的孢子化卵囊2X107个加入等体积玻璃珠，用涡旋振荡器 lOOOrpm振荡5min，大部分孢子囊释出后加入含1. 5%的胰酶及10%胆汁的脱囊缓冲液在 42°C作用40分钟以脱囊释放出子孢子。子孢子经DE-52纤维素柱过柱除去杂质后，得到的 子孢子虫体用于间接免疫荧光染色。将子孢子悬液滴到载玻片上，甲醇固定后用制备的抗 植酸酶小鼠多抗作为一抗孵育，孵育后洗涤3次，再加入Texas Red标记的羊抗鼠二抗进行 孵育。5次洗涤后在荧光显微镜下观察染色结果。
[0033] 4、SPF鸡接种表达植酸酶的转基因球虫的钙磷利用试验
[0034] 将30只28日龄SPF鸡分为3组，分别为空白组、野生球虫组和转基因球虫组。所 有鸡只在实验期间均饲喂不添加植酸酶的全价颗粒饲料。第1天即给野生球虫组和转基因 球虫组分别口服接种野生球虫和转基因球虫，接种剂量均为5X 103。接种后每3天监测鸡 只体重、检测粪便中磷的含量。
[0035] 5、结果
[0036] 经间接免疫荧光(针对植酸酶蛋白）的染色确认，表达黄色荧光报告蛋白的球虫 (图1A)同时表达植酸酶（图1B)。
[0037] 表达植酸酶的球虫经口接种后第6天，球虫组鸡只粪便中的磷含量就低于空白对 照组和野生型球虫接种组，而从接种后第12天开始，转基因球虫组鸡只粪便中的磷含量显 著低于另外两组。到试验结束，转基因球虫组鸡只体重显著高于另外两个对照组，且饲料报 酬也显著高于两个对照组。鸡只体重（28-45日龄）和粪便中钙磷含量（45日龄）的数据见 图2。
[0038] 实施例2
[0039] 实施例1的步骤2和3,我们对比了连续传代代数与获得稳定表达植酸酶转基 因球虫的关系。每一代的后代球虫卵囊收集后，经过纯化和孢子化，在荧光显微镜下检测 其发光效率，其计算公式为：发光率=黄色荧光蛋白表达的孢子化卵囊/所有的孢子化卵 囊X 100%。我们发现，第4代及第5代的发光效率分别为54%和83%，而药物压力筛选到 第6代时能获得100%表达黄色荧光报告蛋白转基因球虫，随后的连续传代（7-9代)仍然为 100%表达荧光蛋白（见图3)。通过实施例1中步骤3的鉴定，证实连续药物压力传代6代 是获得表达植酸酶的转基因球虫的最优化条件。
[0040] 实施例3
[0041] 在一个转基因球虫对比试验中，我们比较了商品化的重组植酸酶添加与应用本发 明获得的转基因球虫对饲料中钙磷利用效果的对比。
[0042] 将1日龄AA肉鸡随机分为空白对照组、植酸酶添加组和转基因球虫使用组(每组 10只鸡)。饲料为无植酸酶添加的全价颗粒饲料(委托北京华都饲料有限公司小规模生产)。 植酸酶添加组则在饲料中全程添加植酸酶5000 (苏柯汉生物工程有限公司生产)，添加量为 600g/kg。转基因球虫组的鸡只在1日龄经口服接种所述的表达植酸酶的转基因和缓艾美 耳球虫，每只鸡接种剂量为为5X10 3孢子化卵囊。测定1-42日龄期间的粪便中钙磷含量 (每7天测定一次)。
[0043] 检测结果见图4。可见饲料中添加重组的植酸酶可以明显降低饲料中钙磷的含量； 而口服接种表达植酸酶的转基因球虫后，鸡只粪便中的钙磷含量也有显著降低，尽管其低 于植酸酶添加组。
[0044] 这个测定结果表明，表达植酸酶的转基因球虫可以有效降解饲料中的植酸，达到 提高饲料中钙磷利用的目的，可以部分替代重组植酸酶的添加。基于球虫活疫苗在畜禽中 的有效应用，这种表达植酸酶的转基因球虫既可以作为疫苗预防畜禽球虫病，在提高钙磷 的利用的同时降低对环境的污染，一举多得。
[0045] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种提高禽畜钙磷利用率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1) 获取植酸酶基因全长DNA ; 2) 含有植酸酶基因的球虫转染载体的制备： 将上述植酸酶全基因构建至球虫表达载体pMDEAAssA中，获得球虫转染载体 pMDEA-phytase ； 3) 球虫载体的转染和转基因球虫的筛选： 将载体pMDEA-phytase转染球虫子孢子，并接种至畜禽体内，利用药物抗性基因进行 压力筛选，收集粪便中的后代卵囊，进行筛选鉴定后获得表达所述植酸酶的转基因球虫； 4) 将表达植酸酶的转基因球虫通过口服方式接种至畜禽体内，使球虫在肠道内进行内 生性发育的同时表达并释放出植酸酶，降解植酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述畜禽为鸡、鸭、猪或兔。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)从芽孢杆菌、黑曲霉菌或大肠 杆菌中利用PCR方法获取植酸酶基因全长DNA。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为将步骤1)扩增得到的 植酸酶基因和球虫表达载体pMDEAAssA用限制性内切酶Agel、SacII酶切，将酶切片段进行 DNA片段回收、连接与转化，然后小提质粒进行鉴定，将鉴定阳性的质粒进行大提，即得构建 好的球虫转染载体pMDEA-phytase。
5. 根据权利要求4所述方法中步骤2)构建得到的球虫转染载体pMDEA-phytase。
6. 根据权利要求5所述的载体在提高禽畜钙磷利用率中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种提高禽畜钙磷利用率的方法，所述方法包括：1）获取植酸酶基因全长DNA；2）球虫转染载体pMDEA-phytase的制备；3）载体的转染和转基因球虫的筛选；4）将表达植酸酶的转基因球虫通过口服方式接种至畜禽体内，使球虫在肠道内发育的同时表达并释放出植酸酶，降解植酸。本发明首次将不同来源的植酸酶基因表达于球虫中，从而获得重组的微型生物反应器，可产生直接应用于畜禽的植酸酶，无需生产及纯化的设备和相关操作。
【IPC分类】C12N15-55, A23K1-165, A01K67-033, C12N9-16, C12N15-85
【公开号】CN104673830
【申请号】CN201410042182
【发明人】刘贤勇, 索勋, 罗雪, 索静霞, 田秀玲, 秦梅, 汤新明
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年1月28日