专利名称：金龟子绿僵菌突变株及其在甾体化合物羟化反应中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物及化学合成领域，涉及金龟子绿僵菌突变株及其应用，具体的说，涉及一株金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490及其在留体化合物轻化反应中的应用，所述的金龟子绿僵菌突变株能在留体化合物母核上引入11 α羟基。
背景技术：
留体药物应用广泛、需求量大，其化学合成通常涉及多步复杂反应以及有毒有害物质的使用。而微生物转化反应通常在常温常压下进行，相比于化学反应具有专一性强、污 染少和产率高的优点，因此留体制药工业通常利用两者的优势配合使用。1952年美国普强药厂的Murray和Peterson首次利用黑根霉在黄体酮上引入Ila轻基,人们开始认识到微生物转化反应在留体药物生产中的重要性。此后，相继报道了多种留体微生物转化反应，主要有羟基化、△ L脱氢和留醇边链降解等，这些反应为留体药物的化学合成提供关键中间体。羟化反应是留体微生物转化反应中最重要的反应，微生物能在留体母核的任何位置进行羟化反应，而化学方法除了较易在C17引入羟基外，在其它位置都很难引入。留体微生物羟化反应无论在其多样性或重要性方面都是独特的，因为它能达到其它方法不能达到的部位。其中留体Ila羟化反应在留体制药工业上应用广泛，在留体母核上引入Ila羟基能增加甾体药物的抗炎活性。有研究公开了 19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，I-二酮(⑶)的11 a羟化衍生物是制备新型口服避孕药地索高诺酮(Desogestrel)的关键中间体；另外，雄留-4-烯-3,17-二酮(AD)的11 a轻基衍生物是制备依普利酮(Eplerenone,商品名Inspra，第一个获准上市的选择性醛固酮受体阻断剂)的关键中间体。美国专利(US20050234251A1)米用一株掠曲霉Aspergillus ochraceous在地索高诺酮合成前体19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入Ila羟基。有研究报道采用金龟子绿僵菌野生菌株928或610在19-去甲基-13-乙基-雄留_4_烯-3，I-二酮上引入11 α羟基，投料浓度0. 2%时转化率为36% ;野生菌株经过UV-LiCl联合诱变后获得能在雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入Ila羟基的突变株Μ28-203。
发明内容
本发明目的是提供金龟子绿僵菌突变株及其应用，具体涉及一株金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490及其在甾体化合物轻化反应中的应用，尤其是在甾体化合物Ila羟化反应中的应用。本发明在提供了一株金龟子绿僵菌突变株，该突变株能在19-去甲基-13-乙基-雄留-4-烯-3，17-二酮、雄留-4-烯-3，17-二酮及雄留-I，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入Ila轻基。所述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，保藏号为CCTCC M2011240。
本发明所述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCCM2011240经鉴定，具有如下生物学特征马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28°C培养4 5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7 10天呈橄榄石灰色。分生孢子梗短而直，分枝或单生；从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落常聚成黑色块状物结构。在液体摇瓶生长培养时，呈分叉状大型营养菌丝，进而能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2. 5 3. 75 X 5. 6 8. O μ m。本发明进一步提供了金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490在甾体化合物羟化反应中的应用。具体而言，本发明提供了一种新的留体化合物Ila羟化反应方法，其特征在于在甾体化合物上引入Ila羟基，其包括步骤(I)菌种选择金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240 ；(2)斜面培养将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，其中添加质量百分比为O. 25%的蚕蛹粉，26 30°C培养5 10天；(3)种子培养将步骤⑵培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基的250mL摇瓶中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min培养24 60小时，制得种子液，所述的培养基中，含质量百分比I 3%的葡萄糖、I 3%的黄豆粉、O. 25 1%的蚕蛹粉，ρΗ6· O 7. O ;(4)扩大培养以5 15%的体积比的接种量将种子液接种于步骤(3)所述的液体培养基中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min培养24 60小时，得发酵液；(5)甾体转化将待转化的甾体底物预先溶于含质量百分比为1%的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比I 3%的投料量投入经步骤(4)培养获得好的发酵液中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min转化48 96小时，得发酵液；(6)分离产物将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的留体底物Ila羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化留体底物。本发明中，步骤⑵、(3)、(4)、(5)中所述的菌种培养和转化温度优选为28°C。本发明中，步骤(3)、(4)中所述的葡萄糖的浓度优选质量百分比为3%，黄豆粉的浓度优选质量百分比为2%，蚕蛹粉的浓度优选质量百分比为O. 5%。本发明中，步骤(3)、(4)中所述菌体培养时间优选是44 50小时。本发明中，步骤(3)、(4)中所述菌体培养pH值优选为6. 5。本发明中，步骤(5)所述待转化的甾体底物包括但不限于19-去甲基-13-乙基-雄留-4-烯-3，17-二酮、雄留-4-烯-3，17-二酮及雄留-1，4-二烯-3，17-二酮。本发明中，步骤(5)所述底物投料量优选为质量百分比2%。本发明中，步骤(5)所述转化时间优选为66 78小时。在上述利用金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490进行留体化合物11 α羟化反应的方法中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的液体培养基为添加葡萄糖、黄豆粉和蚕蛹粉的无机盐培养基，其配方为每IOOOmL蒸馏水中添加葡萄糖30g、黄豆粉20g、蚕蛹粉5g、硫酸氨2. 5g、磷酸氢二钾lg、硫酸镁O. 5g、硫酸亚铁O. 02g。上述步骤⑵、(3)、(4)中所述的菌体培养基于121°C条件下灭菌20分钟后使用。经试验鉴定,本发明的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490能有效的在留体化合物上引入Ila羟基，并且转化产物和未转化底物分别存在于发酵上清液和菌体中，便于分别进行产物分离和回收底物；而现有技术利用化学方法很难在留体母核上引入Ila羟基。本发明提供的留体化合物Ila羟化反应方法具有转化效率高、发酵和转化条件简单、无污染和分离纯化方便等优点，可为留体药物合成提供关键中间体，适合产业化应用。比较现有技术采用金龟子绿僵菌野生型菌株610或928在留体化合物19-去甲基-13-乙基-雄留-4-烯-3，17-二酮上引入11 α羟基(转化率36%)的报道，本发明所 述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490不仅能在19-去甲基-13-乙基-雄留-4-烯-3，17-二酮上引入Ila羟基，且转化率更高达50 %，并且也能在雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄留-I，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入Ila羟基，具有更广泛的底物选择性，而且培养条件更加简单，操作方便。
图 I 是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M 2011240在PDA平板上的形态。图 2 是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M 2011240对19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17- 二酮的11 α羟化产物薄层扫描图谱，其中峰I为产物，Rf为O. 30 ;峰2为底物，Rf为O. 50。图 3 是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M 2011240对雄留-4-烯-3，17- 二酮的11 α羟化产物HPLC图谱，其中峰I为产物，峰2为底物。
具体实施例方式实施例I :筛选金龟子绿僵菌突变株采用硫酸二乙酯和紫外线对出发菌株金龟子绿僵菌野生型菌株610进行联合诱变筛选。硫酸二乙酯处理工作原液0.05mL硫酸二乙酯(DES)溶于少量无水乙醇内，再加入适量0. 25MTri s-HCl ρΗ7· 2缓冲液，使其浓度为0. 5%0菌液5mL无菌水洗下斜面孢子，转移至盛有5mL无菌水和玻璃珠的三角烧瓶内，振摇40min，用脱脂棉过滤备用。取DES工作原液7mL和3mL菌液，于无菌试管内混合，最后浓度为0. 35%，28°C振摇8h，稀释涂皿，摇瓶筛选活力高的单菌落斜面保存。紫外线(UV)处理取4mL0. 3%的吐温80溶液，加入斜面刮下孢子，转移至盛有30mL0. 3%吐温80和玻璃珠的三角瓶内，置旋转式摇床250r/min条件下,振荡15min,桑皮纸过滤备用。将上述菌液进行不同时间UV处理(距离30cm，电磁搅拌)，取样进行系列稀释，采用固体稀释法进行活细胞平板计数。计算公式为存活率)=照射后每毫升活细胞数/照射前每毫升活细胞数。细胞致死率为95 99%时，正突变率最高。因此采用紫外照射3min，细胞致死率为99%的条件进行诱变育种。将诱变后的菌液经稀释调整浓度，涂于含O. 1%氯化锂的平板上，置27 °C黑暗条件下，培养7 10天，经摇瓶初筛、复筛、精筛，获得一株11 α羟化能力强的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490,斜面保存；该突变株于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，保藏号为CCTCC M2011240。实施例2 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240的特征和稳定性经过形态学观察的特征为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28°C培养4 5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7 10天呈橄榄石灰色。分生孢子梗短而直，分枝或单生。从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落常聚成黑色块状物结构。在液体摇瓶生长培养时，呈分叉状大型营养菌丝，进而能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2. 5 3. 75X5. 6 8. O μ m0根据形态学观察，筛选到的具有留体化合物Ila羟化活性的菌株为绿僵菌属的菌株。实验结果比较，其对19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯_3，17- 二酮的11 α羟化转化率为50%，比出发菌株高约14%，该高转化率的绿僵菌属菌株为金龟子绿僵菌突变株。金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490经连续4次传代，经种子、发酵、转化，测定其转化率，从结果可知，菌种代数之间菌体重量与转化率变化不大，说明该突变株性状稳定。留体底物经突变株转化后，将发酵全液、上清液及菌体经乙酸乙酯抽提后TLC分析，证明转化产物分泌到胞外，而未作用的底物留在菌体内部，因此菌体和上清液可以分别进行目的性分离。实施例3 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240对19-去甲基-13-乙基-雄甾_4_烯-3，17-二酮的Ila羟化反应(I)菌种选择金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCCM2011240 ；(2)斜面培养将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0. 25%的蚕蛹粉，28 °C培养7天；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(含质量百分比3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、0. 5%的蚕蛹粉，pH6. 5)的250mL摇瓶中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时，制得种子液；(4)扩大培养以10%的体积比的接种量将种子液接种于质量百分比为3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、0.5%的蚕蛹粉，pH6. 5的液体培养基中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时；(5)甾体转化将待转化的甾体底物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯_3，17- 二酮预先溶于含质量百分比为1%的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2%的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。(6)产物分析取发酵液2mL加入ImL乙酸乙酯浸泡,取有机相点样与GF254娃胶板，展开剂(石油醚丙酮7 4)层析分离后，薄层扫描分析产物含量，转化率达50%，发酵液的薄层扫描色谱图如图2所示。(7)分离产物将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的留体底物Ila羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化留体底物。实施例4 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M·2011240对雄甾-4-烯-3，17- 二酮的11 α羟化反应(I)菌种选择金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240 ；(2)斜面培养将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为O. 25%的蚕蛹粉，28 °C培养7天；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(含质量百分比3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、O. 5%的蚕蛹粉，pH6. 5)的250mL摇瓶中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时，制得种子液；(4)扩大培养以15%的体积比的接种量将种子液接种于质量百分比为3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、O. 5%的蚕蛹粉，pH6. 5的液体培养基中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min培养44小时；(5)留体转化将待转化的留体底物雄留-4-烯-3，17-二酮预先溶于含质量百分比为1%的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2%的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。(6)发酵液用1/2体积乙酸乙酯抽提，取30mL乙酸乙酯提取液，减压蒸干后，用5mL甲醇溶解，将溶解液高速(12000r/min)离心lOmin。准确移吸取上清液lmL，用甲醇稀释30倍,0. 45 μ m滤膜过滤,作为测定样液进行HPLC分析,选择C18 (Waters Symmetry,4. 6mmX 150mm, 5 μ m)柱，甲醇水4 : I作为流动相，流速为O. 7mL/min,检测波长254nm,柱温30°C。底物与产物保留时间分别为7. 5min和5. 5min，转化率为60%。发酵液的HPLC图谱如图3所示。(7)分离产物将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的留体底物Ila羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化留体底物。实施例5 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240对雄甾-1，4- 二烯-3，17- 二酮的11 α羟化反应(I)菌种选择金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490CCTCC M2011240 ；(2)斜面培养将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为O. 25%的蚕蛹粉，28 °C培养7天；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(含质量百分比3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、O. 5%的蚕蛹粉，pH6. 5)的250mL摇瓶中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时，制得种子液；(4)扩大培养以10%的体积比的接种量将种子液接种于质量百分比为3%的葡萄糖、2%的黄豆粉、O. 5%的蚕蛹粉，pH6. 5的液体培养基中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时；(5)留体转化将待转化的留体底物雄留-1,4- 二烯-3，17- 二酮预先溶于含质量百分比为1%的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2%的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。(6)产物分析取发酵液2mL加入ImL乙酸乙酯浸泡,取有机相点样与GF254娃胶 板，展开剂(石油醚丙酮7 4)层析分离后，薄层扫描分析产物含量，转化率达40%。(7)分离产物将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的留体底物Ila羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化留体底物。
权利要求
1.金龟子绿僵菌突变株，其特征在于该菌株为金龟子绿僵菌突变株(Metarhiziumanisopliae) 11490，保藏号为 CCTCC M 2011240，保藏日期为 2011 年 7 月 7 日。
2.如权利要求I所述的金龟子绿僵菌突变株，其特征在于，其具有如下生物学特征 马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，28°C培养4 5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7 10天呈橄榄石灰色；分生孢子梗短而直，分枝或单生，从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落聚成黑色块状物结构；液体摇瓶生长培养中，呈分叉状大型营养菌丝，能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2. 5 3. 75X5. 6 8. O μ m。
3.权利要求I或2所述的金龟子绿僵菌突变株在留体化合物11α羟化反应中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的甾体化合物包括但不限于19-去甲基-13-乙基-雄留-4-烯-3，17-二酮或雄留-4-烯-3，17-二酮及雄留_1，4_ 二烯-3，17-二酮。
5.一种留体化合物11 α羟化反应方法，其特征在于采用权利要求I的金龟子绿僵菌突变株在留体化合物上引入Ila羟基，其包括步骤 (1)菌种选择金龟子绿僵菌突变株(Metarhiziumanisopliae) 11490CCTCCM2011240 ； (2)斜面培养将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，其中添加质量百分比为O. 25%的蚕蛹粉，26 30°C培养5 10天； (3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基的250mL摇瓶中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min培养24 60小时，制得种子液， 所述的培养基中，含质量百分比I 3%的葡萄糖、I 3%的黄豆粉、O. 25 1%的蚕蛹粉，ρΗ6· O 7. O ; (4)扩大培养以5 15%的体积比的接种量将种子液接种于步骤(3)所述的液体培养基中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min培养24 60小时，得发酵液； (5)甾体转化将待转化的留体底物预先溶于含质量百分比为1%的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比I 3%的投料量投入经步骤(4)培养获得好的发酵液中，26 30°C条件下，旋转式摇床220r/min转化48 96小时，得发酵液； (6)分离产物将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的甾体底物Ila羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化留体底物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)、(4)或(5)中的菌种培养或转化温度为28°C。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中的培养基中，含葡萄糖的浓度质量百分比为3%，黄豆粉的浓度质量百分比为2%，蚕蛹粉的浓度质量百分比为O. 5%。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中菌体培养时间为44 50小时。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中菌体培养pH值为.6. 5ο
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中底物投料量为质量百分比2%。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中转化时间为66 78小时。
全文摘要
本发明属微生物及化学合成领域，具体涉及一株金龟子绿僵菌突变株Metarhizium anisopliae11490及其在甾体化合物羟化反应中的应用，所述的金龟子绿僵菌突变株于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011240。采用所述的突变株进行羟化反应，包括斜面培养，种子培养，扩大培养，甾体转化，产物分离等步骤。该突变株能在甾体化合物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入11α羟基，具有广泛的甾体底物选择性。本发明的方法具有转化率高、无污染、培养方法简单易操作的优点，能为甾体药物合成提供关键中间体，具有很大的应用前景。
文档编号C12N1/14GK102876582SQ201110199550
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者叶丽, 冯美卿, 史济平 申请人:复旦大学