管上，将30?10ul Elut1n Buffer直接加到DNA Column的中间，65°C水浴10 ?15min ;13000g，离心 lmin，洗提 DNA ;再次加入 30 ?100 μ L Elut1n Buffer，重复洗提。
[0032]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中取105个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0033]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中取110个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0034]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中取120个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0035]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中取130个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0036]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中取140个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0037]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是:步骤一中用NaClO进行表面消毒，是采用有效氯为5 %的NaClO进行表面消毒3?5min。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0038]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是:步骤一中4°C条件下用灭菌去离子水浸泡22h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0039]实施例:
[0040]为验证本发明的效果，进行以下实验:
[0041]大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，按以下步骤进行:
[0042]一、取100个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊，用NaClO进行表面消毒，然后装入到已经灭菌的2mL离心管中，4°C条件下用灭菌去离子水浸泡24h，获得胞囊样品；
[0043]二、用土壤DNA抽提试剂盒进行胞囊样品的DNA提取，具体操作参照土壤DNA抽提试剂盒的使用说明书，即完成大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取；
[0044]其中步骤一中大豆胞囊线虫胞囊的寄生率为50%以上。
[0045]DNA提取的具体操作:
[0046]1、取0.5g玻璃珠置于装有胞囊样品的离心管中，加入ImL Buffer SLX Mlus，漩涡振荡3?5min ；
[0047]2、加 10yL Buffer DS，漩涡混匀；
[0048]3、70°C水浴lOmin，在水浴过程中漩祸混样，3000rpm，室温离心3min ；
[0049]4、取上清800 μ L于2ml离心管，加270 μ L Buffer SP2，漩涡混匀；
[0050]5、冰浴5min后，13000g，4°C离心5min，取上清于2mL离心管中，加0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，4°C，13000g离心1min沉淀DNA ；
[0051]6、弃上清，将离心管倒置在滤纸上Imin吸干液体；
[0052]7、加 200 μ L Elut1n Buffer，旋振 10s，然后 65°C水浴 10 ?20min 溶解 DNA ；
[0053]8、加 50 ?100 μ L HTR Reagent，旋振 10s，室温静置 2min，13000g，离心 2min ；
[0054]9、取清澈上清于新的2mL离心管中，加入等体积的XP2Buffer，漩涡混匀；
[0055]10、将上述样品置于安装在2mL收集管上的HiBind DNA Column ;10000g，室温离心lmin，丢弃收集液^#DNA Column放在收集管上，加入300 μ L XP2Buffer ;10000g，离心Imin ;丢弃收集液和收集管；将DNA Column放在新的2mL收集管上，用700 μ L SPff WashBuffer洗脱柱子；10000g，离心lmin，丢弃收集液；用700 μ I SPff Wash Buffer再次洗脱，丢弃液体，将柱子再次放在空收集管上，13000g,室温离心2min ;将DNA Column放在干净的1.5ml离心管上，将30?10ul Elut1n Buffer直接加到DNA Column的中间，65°C水浴10 ?15min ;13000g，离心 lmin，洗提 DNA ;再次加入 30 ?100 μ L Elut1n Buffer，重复洗提。
[0056]对上述提取后的总DNA的大小和浓度通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检查:胞囊寄生菌DNA检测结果条带亮度明显(图1)，DNA含量达到20ng.μ L 1Wl, DNA纯度较高。该DNA含量能够进行DGGE多样性分析(图2)。DGGE结果较好，条带明显分开，多样性差异明显。可见本发明易于操作，使用方便，DNA提取快速高效，便于推广应用。
【主权项】
1.一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于它按以下步骤进行: 一、取100?150个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊，用NaClO进行表面消毒，然后装入到已经灭菌的2mL离心管中，4°C条件下用灭菌去离子水浸泡18?24h，获得胞囊样品； 二、用土壤DNA抽提试剂盒进行胞囊样品的DNA提取，具体操作参照土壤DNA抽提试剂盒的使用说明书，即完成大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取； 其中步骤一中大豆胞囊线虫胞囊的寄生率为50%以上。2.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中取105个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。3.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中取110个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。4.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中取120个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。5.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中取130个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。6.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中取140个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊。7.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中用NaClO进行表面消毒，是采用有效氯为5%的NaClO进行表面消毒3?5min。8.根据权利要求1所述的一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，其特征在于步骤一中4°C条件下用灭菌去离子水浸泡22h。
【专利摘要】一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，它属于核酸提取技术。它要解决目前大豆胞囊线虫胞囊寄生菌的DNA提取过程中有损失，难准确提供出有关寄生菌群落结构和多样性信息，且胞囊用量大，提取时间长的问题。方法：一、取新鲜的大豆胞囊线虫胞囊，表面消毒，去离子水浸泡，获得胞囊样品；二、用土壤DNA抽提试剂盒进行胞囊样品的DNA提取。本发明所需胞囊量少、步骤简单、容易操作，使用方便，DNA提取快速准确高效，便于推广应用。所提取的DNA可用于变性梯度凝胶电泳等微生物多样性分析，也可用于同类寄生微生物DNA的提取，能够更全面的了解胞囊寄生菌多样性及其种类，解决了难于培养微生物无法鉴定的问题。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105154433
【申请号】CN201510594059
【发明人】宋洁, 许艳丽, 姚钦
【申请人】中国科学院东北地理与农业生态研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月17日