一种提高禽畜钙磷利用率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种在禽畜体内表达植酸酶基因从而 提高禽畜钙磷利用率的方法。
【背景技术】
[0002] 植酸在多种植物组织(特别是种子）中作为磷的主要储存形式，其以钙镁钾盐的形 式存在。以玉米、小麦等谷物为主要组份的畜禽(鸡、牛、羊、猪等）饲料中都含有大量的植 酸。植酸的存在大大降低了饲料中可利用的钙磷的含量。然而家禽(鸡、鸭等）和非反刍动 物(猪、兔等）自身肠道内无表达植酸酶的正常菌群而不能消化植酸，因此要想提高饲料中 钙磷的利用效率，就需要在畜禽体内利用植酸酶来降解植酸。
[0003]目前畜禽生产上主要通过在饲料中添加体外表达纯化的植酸酶来解决上述问题。 而生产植酸酶的成本较高、其在饲料制作中不耐高温，使得其应用推广受到一定的限制。根 据预测，2014年我国添加饲用植酸酶的饲料的比例将由50%左右提高到80%，按0. 013%的 添加比例计算，2014年饲用植酸酶需求量可达到4. 59万吨，比2010年产量增长92. 76%。
[0004]因而开发一种在禽畜体内表达植酸酶基因从而提高禽畜饲料钙磷利用率的新方 法，将在畜禽养殖业取代或者部分取代饲料中植酸酶的添加，产生巨大的经济效益，为畜牧 业生产提供动力。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种在禽畜体内表达植酸 酶基因从而提高禽畜钙磷利用率的方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种提高禽畜钙磷利用率的方法，所述方 法包括如下步骤：
[0007] 1)获取植酸酶基因全长DNA ;
[0008] 2)含有植酸酶基因的球虫转染载体的制备：
[0009]将上述植酸酶全基因构建至球虫表达载体pMDEAAssA中，获得球虫转染载体 pMDEA-phytase；
[0010] 3)球虫载体的转染和转基因球虫的筛选：
[0011]将载体pMDEA-phytase转染球虫子孢子，并接种至畜禽体内，利用药物抗性基因 进行压力筛选，收集粪便中的后代卵囊，进行筛选鉴定后获得表达所述植酸酶的转基因球 虫；
[0012] 4)将表达植酸酶的转基因球虫通过口服方式接种至畜禽体内，使球虫在肠道内进 行内生性发育的同时表达并释放出植酸酶，降解植酸。
[0013]作为优选，所述畜禽为鸡、鸭、猪或兔。
[0014]其中，所述步骤1)从芽孢杆菌、黑曲霉菌或大肠杆菌中利用PCR方法获取植酸酶 基因全长DNA。
[0015] 进一步地，所述步骤2)具体为将步骤1)扩增得到的植酸酶基因和球虫表达载 体pMDEAAssA用限制性内切酶Agel、SacII酶切，将酶切片段进行DNA片段回收、连接与 转化，然后小提质粒进行鉴定，将鉴定阳性的质粒进行大提，即得构建好的球虫转染载体 pMDEA-phytase〇
[0016] 本发明还提供了根据步骤2)构建得到的球虫转染载体pMDEA-phytase以及所述 载体在提高禽畜钙磷利用率中的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] (一）本发明首次将不同来源的植酸酶基因表达于球虫中，从而获得重组的微型生 物反应器，可产生直接应用于畜禽的植酸酶，无需生产及纯化的设备和相关操作。
[0019] (二）本发明提供了 一种利用植酸酶提高畜禽钙磷利用率的新方法，可以在畜禽肠 道内直接产生植酸酶，从而帮助消化饲料中的磷酸。
[0020](三）本发明所获得的表达植酸酶的转基因球虫使用简单，成本低廉，应用前景广 阔。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明表达植酸酶的转基因球虫的鉴定。其中：A为报告基因的表达情况； B为利用抗植酸酶多抗对球虫子孢子进行免疫荧光染色的结果。
[0022] 图2为本发明接种表达植酸酶的转基因球虫对鸡增重及钙磷利用的作用。其中： A为口服接种球虫后，鸡只的体重增长情况；B为对鸡只排出的粪便中的钙磷含量的测定结 果。
[0023] 图3为球虫转染pMDEA-phytase质粒后连续传代得到的球虫卵囊的发光效率。
[0024] 图4应用表达植酸酶的转基因球虫对肉鸡利用饲料中钙磷的作用。A为粪便中钙 含量测定，B为粪便中磷含量测定。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 实施例1
[0027] 1、载体构建
[0028] 使用常规PCR技术将大肠杆菌的植酸酶全长基因（其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示)扩增并在两端分别加上Agel和SacII酶切位点序列，对测序正确的PCR产物用限制性 内切酶Agel和SacII酶切，连入Agel和SacII酶切载体pMDEAAssA(由发明人所在实验室 基于PBR322载体构建而成，含有柔嫩艾美耳球虫的mic2启动子、药物筛选基因DHFR-TS3m、 报告基因黄色荧光蛋白EYFP、柔嫩艾美耳球虫的actin启动子及3'调控序列、刚地弓形虫 致密颗粒蛋白8的信号肽序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示）后得到的骨架中，然后 对获得的阳性克隆进行鉴定。将鉴定正确的重组质粒进行大提，即得构建好的球虫转染载 体pMDEA-phytase (其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示)。
[0029] 2、核转染与转基因球虫的筛选
[0030] 将球虫表达载体pMDEA-phytase用SnaBI进行酶切，然后乙醇沉淀线性化的 DNA片断。取1X10 7个柔嫩艾美耳球虫的子孢子，5-10iig的线性化质粒，5iiL Ndel限 制性内切酶和100 y L的核转染缓冲液，混匀后移至电击杯中，将电击杯插入核转染仪 Nucleofector II的电击槽中，选择核转染程序U-033进行核转染；转染后立即向电击杯里 加入1000 yL DMEM培养液，将转染后的球虫子孢子接种至7日龄无球虫。在接种后第2天 开始，在饲料中加入乙胺嘧啶药物（150微克/公斤）进行药物压力筛选。收集6~8天粪 便中的卵囊，孢子化后用流式细胞仪筛选发光的虫体，接种鸡，再收取卵囊，再接种鸡并重 复上述药物筛选过程，反复6代，获得稳定表达报告基因黄色荧光蛋白的后代群体。
[0031] 3、间接免疫荧光（IFA)鉴定
[0032] 取表达黄色荧光蛋白