过下述方法制得本发明的 重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET28a分别用限制性内切 酶NdeI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的 编码醇脱氢酶的核酸序列的重组表达质粒pET28a-BYK-CR或含有编码其突变体的核酸序 列的重组表达质粒。
[0022] 本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。 可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规 的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基 因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E. coli)，更优选E. coli BL21(DE3)或E. coli DH5 α。将前述重组表达质粒pET28a-BYK-CR或其突变体转化至E. coli BL21 (DE3)中，即 可获得本发明优选的基因工程菌株，即E. coli BL21(DE3)/pET28a-BYK-CR或其突变体。转 化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等；较佳地选择热击法进行转化，热击条 件较佳的是：42°C，热击90秒。
[0023] 本发明的第五方面提供一种重组醇脱氢酶的制备方法，包括培养本发明所述的重 组表达转化体，以及从培养物中获得重组醇脱氢酶。
[0024] 其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化 至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使 转化体生长并表达本发明的醇脱氢酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基（蛋白 胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L，pH7. 0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根 据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体 生长并表达本发明的醇脱氢酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进 行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆菌（优 选E.coliBL21 (DE3)/pET21a-BYK-CR或其突变体）接种至含卡那霉素的LB培养基中培养， 当培养液的光密度〇D6。。达到0. 5~0. 7 (更佳地为0. 6)时，加入终浓度为0. 05~1.Ommol/ L(更佳地是0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)进行诱导，诱导温度 10~37°C(更佳地是25°C)，即可高效表达本发明所述重组醇脱氢酶。
[0025] 本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催 化剂，可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化 体细胞或者用其加工的制品。这里"加工的制品"是指由转化体得到的提取物、或通过对提 取物中的醇脱氢酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提 取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
[0026] 本发明的第六个方面提供了一种本发明的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶在催化前手 性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用。
[0027] 所述前手性羰基化合物较佳地为氨基芳香酮类化合物，最佳地为3-取代-1-噻吩 基-1-丙酮，即式I所示的化合物：
[0028]
[0029]其中，
[0030]X选自离去基团、-NR^ ;Ri、R2各自独立的选自H、碳链长度为1~8的烷基、苄基 或含有1~8个碳原子的烷氧羰基。
[0031 ] 在本发明中，离去基团可选自下列基团：卤素，如Cl、Br或I;甲苯磺酸酯基；甲磺 酰基；酰氧基，优选具有1~6个碳原子的酰氧基，特别是乙酰氧基；苯乙酰氧基；烷氧基， 优选具有1~6个碳原子的烷氧基；（杂）芳氧基，优选具有6~12个碳原子的（杂）芳 氧基。
[0032] 较佳地，
[0033] X为卤素、-N(CH3)2、-ΝΗΒη或-NHBoc。
[0034] 更佳地，
[0035] X为Cl、-N(CH3)2、-ΝΗΒη或-NHBoc。
[0036] 最佳地，X为-N(CH3) 2,即式I是3-(-甲胺基）_1_ (睡吩_2-基）丙丽（DKTP)。
[0037] 本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选 择，较佳地，所述应用包括下述步骤：在PH5. 0~8.0的水溶液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖 和NADP+/NAD+的存在下，在本发明所述的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的催化下，前手性羰基 化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。亦可在PH7. 0~8.5的水溶液中，在异 丙醇和NADP+/NAD+的存在下，在本发明所述的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的催化下，前手性 羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。
[0038] 其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为10~200g/L。本发明 的醇脱氢酶用量为催化有效量，较佳地为50~300mL/L。葡萄糖脱氢酶的用量较佳地为 0. 01~lg/L。葡萄糖的用量较佳地为5~150g/L。额外加入的NADP+/NAD+的用量较佳 地为0~1.Ommol/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5. 0~8. 0 即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0. 05~ 0.lmol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的 是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20~35°C，更佳地为 25°C。所述的不对称还原反应的时间较佳地以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间 为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。
[0039] 本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则 不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。
[0040] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0041] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0042] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、 反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种新的醇脱氢 酶及利用重组醇脱氢酶结合辅酶再生不对称还原的方法。在催化浓度高达200g/L的底物 时，产物的光学纯度仍高达99%以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还 原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NAD+，并且 具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具 有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0043] 图1醇脱氢酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0044] 图2醇脱氢酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。Μ为分子量标准，A泳道为诱导 前，B泳道为诱导后。
【具体实施方式】
[0045] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0046] E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5a感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限 责任公司。
[0047] 实施例1
[0048] 从上海市奉贤区四团镇朱家村采集土壤样本并提取DNA(提取方法参照Chroma SpinTE_1000，ClontechLaboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集 2 ~8kb 的片段，回收并连接到PUC19的BamHI位点，得到质粒文库。将文库转化到E.coliDH5α 并涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500μLLB(100μg/ mL氨苄青霉素）的96深孔孔板，37°C培养4小时后加ImMIPTG诱导，30°C继续培养过夜； 然后各取50μL深孔培养物到加有50mM磷酸钠缓冲液（pH7. 5)的新的96孔板，-80°C反复 冻融使细菌裂解；加入ImM度罗西汀底物DKTP、10mM葡萄糖、1单位葡萄糖脱氢酶、0. 002% (v/V)的酚红，30°C培养4小时，挑取变红最明显的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测 序。用NCBI的ORFFinder分析其开放读码框（0RF)，得到0RF核苷酸序列SEQIDN0:1， 并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQIDNO:2。
[0049] 实施例2
[0050] 合成引物对PI(核苷酸序列为SEQIDNO:3)和P2(核苷酸序列为SEQIDNO: 4)。 使用PI和P2克隆全长醇脱氢酶基因，PCR体系如下：10XK0D-PlusPCRbuffer2yL，25mM MgS04l. 2μL，2mMdNTP2μL，KOD-PlusPCR高保真酶 0· 3μL，DNA模板 0· 5μL(含DNA模 板 〇·lug),ddH2013yL，PI和P2 各 0.5yL(10mmol/L)。PCR扩增步骤为：（1)95°C，预变 性3min;(2)98°C，变性15s;(3)58°C退火30s;⑷72°C延伸lmin;步骤⑵~⑷重复30 次；（5) 72°C继续延伸10min，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝 胶D