一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，属于生物技术领域。 技术背景
[0002] 革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约20~80皿。肤聚糖含量丰富，有15~50层，每层厚 度Inm,约占细胞干重的50~80%。此外，尚有大量特殊组份憐壁酸。憐壁酸是由核糖醇或 甘油残基经由憐酸二键互相连接而成的多聚物。憐壁酸分壁憐壁酸和膜憐壁酸两种，前者 和细胞壁中肤聚糖的n-乙酷胞壁酸连结，膜憐壁酸又称脂憐壁酸和细胞膜连结，另一端均 游离于细胞壁外。憐壁酸抗原性很强，是革兰氏阳性菌的重要表面抗原；在调节离子通过粘 肤层中起作用；也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的憐壁酸，能粘附在人类细胞表面， 其作用类似菌毛，可能与致病性有关。
[0003] 现在，人们开始对革兰氏阳性菌进行快速检测技术的研究W及各种生物学特征的 研究，目前研究主要集中在毒力调控机制、超抗原作用机制、耐药性、菌膜形成与感染等方 面，然而运些研究的基础是进行基因组DNA的提取。因为革兰氏阳性菌其细胞壁较厚，基因 组DNA提取难度较大。费时较长。
[0004] 因此需要研制一种适用于革兰氏阳性菌基因组DNA提取的方便、快捷、实用的方 法，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。此外，有效的提取革兰氏阳性 菌基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研究内 容。
【发明内容】
： 本发明提供一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，与传统方法相比，利用该方法能 够快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA。
[0006] 一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，包括革兰氏阳性菌细胞的破碎，DNA的游 离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNAW及杂质的去除，DNA洗脱，具体步骤如下： 革兰氏阳性菌细胞的破碎：取3ml革兰氏阳性菌过夜培养液分3次加到1. 5ml离屯、管 中，每次10000-13000巧m/min离屯、I-Smin后弃上清。往菌体沉淀中加入0. 2-0. 5mld地2〇 悬浮沉淀，并加入 50-80BufferA溶液，40°C保溫 10-50min。加入 30-60 BufferB， 5-10yIBufferC混匀，37°C保溫 30-60min。加入 0. 4-0. 6mlBufferD混匀。
[0007]DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600yIBufferE抽提，10000-13000巧m/ min离屯、10-30min，将上清转移至1.5ml离屯、管中。加入200-600JilBufferF抽提， 10000-13000;rpm/min离屯、l〇-30min，将上清转移至1. 5ml离屯、管中。
[000引DNA吸附柱吸附DNAW及杂质的去除：往离屯、管中加入与上清等体积的沉淀剂，混 匀后加入DNA吸附柱，10000-13000巧m/min离屯、l-5min，弃废液，加入200-600y1去蛋白 液，10000-13000巧m/min离屯、l-5min，弃废液，加入 200-600y1 漂洗液，10000-13000巧m/ min离屯、l-5min，弃废液，加入 200-600Ji1 漂洗液，10000-13000;rpm/min离屯、l-5min，弃废 液，10000-13000;rpm/min离屯、l-5min，静置吹干。
[0009]DNA洗脱：往吸附柱中加入10-50y1洗脱液，10000-13000巧m/min离屯、l-5min， 所得液体为革兰氏阳性菌基因组DM。取2-7ylDNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检 测。
[0010] 试剂的配方如下： 所述的DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
[0011] 所述的BufferA:溶菌酶（l〇-50mg/ml)。
[0012] 所述的Buffer6:10-20%质量体积比的十二烷基硫酸钢（SDS)。
[0013]所述的BufferC:蛋白酶K(2〇-50mg/ml)。
[0014]所述的BufferD:4-6mol/L氯化钢（化化）。
[0015] 所述的BufferE:酪：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0016] 所述的BufferF:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0017] 所述的沉淀剂：70-80%乙醇。
[001引所述的去蛋白液：3-6M盐酸脈，10-30mMS径甲基氨基甲烧灯ris)，抑= 6. 0-7. 0,用前加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为30-40%。
[0019]所述的洗脱液：10-20mMS径甲基氨基甲烧灯ris)，pH= 8. 0-9. 0 本发明的显著优点： 常规的革兰氏阳性菌基因组的试剂盒提取步骤较为繁琐，耗时较长，提取时间一般需 要1化左右，一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒与常规的革兰氏阳性菌基因组DNA提 取方法相比仅需要化左右即可提取到革兰氏阳性菌基因组DNA，不仅节省了大量提取时 间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阳性菌基因组DNA。
【附图说明】
[0020] 图1为利用本方法提取的革兰氏阳性菌基因组DNA的电泳检测图。 具体实施例
[0021] 图1中，泳道1为利用本方法提取葡萄球菌基因组DNA的试验结果图，泳道2为利 用本方法提取链球菌基因组DNA的试验结果图，泳道3为利用本方法提取放线菌基因组DNA 的试验结果图。泳道4是TAKARA公司的化4500marker。从图中可看出本发明可队陕速提 取革兰氏阳性菌基因组DNA。
[0022] 一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，具体步骤如下： (1)革兰氏阳性菌细胞的破碎：分别取3ml葡萄球菌、链球菌、放线菌过夜培养液分3 次加到1.5ml离屯、管中，设置3管重复，每次120(K)巧m/min离屯、Imin后弃上清。往菌体 沉淀中加入0. 25ml(1地2〇悬浮沉淀，并加入75y1BufferA溶液，40 °C保溫30min。加入 SOulBufferB，5JilBufferC混匀，37°C保溫 30min。加入 0.45mlBufferD混匀。 [002引 似DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入500y1BufferE抽提，12000巧m/min离屯、 lOmin，将上清转移至干净的1. 5ml离屯、管中。加入500Ji1BufferF抽提，12000;rpm/min 离屯、lOmin，将上清转移至干净的1. 5ml离屯、管中。
[0024](3)DNA吸附柱吸附DNAW及杂质的去除：往离屯、管中加入与上清等体积的沉 淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，12000巧m/min离屯、Imin，弃废液，加入500 y I去蛋白液，12000;rpm/min离屯、Imin,弃废液，加入500Ji1漂洗液，12000;rpm/min离屯、Imin,弃废液，加 入500Ji1 漂洗液，12000;rpm/min离屯、Imin,弃废液，12000;rpm/min离屯、2min，静置吹干。 [00巧](4)DNA洗脱：往吸附柱中加入30 y1洗脱液，12000巧m/min离屯、2min，所得液体 为革兰氏阳性菌基因组DNA。取SiilDNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0026] 试剂的配方如下： 下表为本实施例提取到的革兰氏阳性菌基因组DNA纯度检测结果。
[0027]BufferA:溶菌酶（20mg/ml)。
[0028]BufferB: 10%质量体积比的十二烷基硫酸钢（SDS)。
[0029] BufferC:蛋白酶K (20mg/ml)。
[0030] Buffer D: 5mol/L氯化钢（化cl)。
[0031] BufferE:酪：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0032]BufferF:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[003引沉淀剂：70%乙醇。
[0034]去蛋白液：51盐酸脈，2〇1111;径甲基氨基甲烧灯'13)，化=6.6，使用前加入乙 醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为38%。
[003引漂洗液：20mM氯化钢（化cl)，2mMミ?甲基氨基甲烧灯ris)，pH=7.5,85%比重 无水乙醇。
[003引洗脱液：10mMT;径甲基氨基甲烧灯ris)，pH= 8. 5。
[0037] DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
【主权项】
1. 一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，包括革兰氏阳性菌细胞的破碎，DNA的游 离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，其特征是： 革兰氏阳性菌细胞的破碎：取3ml革兰氏阳性菌过夜培养液分3次加到I. 5ml离心管 中，每次10000-13000rpm/min离心l_5min后弃上清；往菌体沉淀中加入0. 2-0. 5ml ddH20 悬浮沉淀，并加入 50-80 yl Buffer A 溶液，40°C保温 10-50min;加入 30-60 yl Buffer B， 5-10 y I Buffer C 混匀，37°C保温 30-60min ;加入 0? 4-0. 6ml Buffer D 混匀； DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600 y I Buffer E抽提，10000-13000rpm/min 离心10_30min，将上清转移至干净的I. 5ml离心管中；加入200-600 y I Buffer F抽提， 10000-13000rpm/min离心10_30min，将上清转移至干净的I. 5ml离心管中； DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入与上清等体积的沉淀剂，混匀后 加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心l-5min，弃废液，加入200-600 y 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 离心 l-5min，弃废液，加入 200-600 y 1 漂洗液，10000-13000rpm/min 离心l_5min，弃废液，加入200-600 y 1漂洗液，10000-13000rpm/min离心l_5min，弃废液， 10000-13000rpm/min 离心 l_5min，静置吹干； DNA洗脱：往吸附柱中加入10-50 y 1洗脱液，10000-13000rpm/min离心l_5min，所得 液体为革兰氏阳性菌基因组DNA ;取2-7 y I DNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。2. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 DNA吸附柱为硅胶模吸附柱。3. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer A:l〇-50mg/ml 的溶菌酶。4. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer B: 10-20%质量体积比的十二烷基硫酸钠。5. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer C:20_50mg/ml 的蛋白酶 K06. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer D:4_6mol/L 的氯化钠。7. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer E为酸：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。8. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 Buffer F:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。9. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的沉 淀剂：70-80%乙醇。10. 根据权利要求1所述的一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，其特征是所述的 去蛋白液：3-6M盐酸胍，10-30 mM三羟甲基氨基甲烷，pH=6. 0-7.0,用前加乙醇，使得乙醇 在去蛋白液中的终浓度为30-40%;所述的洗脱液：pH=8. 0-9. 0的10-20mM三羟甲基氨基甲 烷。
【专利摘要】本发明提供一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒，属于生物技术领域。本发明所述的试剂盒，包括革兰氏阳性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱的具体步骤。常规的革兰氏阳性菌基因组的试剂盒提取步骤较为繁琐，耗时较长，提取时间一般需要12h左右，一种提取革兰氏阳性菌基因组的试剂盒与常规的革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法相比仅需要2h左右即可提取到革兰氏阳性菌基因组DNA，不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阳性菌基因组DNA。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105154430
【申请号】CN201510450059
【发明人】王清水, 余彦
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月28日