一种用于敲除l-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用重叠延伸PCR的技术连接植物乳杆 菌DMDL9010中L-乳酸脱氢酶1上下游序列，并通过构建亚克隆载体为拼接的上下游片段 提供酶切位点，同时筛选得到用于构建以红霉素为筛选标记的质粒，成功的构建用于敲除 目标菌L-乳酸脱氢酶1基因的重组载体。
【背景技术】
[0002] 高光学纯度97%以上的D-乳酸或L-乳酸，是重要的手性中间体和有机合成原 料，能广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。D-乳酸在提高 聚乳酸热稳定性等方面也具有重要作用。目前限制D-乳酸的广泛应用的主要原因有：（1) D-乳酸的生产成本高，其发酵生产的原材料成本高，提纯和精制成本高；（2)没有筛选到合 适的能发酵产生高光学纯度D-乳酸的菌株，因为一般的乳酸菌主要以发酵产生L-乳酸为 主；（3)现有已知的乳酸菌一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作为碳源。微生 物发酵法是目前制备D-乳酸的最主要方法之一，由于D-乳酸的理化性质与L-乳酸极其相 似，利用化学方法很难将两种同分异构体分离开来，因此生产D-乳酸的关键在于筛选出高 光学纯度D-乳酸高产菌种。
[0003]目前已证实，将L-乳酸脱氢酶基因敲除，能够直接生产高光学纯度的D-乳酸。传 统的构建敲除L-乳酸脱氢酶1基因的重组载体的方法，需要在连接片段之间引入酶切位 点，并且酶切连接比较耗时，效率低；PCR对短于100bp和长几十片段的重组很难成功。
【发明内容】
[0004] 为获得更高纯度的D-乳酸，本发明提供了一种L-乳酸脱氢酶编码基因敲除的方 法，并提供了一种更有效的基因序列拼接的方法，主要是利用重叠延伸PCR的方法大量获 得了 L-乳酸脱氢酶编码基因的上下游拼接片段，再将拼接片段克隆到pG+h〇st9质粒载体 中构建得到用于敲除植物乳杆菌DMDL9010的重组载体。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006] 一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体的构建方法，包括如下步骤：
[0007] (1)从NCBI中找到L-乳酸脱氢酶1编码基因的位置及其上下游800~lOOObp的 DNA序列，然后确定保守序列设计引物并引入重叠片段，提取植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) DMDL 9010的DNA，并以此为模板，扩增得到不含L-乳酸脱氢酶编码基因的该基 因的上下游DNA片段（如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示），利用高保真酶进行重叠延伸 PCR连接该基因的上下游DNA片段（如SEQ ID NO. 1所示）；所述植物乳杆菌DMDL的保藏 编号为 CGMCC NO. 5172 ;
[0008] (2)将上述连接片段的:V端进行加A反应后与pMD18-T载体进行连接反应并转 化到大肠杆菌DH 5a感受态细胞中，最后得到亚克隆载体，然后大量制备亚克隆载体，进 行Xho I和Pst I双酶切，在重叠片段上引入粘性末端；
[0009] (3)将经过Xho I和Pst I双酶切处理的pG+host9质粒与步骤⑵制得的重叠片 段进行连接反应，然后将此连接产物化转到大肠杆菌DH5 a蓝白斑筛选后，进行一系列的 阳性克隆鉴定实验（PCR鉴定和双酶切鉴定）；
[0010] (4)从四种大肠杆菌中筛选得到用于构建以红霉素为标记的重组载体的宿主大肠 杆菌MC1061和TG1，同时得到最适合筛选的红霉素浓度500 y g/ml。
[0011] (5)利用Pst I、Xhol工具酶将上述亚克隆载体酶切后得含有粘性末端的目的片 段同时与被双酶切的pG+host9进行连接，再经热转化转入大肠杆菌MC1061或TG1中，利用 红霉素进行筛选阳性工程菌；
[0012] (6)对上述工程菌进行菌落PCR鉴定，阳性菌经发酵培养提取质粒，然后进行双酶 切鉴定，得到重组载体。
[0013] 所述重叠延伸PCR的条件为：单步重叠延伸PCR，模板浓度为0. 4ng/y 1，引入引物 的重叠片段为15bp。
[0014] 步骤⑴中所述引物如表1所示。
[0015] 表1 L-乳酸脱氢酶1编码基因的上下游DNA片段的引物
[0016]
【主权项】
1. 一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 从NCBI中找到L-乳酸脱氢酶1编码基因的位置及其上下游800~lOOObp的 DNA序列，然后确定保守序列设计引物并引入重叠片段，提取植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) DMDL 9010的DNA，并以此为模板，扩增得到不含L-乳酸脱氢酶编码基因的该基 因的上下游DNA片段，利用高保真酶进行重叠延伸PCR连接该基因的上下游DNA片段；所述 植物乳杆菌DMDL的保藏编号为CGMCC NO. 5172 ; (2) 将上述连接片段的3'端进行加A反应后与pMD18-T载体进行连接反应并转化 到大肠杆菌DH 5a感受态细胞中，最后得到亚克隆载体，然后大量制备亚克隆载体，进行 Xho I和Pst I双酶切，在重叠片段上引入粘性末端； (3) 将经过Xho I和Pst I双酶切处理的pG+h〇st9质粒与步骤⑵制得的重叠片段进 行连接反应，然后将此连接产物化转到大肠杆菌MC1061或TG1中，于红霉素抗性平板上进 筛选阳性转化菌，得到重组载体。
2. 根据权利要求1所的构建方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR的条件为：单步重叠 延伸PCR，模板浓度为0. 4ng/ y 1，引入引物的重叠片段为15bp。
3. 权利要求1或2所述方法构建的载体。
【专利摘要】本发明公开了一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法，该方法为将不含L-乳酸脱氢酶编码基因的该基因的上下游DNA片段利用重叠延伸法完成拼接并将此拼接片段克隆到亚载体pMD18-T上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选构建好的亚克隆载体，双酶切得到目的条带后连接到pG+host9质粒上，经过菌落PCR以及双酶切鉴定成功得到重组载体。本发明通过重叠延伸PCR的方法来构建敲除L-乳酸脱氢酶编码基因的重组质粒，避免了酶切连接引入多余的碱基序列。本发明重组载体可用于生产高光学纯度的D-乳酸。
【IPC分类】C12R1-25, C12N15-53, C12N15-74
【公开号】CN104673819
【申请号】CN201510070716
【发明人】刘冬梅, 费永涛, 黄娟, 陈思敏, 黄智斌
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月10日