一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重pcr引物组的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体设及一种同时扩增灰葡萄抱菌的方法W及对于 四种杀菌剂的抗性突变基因的引物组。
【背景技术】
[0002] 灰霉病是在露地、保护地常见且防治非常困难的一种真菌性病害，其致病菌是灰 葡萄抱菌度OtrytisCinerea),属半知菌亚口。灰葡萄抱菌的寄主范围十分广泛，包括200 多种植物，例如番茄、黄瓜、葡萄等生活中常见的蔬菜和水果，在农业生产中的危害极大。目 前对于灰霉病的防治方法包括农业防治、生物防治和化学防治等，其中仍W化学防治为主。 常用的杀菌剂包括苯并咪挫类、二甲酯亚胺类、N-苯氨基甲酸醋类、苯氨基喀晚类等。
[0003] 灰葡萄抱菌具有繁殖快、遗传变异大和适合度高等特点，已对多种杀菌剂产生了 一定程度的抗性，甚至产生了多重抗性。对杀菌剂产生抗药性的主要原因是药物作用的祀 位点基因发生点突变，使得杀菌剂无法发挥其原本的效果。田间的菌株在多种杀菌剂的选 择压力下，极有可能产生多种交互抗性，因此针对灰葡萄抱菌的特定一种杀菌剂的抗性突 变检测已经不足W满足农业生产的需要，实现其对多种杀菌剂抗性突变的同时检测是十分 有意义的。
[0004] 灰葡萄抱菌对苯并咪挫类杀菌剂和N-苯氨基喀晚类杀菌剂产生抗性的原因 是0-微管蛋白基因（e-tub)发生E198A、E198V、E198K、F200Y等突变；对二甲酯亚胺 类杀菌剂产生抗性的原因是组氨酸激酶基因度sOSl)发生I365S、I365R、I365N、Q369P、 V368F+Q369H、Q369P+N373S、N373S等突变；对环酷菌胺杀菌剂产生抗性的原因是3-酬基还 原酶基因（erg27)发生F412S、F412I、F412V等突变；对晚酷菌胺杀菌剂产生抗性的原因是 班巧酸脱氨酶铁硫蛋白基因（S化B)发生肥72Y、肥72R、肥721^、P225T、P225F、P225LN230I 等突变。本发明是在已知灰葡萄抱菌对多种杀菌剂的抗药性等突变位点的基础上，设计引 物组同时扩增0-化6、83〇51、6'旨27、5化6四个基因片段，可作为后续的基因忍片等高通量 检测方法的模板，从而实现灰葡萄抱菌对四种杀菌剂抗性突变的同时检测。
【发明内容】
[0005] 本发明是在已知灰葡萄抱菌对苯并咪挫类、晚酷菌胺类、异菌脈和环酷菌胺等多 种杀菌剂的抗药性突变位点的基础上，建立的一种用于同时扩增0-tub、BsOSUerg27、 S化B四种基因片段的PCR引物组。本发明可直接采用提取的灰葡萄抱菌基因组作为模板， 用设计的引物组对模板进行扩增，获得富集的四个基因片段。本发明是首次采用多重PCR 方法对灰葡萄抱菌的四个抗药性突变基因进行同时扩增，为后期抗药位点的检测大大减少 了工作量。
[0006] 本发明设计了用于扩增灰葡萄抱菌0-tub、BsOSl、erg27、S化B四个基因片段的 引物组，经过对PCR反应体系的优化，将四个基因片段在同一PCR反应中进行扩增。
[0007] 本发明突出的优点是：（1)首次在同一个PCR反应中扩增灰葡萄抱菌e-tub、 BsOSl、erg27、S化B四个基因片段，四个基因片段中含有对多数杀菌剂的抗性突变位点，为 后期检测灰葡萄抱菌对多种杀菌剂的抗药性减少了工作量。（2)反应中的非特异性扩增少， 对后续的检测没有影响。
[0008] -种用于扩增灰葡萄抱菌四个基因的方法，其特征在于共分两步：
[0009] 第一步：提取灰葡萄抱菌基因组
[0010] 第二步：进行PCR反应：采用四对引物，分别用于扩增灰葡萄抱菌0-tub、BsOSU erg27、S化B基因，四对引物分别为
[0011]沈QIDN0:1 CGATACCGTTGTCGAGCCAT
[0012] 沈QIDN0:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT
[0013]沈QIDN0:3 ACACCGACCCAGCACCAGA
[0014]SEQIDNO:4 TTAGCAATAACCGCCCAAA
[0015]沈QIDN0:5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG
[0016]沈QIDN0:6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC
[0017] 沈QIDN0:7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG
[0018]沈QIDN0:8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC
[0019]PCR反应混合液中含有提取的待测样品的基因组DNA作为PCR反应的模板，反应体 系如下，
[0020] SEQ IDNO:!, 10.UM 0^uL 化QIDNO:2，IOyM 0.5.此 SEQ!DNO:3, IOuMj|_iL SEQ!DNO;4, IOuMI^iL SE巧技 1st任 5:，IOpMOJjjL SEQ!DNO:6, IOuM 〇.5uL SEQ!DNO:7, IOuM 〇.5uL SE巧技 1st任 8:，IOpMOJjjL dNTP.IOmM 0.5uL Taq!Vil;，20U,VL 0IuL MgCla， 5QMM 0.75uL 不含Mg2+化PCR缓冲液，I〇x 2.5.止 待测基因组，50峭/阵 IjiL 4踰O 15.15 呼
[00引]PCR反应程序：94°C5min;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec;72°ClOmin。
[0022] 更具体的本发明的目的是运样实现的：
[0023] 一种同时扩增四个灰葡萄抱菌抗药相关基因的引物组，其体系包括四对多重PCR 扩增引物，分别用于扩增灰葡萄抱菌P-化6、83051、6'旨27、5化8四个基因片段；口〇?反应组 分，购自invitrogen公司，包括Taq酶，dNTPs，PCR缓冲液（不含Mg2+) ,MgClz。采用UNIQ-IO 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，提取待测样品 的基因组DNA。
[0024]所用的引物序列分别为：SEQIDN0:1CGATACCGTTGTCGAGCCAT，沈QIDN0:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT，用于扩增e-tublin基因；SEQIDN0:3ACACCGACCCAGCACCAGA， SEQIDNO: 4TTAGCAATAACCGCCCAAA,用于扩增S化B基因；SEQIDNO: 5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG，沈QIDN0:6TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC，用于扩增BcOSl基因；SEQ IDN0:7ATCATGCCCTTGAATTTTGTG，沈QIDN0:8CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC，用于扩增化邑27 基因。
[00巧]进行实验组和对照组PCR反应，其中实验组PCR反应混合液中含有提取的待测样 品的基因组DNA作为PCR反应的模板，反应体系如下，
[0026] SEQ IDNO: 1，！^iM 0bi± SEQIDNO:2，！化iM 0,薄L SEQIDNO:3，！OyM 1|_山 SEQIDNO:4，！0|_iM 1|_山 SEQIDNO:、！0|_iM 0,薄L 化QI[)NO:6，IOyM 0,5uL 化QI[)NO:7，IOyM 0.5.UL SEQIDNO:8,i0.uM 0,5pL clNTP,IOmM 0,5uL Taq赔，201」4止 0.1,uL MgCk，50'mM 巧片L PCR缓冲液（不含Mg2+}:，1恥 2,5uL 待测基因组，50ng/|iLl(xL ddH,0 段1 却iL
[0027] 对照组PCR反应混合液中加入等量的双蒸水（d地2〇)作为PCR反应的模板，反应 体系如下：
[0028] SEOIDNO:I, IOpM 化冲L SEO !DNO:2, IO'uMO^L SE〇!DNO:3, IO'uMI片L SEQIDNO:4，IO'uMI片L SEQIDNO:、IO.uM 〇.5,uL SE〇!DNO:6, IO.uM 〇.5,uL 化QIDNO:7，IO,uM 〇.5,uL 化QIDNO:8，IOpM 〇.5,uL
[0029] ClNFPIOmM 化 5jiL TaqW,2OU/.1L 0.1,LiL MgCI:，50mM 0.7引止 PCR缓冲液（不含Mg2+) :，l〇x 2.5hL ddH.O 16.15i.lL
[0030] PCR反应程序：94°C5min;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec，35巧cles; 72°CIOminO
[003。 PCR结束后，取5iiL反应液进行琼脂糖凝胶（2% )电泳，检测结果。
【附图说明】
[0032] 图1本发明实施例电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1、菌株样品的多重PCR扩增
[0034] 采用UNIQ-IO柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份 有限公司，提取5株待检测菌株的基因组DNA。PCR反应组分，购自invitrogen公司，包括 Taq酶，dNTPs，PCR缓冲液（不含Mg2+)，MgClz。
[0035] 进行实验组和对照组PCR反应，其中实验组PCR反应混合液中含有提取的待测样 品的基因组DNA作为PCR反应的模板，反应体系如下，
[0036] SEQIDN0:1，化引止SEQIDN0:2，O引止 SEQfDN0:3，IpL SEQfDN0:4，IjiL SECMDN0:5，1〇!_iM 0.非L SE〇rDNO:6, I〇!.iM 0.非L SECMDNO:7，1〇!_iM 0.非L SE〇rDNO:S, 1〇!.iM 0.非L dNTP,IOmM 0却iL
[0037] Taqi"时，20U/VLO.lpL MgCb，5〇mM 0.75|iL PCR 缓冲液（不含MgW)，WX 2.5uL 待测基因组，如ng/阵 破L ddH：0 15.!5)jL
[0038] 对照组PCR反应混合液中加入等量的双蒸水（d地2〇)作为PCR反应的模板，反应 体系如下：
[0039] S；EQIDNO:l，iOfiM 0,却正 SEQIDNO:2,iOfiM 0.卽L S；EQIDNO:3，i(VMIuL SEQIDNO:4,iOfiMIgL S；EQIDNO:5，i(VM 0.卽L SEQIDNO:6,iOfiM 0.卽L SEQIDNO:7，IOfiM 〇.5},iL SEQIDNO:8，I叩M 〇.5非 dNTP,IOmM 0.非止 Taq鴨，20U./.UL 0.1j.iL MgCl), 50mM 0.7非止 PCR缓冲液（不含Mg2*) ,l〇x 2.5阵 加Hi'O 16.15冲
[0040] PCR反应程序：94°CSmin;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec;72°ClOmin。
[0041] PCR结束后，取5yL反应液进行琼脂糖凝胶（2 %，即0. 6g溶质溶解于30ml溶剂） 中电泳，检测结果。如图1所示，点样孔M为DNAmarker,点样孔1-5为检测样品，点样孔6 为阴性对照组。根据电泳结果，本发明的引物能够成功扩增出0 -tub、BsOSUerg27、S化B 四个基因片段。
【主权项】
1. 一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法，其特征在于共分两步： 第一步：提取灰葡萄孢菌基因组 第二步：进行PCR反应：采用四对引物，分别用于扩增灰葡萄孢菌β-tub、BsOSU erg27、SdhB基因，四对引物分别为 SEQ ID N0:1 CGATACCGTTGTCGAGCCAT SEQ ID NO:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT SEQ ID NO:3 ACACCGACCCAGCACCAGA SEQ ID NO:4 TTAGCAATAACCGCCCAAA SEQ ID NO:5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG SEQ ID NO:6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC SEQ ID NO:7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG SEQ ID NO:8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC PCR反应混合液中含有提取的待测样品的基因组DNA作为PCR反应的模板，反应体系如 下，PCR 反应程序：94°C 5min ;94°C 30sec，59°C 30sec，72°C 20sec ;72Γ IOmin02. -种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的多重PCR引物组，对应于扩增灰葡萄孢菌 β -tub、BsOSl、erg27、SdhB基因，四对引物分别为 SEQ ID NO:I CGATACCGTTGTCGAGCCAT SEQ ID NO:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT SEQ ID NO :3 ACACCGACCCAGCACCAGA SEQ ID NO :4 TTAGCAATAACCGCCCAAA SEQ ID NO :5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG SEQ ID NO :6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC SEQ ID NO :7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG SEQ ID NO :8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTCo
【专利摘要】一种用于扩增灰葡萄孢菌四个基因的方法及其多重PCR引物组涉及分子生物学领域。本发明是在已知灰葡萄孢菌对苯并咪唑类、啶酰菌胺类、异菌脲和环酰菌胺等多种杀菌剂的抗药性突变位点的基础上，建立的一种用于同时扩增β-tub、BsOS1、erg27、SdhB四种基因片段的PCR引物组。本发明可直接采用提取的灰葡萄孢菌基因组作为模板，用设计的引物组对模板进行扩增，获得富集的四个基因片段。本发明是首次采用多重PCR方法对灰葡萄孢菌的四个抗药性突变基因进行同时扩增，为后期抗药位点的检测大大减少了工作量。本发明经过对PCR反应体系的优化，将四个基因片段在同一PCR反应中进行扩增。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN105154432
【申请号】CN201510593450
【发明人】马雪梅, 张鑫, 吕宝北, 赵鹏翔, 谢飞
【申请人】北京工业大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月17日