杂交瘤细胞株及其产生单克隆抗体和它们在检测g2-epsps蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业生物技术领域，具体地，设及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体 对和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的用途W及一种免疫胶体金试纸。
【背景技术】
[0002] 草甘麟是美国孟山都公司研发并于1974年注册的一个新型除草剂，注册的商品 名为Rouiidup饭。草甘麟的理化性质稳定，合成成本低，高效、广谱、低毒、低残留，是一型 十分优秀的除草剂，也是世界上使用最广泛的除草剂品种之一。研究发现，草甘麟通过竞争 性结合EPSPS(5'-締醇式丙酬芒草酷-3-憐酸合酶）从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物 无法合成芳香族氨基酸及其衍生物，W及莽草酸积累，导致植物死亡。由于自然界中绝大部 分植物体内EPSP合酶均属于草甘麟敏感型，因此草甘麟除草剂具有十分优秀的广谱性。但 是自然界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多样性，部分微生物体内EPSP合 酶对草甘麟不敏感，利用基因工程技术将草甘麟不敏感EPSP合酶转入目标植物中W替代 内源敏感型EPSP合酶，将使该植物获得草甘麟除草剂抗性。美国孟山都公司利用运一策略 于1989年从根癌农杆菌CP4中克隆到了高抗草甘麟的EPSP合酶，并将该基因转入大豆品 种中，于1991年获得抗草甘麟转基因大豆品种Roun化PReady,并1996年正式进入商品化 生产。
[0003] 抗草甘麟除草剂转基因大豆是世界上第一例商业化种植的转基因作物，随后孟 山都公司利用该基因先后研发了多种转基因抗草甘麟作物（大豆、棉花、玉米、首猜、甘薦 等）。自1996年上市W来，在全世界转基因作物品种及种植面积迅猛增加，从171万公顷增 加到2014年的1. 815亿公顷。全球种植转CP4-EPSPS作物累计超过1亿公顷。
[0004]G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自草甘麟污染±壤细菌基因组文库，具有很高的草 甘麟耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于ClassI类型，酶活测定显示该蛋白具有高底 物亲和能力和低草甘麟亲和力，因此能赋予宿主高草甘麟除草剂耐受力。在酶学水平上 G2-EPSPS基因草甘麟耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。
[0005] 在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测装置，如采用酶免、放免等方法的 装置，受仪器（酶标仪、放免闪烁仪、离屯、机等）、场地等因素的限制，而且检测时间长（酶免 检测时间需化、放免检测需化左右），检测成本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有 一种可快速检测转基因植物中G2-EPSPS蛋白，且操作简便、结果准确可靠、快速的装置。
[0006] 免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种 应用形式，相比ELISA，除标记物不同外，同样服从于抗原抗体反应的特性。免疫结合胶体金 层析法W微孔膜为固相载体，包括双抗体夹屯、法、双抗原夹屯、法、捕获法和竟争抑制法等实 施方法，其中，W双抗体夹屯、法应用最为广泛。
[0007] 双抗体夹屯、法主要用于检测有多个抗原位点的生物分子。双抗体夹屯、法的技术方 案包括：首先将已知的特异性抗体（单抗或多抗）W-定的量包被于膜上作为检测带，可 与金标物结合的二抗作为质控带。与包被抗体相配对的另一单抗金标结合物则吸附于金标 垫上并进行干燥。干燥的金标垫一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水 垫。检测时，于样品垫加入一定量的液体样本，借助毛细管作用，样本沿样品垫到吸水垫的 方向移动。它首先经过干燥金标垫，使金标结合物复溶，如标本中有待测抗原，则发生抗原 抗体反应，形成复合物A(金颗粒一抗体一抗原）；样本继续移动到达检测带位置，则与包被 抗体再次发生抗原抗体反应，形成复合物B(金颗粒一抗体一抗原一包被抗体），并于检测 带的部位聚集，最终达到肉眼可见的程度，如样本中无待检抗原，则不能形成肉眼可见的红 色条带。游离的金标结合物或复合物A越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，形成复合 物C(金颗粒一抗体一二抗），聚集并产生肉眼可见的红色条带。无论样本中是否含有待检 物质，质控带都会呈现红色条带。
[0008] 免疫结合胶体金层析法具有操作简单、快速、可单份检验、不需要特殊设备的优 点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不 同试剂间变异系数过大等缺陷。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫 结合胶体金层析法缺陷的重要手段。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种灵敏特异的免疫结合胶体金层析法检测G2-EPSPS蛋白 的方法。
[0010] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细 胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保 藏编号为CGMCCNO. 10495 ;所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO. 10494。
[0011] 再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的 第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述 第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO. 10495 ;所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO. 10494。
[0012] 再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测G2-EPSPS蛋白中的 用途。
[0013] 再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相 连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有抗 鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单 克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克 隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。
[0014] 通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对G2-EPSPS蛋白的检测取 得Ing/mL的灵敏度，对CP4-EPSPS蛋白不呈现交叉反应，并且对27种非转基因作物和14种 不同来源的各种非G2-EPSPS转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。
[0015] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
[0016] 生物材料保藏
[0017] 本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号 为CGMCCNO. 10495,保藏日期为2015年04月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所，分类命名为抗G2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0018] 本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号 为CGMCCNO. 10494,保藏日期为2015年04月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所，分类命名为抗G2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
【附图说明】
[0019] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0020] 图1是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量检测的结 果图。
[0021]图2是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对27种非转基因作物和14 种不同来源的各种转基因作物（表10)做了特异性检测实验的结果图。
[0022] 图3是免疫胶体金试纸的组装结构示意图。
[0023] 附图标记说明
[0024] 1样品垫 2被衬底板 3胶体金垫
[00巧]4T线 5C线 6纤维素膜
[0026] 7吸收垫
【具体实施方式】
[0027]W下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0028] -方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独