一种β-半乳糖苷酶的固定化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶的固定化方法，尤其涉及一种β -半乳糖苷酶的固定化方法。
【背景技术】
[0002]β -半乳糖苷酶，全名为β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称为乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，β -半乳糖苷酶由β -半乳糖苷酶基因编码，由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。
[0003]半乳糖苷酶的来源丰富，主要有细菌、霉菌、酵母等微生物，植物尤其是杏、扁桃和苹果，哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。其中微生物发酵制取半乳糖苷酶的生产成本低、产量高，周期短，所制取的酶源丰富，并且不受季节、地理位置的限制，在工业上得到广泛应用。
[0004]游离的β -半乳糖苷酶的制备方法简单，但是生产成本较高，对耐酸碱稳定性较低，从而半乳糖苷酶的应用受到限制。酶的固定化是通过物理或者化学的方法，将酶固定在载体上，形成固定化酶，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以反复使用。固定化酶具有较高的酶活性、稳定性高，可反复使用，耐一定强度的酸、碱、热及有机溶剂。固定化β-半乳糖苷酶也有明显的优势，人们对β-半乳糖苷酶的固定化技术的研究做了大量的工作。
[0005]现有技术中，β -半乳糖苷酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、载体结合法和胶联法，常用的是单一方法或者两种或两种以上的方法结合使用，目前已报道的半乳糖苷酶固定化技术有纤维素包埋法，卡拉胶包埋法，聚丙烯酰胺包埋法；以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，以明胶为载体、戊二醛为交联剂，以阳离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂相结合的方法；以凹凸棒吸附与壳聚糖包埋耦合的方法；海藻酸钠和卡拉胶相结合的方法。但是固定化载体的机械强度低，容易破碎或脱落，酶与载体的结合强度低。并且现有技术中没有涉及以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体制取固定化β-半乳糖苷酶的方法。
【发明内容】
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[0006]本发明提供一种β -半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，通过交联剂交联β -半乳糖苷酶与细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶，增强复合凝胶的机械强度、亲水性和稳定性。
[0007]为达到上述目的，本发明通过如下技术方案来实现:
[0008]—种β -半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。
[0009]进一步，固定化载体的制备通过以下步骤实现:
[0010](I)种子培养:取活化的木醋杆菌CGMCC N0.1.1812斜面种子，接入在HS培养基中，在 30°C下，160r/min，培养 24h ；
[0011](2)细菌纤维素凝胶的制备:以2-10%的接种量接入装有HS培养基的发酵容器中，30°C下培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶。
[0012](3)细菌纤维素凝胶的处理、打浆:细菌纤维素凝胶用水冲洗，再将其浸泡于
0.lmol/1的碱液中，100°C煮沸20min，再用蒸馏水或0.lmol/1的醋酸溶液冲洗，直至pH值为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与磷酸盐缓冲液以质量/体积之比为1:1的比例置于打浆机中，转速为300-1000r/min，时间为5_15min，形成细菌纤维素乳池液；
[0013](4)细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备:将海藻酸钠和细菌纤维素乳浊液以质量/体积之比为1:14的比例进行混合，水浴加热，边加热边搅拌，至海藻酸钠完全溶解，室温至冷却。
[0014]进一步，固定化β -半乳糖苷酶的制备方法为:量取细菌纤维素/海藻酸钠混合液20-30ml，与20-30ml的β -半乳糖苷酶均匀混合，然后用注射器吸取混合液滴入氯化钙溶液中，充分反应2-6h，洗涤、离心、真空干燥得固定化β -半乳糖苷酶。
[0015]进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)中，培养方式为静置培养或振荡培养。
[0016]进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)中，培养方式为静置培养时，培养方法为:以2-10%的接种量接入装有HS培养基的浅层发酵容器中，装液面高度为l-2cm，30°C下静置培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶；培养方式为振荡培养时，培养方法为:以2-10%的接种量接入装有HS培养基的发酵罐中，装液量为60-70 %，30 °C下振荡培养2-6d，转速为80-160rpm，形成细菌纤维素凝胶。
[0017]进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)培养方式为静置培养时，浅层发酵容器为托盘、锥形瓶或烧杯。
[0018]进一步，固定化载体的制备方法步骤⑶中，碱液为NaOH、KOH、Na2COjP K 20)3中任意一种，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/l、PH为5.0-8.0。
[0019]进一步，固定化载体的制备方法步骤(3)中磷酸盐缓冲液的浓度为0.lmol/1, PH为 6.0。
[0020]进一步，固定化半乳糖苷酶的制备方法中半乳糖苷酶的浓度为
0.25-2.0mg/ml，氯化钙的浓度为 55.3g/L。
[0021]本发明还提供一种固定化β -半乳糖苷酶，是以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，该固定化酶通过上述β-半乳糖苷酶的固定化方法制备得到。
[0022]本发明的有益效果:
[0023](I)在固定化载体细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶的制备过程中，直接将打浆后的细菌纤维素添加至海藻酸钠中，提高了固定化载体的亲水性、稳定性和机械强度。
[0024](2)采用本发明载体及制备方法制备得到的固定化β -半乳糖苷酶活力回收率达到70-78%，最适pH偏碱性，为pH = 7.0-7.5，热稳定性提高，最适温度升高为40_45°C，米氏常数为10.5mmol/L0
【具体实施方式】
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[0025]下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明。
[0026]实施例1
[0027]本实施例的一种β -半乳糖苷酶的固定化方法，包括固定化载体细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶的制备和固定化半乳糖苷酶的制备，步骤如下:
[0028](I)固定化载体的制备:
[0029]a.种子培养:将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的木醋杆菌CGMCCN0.1.1812斜面种子，接入装有10ml HS种子培养液中，在30°C下，160r/min，培养24h ；
[0030]b.细菌纤维素凝胶的制备:
[0031]以10% (v/v)接种量接入装有HS发酵培养基的医用托盘，医用托盘的规格为38 X 50cm，其发酵液厚度为1cm，30 °C下在恒温恒湿培养箱中静置培养6天；
[0032]c.细菌纤维素凝胶的处理、打浆:
[0033]将细菌纤维素凝胶用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸处理6h后，用0.lmol/1的醋酸溶液清洗至细菌纤维素凝胶的PH为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与浓度为0.0lmol/Ι,ΡΗ为5的磷酸盐缓冲液以质量/体积之比为1:1的比例置于打浆机中，置于搅拌机以300rpm的转速打浆时间为15分钟，形成乳浊液；
[0034]d.细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备:
[0035]将海藻酸钠和步骤c制备的细菌纤维素乳浊液以质量/体积之比为1:14的比例进行混合，水浴加热，边加热边搅拌，至海藻酸钠完全溶解，室温至冷却；
[0036](2)固定化β -半乳糖苷酶的制备:
[0037]用浓度为0.01mol/l、PH值为8.0的磷酸盐缓冲液溶解β -半乳糖苷酶，制备得到
0.25mg/ml的β -半乳糖苷酶溶液，取20ml的β -半乳糖苷酶溶液，加入到步骤⑴中制备得到的细菌纤维素/海藻酸钠混合液30ml中，充分搅拌，混合均匀，然后用1ml的注射器吸取混合液，垂直滴入浓度为55.3g/l的氯化钙溶液中，充分反应2小时，反应结束后，用纱布过滤，采用浓度为0.01mol/l、PH为5.0的磷酸盐缓冲液清洗，离心、真空干燥，得细菌纤维素/海藻酸钙复合凝胶固定化β-半乳糖苷酶；
[0038](3)对步骤⑵中制备得到的细菌纤维素/海藻酸钙复合凝胶固定化β -半乳糖苷酶的活力回收率