 与（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性且具有醇脱氢酶活性的蛋白质。2. 编码权利要求1所述的醇脱氢酶的分离的核酸。3. 根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID No: 1所示核苷酸序列组成的。4. 包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET28a。7. 包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。8. 根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。9. 根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E. coli BL21(DE3)或E. coli DH5a。10. -种重组醇脱氢酶的制备方法，包括培养权利要求7-9任一项所述的重组表达转 化体，以及从培养物中获得重组醇脱氢酶。11. 一种催化羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性羟基化合物的催化剂，其 选自权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后 得到的转化体细胞或者用其加工的制品。12. 权利要求1所述的醇脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组醇脱氢酶，或权利 要求11所述的催化剂在催化羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性羟基化合物中 的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，所述的前手性羰基化合物选自以下化合物： 其中，X选自离去基团、-NR^ 各自独立地选自H、碳链长度为1~8的烷基、苄基或含 有1~8个碳原子的烷氧羰基。14. 根据权利要求13所述的应用，其中所述离去基团选自卤素、甲苯磺酸酯基、甲磺酰 基、醜氧基、苯乙醜氧基、烷氧基、（杂）芳氧基。15. 根据权利要求13所述的应用，其中X选自卤素、-N(CH3)2、-ΝΗΒη或-NHBoc。16. 根据权利要求15所述的应用，其中X选自Cl、-N(CH3)2、-NHBn或-NHBoc。17. 根据权利要求16所述的应用，其中X为-N(CH3)2。18. 根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述不对称还原反应在含有氢氧化 钠的pH5. 0~8. 0的异丙醇水溶液中进行，任选地，所述异丙醇溶液中还添加0~1. OmM的 WVDP+或麵、19. 根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述不对称还原反应在含有葡萄糖 脱氢酶、葡萄糖的PH5. 0~8. 0的水溶液中进行，任选地，所述水溶液中还添加0~1. OmM 的 NADP+ 或 NAD+。20. 根据权利要求19所述的应用，其中，葡萄糖的含量为5~200g/L，葡萄糖脱氢酶的 含量为0.01~lg/L。21. 根据权利要求18-20任一项所述的应用，其中，在反应液中前手性羰基化合物的浓 度为1~200g/L,醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的用量为0. 01~10g/L,反应在振荡或搅拌条 件下进行，反应温度为20~35°C。22. -种合成（S)-3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇的方法，包括使用权利要 求1所述的醇脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组醇脱氢酶，或权利要求11所述的 催化剂催化3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙酮进行不对称还原反应。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述不对称还原反应的反应液中含有100g/L的 3_ (二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙酮、0. 01~lg/L的葡萄糖脱氢酶、5~200g/L的葡 萄糖、0~1. Ommol/L的NADP+，反应pH为5. 5~7. 5,反应温度为20~35°C。24. -种合成度罗西汀的方法，包括使用权利要求22或23所述的方法合成手性羟基中 间体⑶-3-(二甲胺基）-1-(噻吩-2-基）-1-丙醇。
【专利摘要】本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的醇脱氢酶，以及使用该酶催化合成(S)-3-取代胺基-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇，进而进一步合成度罗西汀的酶-化学合成方法。还提供了编码该醇脱氢酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该醇脱氢酶的制备方法，以及该醇脱氢酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。使用本发明方法所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NADP+/NAD+，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。
【IPC分类】C12N9/04, C12N15/53, C12N15/70, C12P17/00, C12N1/21
【公开号】CN105274069
【申请号】CN201410317128
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 王海涛
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月7日