用于木材加工的漆酶的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种用于木材加工的漆酶，属于生物发酵工程技术领域。
【背景技术】
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[0002]木质素酶是指能分解木质素的一类酶的总称，漆酶是木质素酶中非常重要的一种，主要用于制浆造纸、酒精制备、粘胶纤维制备中的木质素脱除和环境治理中的废弃物和有害物质的治理。木质素是自然界中仅次于纤维素的第二大生物质材料，在细胞壁中起着支撑细胞力学性能的作用，但在制浆造纸、酒精制备、粘胶纤维制备中，为了脱除木质素留下有用的纤维素和半纤维素，多采用物理化学的方法将之除去。生物酶是一种能够温和、无污染的将木质素有效去除方法，在利用生物酶将木质素去除的过程中不会对纤维素、半纤维素等化学物质造成任何损害。但木质材料不仅具有自己特殊的化学成分，均能对生物酶产生抑制作用，还有自己特有的酸碱环境，也会对生物酶产生不利影响。内生菌是一种完全适应植物内部酸碱环境和化学成分的一类特殊的微生物，其在漫长的进化过程中与其宿主植物协同进化，所以从植物内生菌中筛选出可以适应植物内部环境，应用于木材加工的高效漆酶。
[0003]本发明提供的用于木材加工的漆酶，经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的在于克服现有技术之不足，而是提供一种完全适应植物内部环境、用于木材加工的漆酶。
[0005]本发明的用于木材加工的漆酶，如下步骤得到:
[0006]a.出发菌株:甲基营养型芽抱杆菌 HS047 (Bacillus methylotrophicus HS047)，保藏编号CCTCC Ν0:Μ 2015032 ;保藏时间:2015年1月11日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国、武汉、武汉大学。
[0007]b.种子菌体培养
[0008]种子培养基组成:以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，KC1 0.3g，NaN03 0.2g，CaS04 0.5g，MgC03 0.lg,用蒸馈水配至 1000ml，用灭菌锅在121°C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121°C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中；
[0009]种子菌体培养:待种子培养基冷却，将经紫外光照射60min或不经紫外光照射的菌株用竹签接种于培养皿的种子培养基上，25-30°C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养；
[0010]C.发酵培养
[0011]发酵培养基的组成，以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g，麦芽粉3g，NaCl0.5g，CaS04 0.l，GeS04 0.1-0.5g用蒸馈水配至1000ml ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将b步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种1板至发酵培养基中，在摇床温度25-30°C、转速180 r/min，发酵24h得到漆酶的粗酶液；将漆酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用分光光度计法进行漆酶酶活的测试；
[0012]本发明的用于木材加工的漆酶，其漆酶的性能参数为:最适使用温度为55°C、最适pH值为4.5-6.5、当储存温度彡4°C，储存时间为24-96h ;当储存温度为37°C或60°C或室温时，储存时间为48h。
[0013]本发明的优点在于:
[0014]1、利用完全适应植物内部环境的内生菌为出发菌株，制备出在pH值4.5-6.5环境能够充分发挥漆酶活性的漆酶溶液，对于实现、促进木质材料的生物加工奠定基础。
[0015]2、能高效用于木材加工的漆酶，对于实现生物制浆、绿色纤维分离和生物纺织均具有一定的推动和促进作用。
【具体实施方式】
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[0016]实施例1:
[0017]本发明的一种用于木材加工的漆酶，经如下步骤得到:
[0018]a.出发菌株:甲基营养型芽抱杆菌 HS047 (Bacillus methylotrophicus HS047)，保藏编号CCTCC Ν0:Μ 2015032 ;保藏时间:2015年1月11日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国、武汉、武汉大学。
[0019]b.种子菌体培养
[0020]种子培养基组成:以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，KC1 0.3g，NaN03 0.2g，CaS04 0.5g，MgC03 0.lg,用蒸馈水配至 1000ml，用灭菌锅在121 °C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121 °C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中；
[0021]种子菌体培养:待种子培养基冷却，将菌体用竹签接种于培养皿的种子培养基上，在30 °C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养；
[0022]c.发酵培养
[0023]发酵培养基的组成，以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g，麦芽粉3g，NaCl0.05g，CaS04 0.1，GeS04 0.lg用蒸馈水配至1000ml ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将b步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种1板至发酵培养基中，在摇床温度25°C、转速180r/min，发酵24h得到漆酶的粗酶液；将漆酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为17.63±0.4。
[0024]实施例2:
[0025]基本同实施例1。不同之处为:菌株经过了 60min的紫外光照射，发酵液中添加GeS04 0.25go利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为28.73±0.6o
[0026]实施例3:
[0027]基本同实施例1。不同之处为:发酵液中添加GeS04 0.35g。利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为20.19±0.7。
[0028]实施例4:
[0029]基本同实施例1。不同之处为:菌株经过60min紫外光照射，发酵液中添加GeS040.40go利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为180.09±0.9。
[0030]实施例5:
[0031]基本同实施例1。不同之处为:菌株经过60min紫外光照射，发酵液中添加CaS040.45go利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为219.03±1.2。
[0032]实施例6:
[0033]基本同实施例1。不同之处为:菌株经过60min紫外光照射，添GeS04 0.50g。利用常规分光光度计法进行漆酶酶活的测试，漆酶酶活(u/ml)为196.09±1.1。
[0034]发明人将上述实施例得到的漆酶，用常规分光光度计法在不同温度、不同pH值、不同储存温度下测试漆酶的酶活，得到漆酶的性能参数为:最适使用温度为55°C、最适pH值为4.5-6.5、在温度4°C或以下温度储存，储存时间为24-96h ;在37°C、60°C或常温等条件下储存时，储存时间不能超过48h。
【主权项】
1.用于木材加工的漆酶，其特征在于该漆酶经如下步骤得到: a.出发菌株:甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)HS047，保藏编号CCTCC Μ 2015032 ； b.种子菌体培养 种子培养基组成:以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，KC10.3g, NaN030.2g, CaS040.5g，MgC030.lg,用蒸馈水配至 1000ml，用灭菌锅在 121°C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121°C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中； 种子菌体培养:待种子培养基凝固冷却至20-25°C，将菌体用竹签接种于培养皿的种子培养基上，在25-30°C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养； c.发酵培养 发酵培养基的组成，以g/1000ml计，愈创木酚5g，酵母粉5g,麦芽粉3g, NaCl 0.5g，CaS040.lg, GeS040.1-0.5g，用蒸馈水配至1000ml ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将b步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种1板至发酵培养基中，在摇床温度25°C、转速180r/min，发酵24h得到漆酶的粗酶液；将漆酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用分光光度计法进行漆酶酶活的测试。2.权利要求1所述的用于木材加工的漆酶，其特征在于该漆酶的性能参数为:最适使用温度为55°C、最适pH值为4.5-6.5、当储存温度彡4°C，储存时间为24_96h ;当储存温度为37°C或60 °C或室温时，储存时间为48h。
【专利摘要】本发明涉及一种用于木材加工的漆酶，属于生物发酵工程技术领域。本发明利用保藏编号CCTCC？M？2015032的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)HS047，通过种子菌体培养、发酵培养得到用于木材加工的漆酶。本发明的优点在于：1、利用完全适应植物内部环境的内生菌为出发菌株，制备出在pH值4.5-6.5环境能够充分发挥漆酶活性的漆酶溶液，对于实现、促进木质材料的生物加工奠定基础；2、能高效用于木材加工的漆酶，对于推动漆酶在木材加工、制浆造纸中的应用均具有一定的推动和促进作用。CCTCCNO: M 201503220150111
【IPC分类】C12N9/02, C12R1/07
【公开号】CN105274067
【申请号】CN201510793743
【发明人】李晓平, 吴章康, 杜官本, 吴宁
【申请人】西南林业大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月18日