一种木聚糖酶的固定化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶的固定化方法，尤其涉及一种木聚糖酶的固定化方法。
【背景技术】
[0002]木聚糖酶是一类降解木聚糖分子的复杂酶系，组成比较复杂，是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，通过水解木糖分子β -1, 4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖和木二糖等低木聚糖以及少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶包括内切β_1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、a-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等。木聚糖酶在自然界中分布相当广泛，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌等中存在，已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉和青霉等，目前使用的木聚糖酶主要是利用米曲酶、黑曲酶、芽孢杆菌和酵母菌等发酵后，经提取、浓缩等工艺加工而成。但是游离的木聚糖酶稳定性差，保质期短，重复利用率低，应用成本高，因此木聚糖酶的广泛应用受到限制。
[0003]酶的固定化是通过物理或者化学的方法，将酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以反复使用。固定化酶具有较高的酶活性、稳定性高，可反复使用，耐一定强度的酸、碱、热及有机溶剂。作为固定化酶的一部分，固定化酶的载体材料对固定化酶的各种性能都有着巨大的影响，壳聚糖因其分子中存在丰富的羟基和氨基使其易于进行化学反应而赋予独特性能，特别是丰富的氨基与各种蛋白质的亲和力非常高，是一种良好的酶固定化载体，并且不存在残存单体，使得其作为载体较其他高聚物有更大的优越性，但是现有技术中以壳聚糖为载体并配合交联剂及选择合适的固定化酶制备工艺，虽然固定化木聚糖酶的转化率、活力回收率均有所提高，但是固定化酶的力学性能、稳定性差，并且现有技术中没有涉及细菌纤维素/壳聚糖复合微球为载体来实现酶的固定化的技术。
【发明内容】
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[0004]针对上述现有技术中的存在的问题，本发明提供一种新型复合固定化酶载体，以细菌纤维素/壳聚糖复合微球为载体，通过交联剂交联木聚糖酶与细菌纤维素/壳聚糖复合微球，增强复合凝胶的机械强度、亲水性和稳定性。
[0005]为达到上述目的，本发明通过如下技术方案来实现:
[0006]—种木聚糖酶的固定化方法，以细菌纤维素/壳聚糖复合微球为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化木聚糖酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养、细菌纤维素的制备、细菌纤维素的打浆和细菌纤维素/壳聚糖复合微球的制备。
[0007]进一步，固定化载体的制备通过以下步骤实现:
[0008](I)种子培养:取活化的木醋杆菌CGMCC N0.1.1812斜面种子，接入在HS培养基中，在30°C下，转速为160r/min，振荡培养24h ；
[0009](2)细菌纤维素的制备:细菌纤维素为膜式细菌纤维素或絮状细菌纤维素，当细菌纤维素为膜式细菌纤维素，则制备方法为:以2?10%的接种量接入HS发酵培养基中，30°C下培养2?6d，形成细菌纤维素凝胶，用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸处理6h，用蒸馏水清洗至细菌纤维素凝胶的PH为7.0，将该细菌纤维素凝胶在105°C下干燥至恒重，得到细菌纤维素干膜；当细菌纤维素为絮状细菌纤维素，则制备方法为:以2?10%的接种量接入HS发酵培养基中，30°C下培养2?6d，形成细菌纤维素凝胶；
[0010](3)细菌纤维素的打浆:当细菌纤维素为膜式细菌纤维素时，将步骤(2)中制备得到的细菌纤维素干膜与4%醋酸溶液置于打浆机中，细菌纤维素干膜的质量与4%醋酸溶液的体积之比为1:40，转速为300?1000r/min，时间5?15min，形成混悬液；当细菌纤维素为絮状细菌纤维素时，将步骤(2)中制备得到的细菌纤维素凝胶浸泡于0.lmol/1的NaOH溶液中，100°C煮沸6h，用蒸馏水或0.1M的醋酸溶液冲洗，至pH值为7.0，将细菌纤维素凝胶与4%醋酸溶液置于打浆机中，其中细菌纤维素湿重与4%醋酸溶液的体积之比为1:4，转速为300?1000r/min，时间5?15min，形成混悬液；
[0011](4)细菌纤维素/壳聚糖复合微球的制备:称取2?4g壳聚糖，加入步骤⑶中制备得到的细菌纤维素混悬液25?100ml，充分溶解得壳聚糖-细菌纤维素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反应Ih以上，用PH值为6.0的Tris-HCl缓冲液洗涤，离心，真空干燥，备用。
[0012]进一步，固定化木聚糖酶的制备通过以下步骤实现:
[0013](I)称取细菌纤维素/壳聚糖复合微球I?2g，加入0.5%戊二醛10?20ml，缓慢搅拌30分钟，室温下静置12小时，离心去上清液，用pH值为6.0的Tris-HCl缓冲液洗去多余的戊二醛，留沉淀，离心、真空干燥，得含交联醛基的细菌纤维素/壳聚糖复合微球；
[0014](2)称取步骤⑴中得到的含交联醛基的细菌纤维素/壳聚糖复合微球I?2g，加入10?20ml木聚糖酶溶液，搅拌均匀，4°C下交联反应12小时，离心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。
[0015]进一步，固定化载体的制备方法中步骤(4)细菌纤维素/壳聚糖复合微球的制备方法为:称取2?3g壳聚糖，加入步骤(3)中制备得到的细菌纤维素混悬液25?50ml，充分溶解得壳聚糖-细菌纤维素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反应6h，用PH值为6.0的Tris-HCl缓冲液洗涤，离心，真空干燥，备用。
[0016]进一步，固定化载体的制备方法中步骤(4)细菌纤维素/壳聚糖复合微球的制备方法为:称取2g壳聚糖，加入步骤(3)中制备得到的细菌纤维素混悬液25ml，充分溶解得壳聚糖-细菌纤维素混合液，用注射器吸取混合液滴入4mol/L NaOH溶液中，充分反应6h，用PH值为6.0的Tris-HCl缓冲液洗涤，离心，真空干燥，备用。
[0017]进一步，固定化木聚糖酶的制备方法中:步骤(2):称取步骤(I)中制备得到的含交联醛基的细菌纤维素/壳聚糖复合微球1.5?2g，加入15?20ml木聚糖酶溶液，搅拌均匀，4°C下交联反应12小时，离心，沉淀，真空干燥，得固定化木聚糖酶。
[0018]进一步，固定化木聚糖酶的制备方法步骤(2)中木聚糖酶的浓度为0.25?2.0mg/ml ο
[0019]本发明还提供一种固定化木聚糖酶，是以细菌纤维素/壳聚糖复合微球为固定化载体，该固定化木聚糖酶是用上述木聚糖酶的固定化方法制备得到。
[0020]本发明的有益效果:
[0021](I)细菌纤维素/壳聚糖微球的制备过程中，不需要采用特殊的添加方法，直接将打浆后的细菌纤维素添加至壳聚糖中，从而提高固定化酶的亲水性、稳定性和机械强度。
[0022](2)木聚糖酶经细菌纤维素/壳聚糖微球固定化后，其活力回收率达75.3%，相对酶活力达到80.5%，该固定化酶连续使用5次后，酶活力保持83.6%，具有较好的稳定性，该固定化酶具有较高的应用价值。
【具体实施方式】
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[0023]下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明。
[0024]实施例1
[0025]本实施例的一种木聚糖酶的固定化方法，以细菌纤维素/壳聚糖复合微球为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化木聚糖酶的制备，步骤如下:
[0026](I)固定化载体的制备:
[0027]a.种子培养:将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的木醋杆菌CGMCCN0.1.1812斜面种子接入装有10ml HS种子培养液中，在30°C下转速为160rpm下振荡培养24h，得到种子培养液；
[0028]b.细菌纤维素的制备:以2% (v/v)的接种量接入装有HS发酵培养基的锥形瓶中，30°C下在培养箱中静置培养6d，形成细菌纤维素凝胶；
[0029]c.细菌纤维素的打浆:取步骤b中制备的细菌纤维素凝胶浸泡于0.lmol/1的NaOH溶液中，100°C煮沸6h，用蒸馏水冲洗，至pH值为7.0，将细菌纤维素凝胶与4%醋酸溶液置于打浆机中，其中细菌纤维素湿重与4%醋酸溶液的体积之比为1:4，置于打浆机中，转速为300r/min，处理时间为15min，得到细菌纤维素混悬液；
[0030]d.细菌纤维素/壳聚糖微球的制备:称取壳聚糖2g，加入步骤c制备的细菌纤维素混悬液50ml，用玻璃棒搅拌混合均匀，制备得到壳聚糖-