专利名称：一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制剂领域，尤其是一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法。
背景技术：
丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是对宿主有益的正常微生物，经特殊工艺而制成的制剂，通过动物消化道中生物的竞争性排斥作用，可抑制有害菌生长， 形成优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，可达到调整体内微生态平衡的目的，进而促进动物生长及提高饲料转化率，降低粪便的臭味。在使用抗生素的弊端日益凸显的背景下，丁酸梭菌活菌制剂所具备的诸多优势使其在预防治疗肠道疾病中具有重要意义。直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。目前直投式丁酸梭菌发酵剂的应用国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种操作简单、活菌含量很高， 活力高，接种量小的直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法。本发明实现目的的技术方案如下一种直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，包括丁酸梭菌种子培养、丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L 蛋白胨1. 75-2 ；葡萄糖0. 5，MgSO4O. 02、 K2HPO4O. 5、MnSO4O. 02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为离心转速5000r/min，离心 lOmin，离心温度为4°C，冻干保护剂为10% g/ml脱脂奶粉+10% g/ml麦芽浸出液。而且，所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为CGMCCNo. 47 ，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。而且，所述种子培养条件为pH7. 4，培养16小时，培养温度为37°C厌氧培养。而且，所述直投式丁酸梭菌发酵剂中丁酸梭菌的存活率为94.6%，活菌数为 3. 92X10lclcfu/g。而且，所述直投式丁酸梭菌发酵剂按1%。的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为 10. 2X109cfu/mL。而且，直投式丁酸梭菌发酵剂按1%。的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为 10. 5X109cfu/g。一种直投式丁酸梭菌发酵剂，其特征在于包括冻干保护剂和丁酸梭菌，所述冻干保护剂为10% g/ml脱脂奶粉+10% g/ml麦芽浸出液。而且，所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum,保藏编号
3为CGMCCNo. 47 ，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的优点和积极效果是1、本发明中丁酸梭菌TK2菌株通过补料分批发酵高密度放大培养后，采用冷冻干燥法制备菌体发酵剂，用本方法生产的直投式丁酸梭菌发酵剂的存活率为94. 6%，活菌数为3. 92X101(lCfU/g，按照1%。的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。2、本发明首次采用冷冻干燥法制备直投式厌氧型丁酸梭菌发酵剂，与原液态种子接种相比，发酵剂接种量小，直接使用，节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便，产品品质稳定等优势。3、本发明确定了丁酸梭菌在浓缩过程中采用离心转速5000r/min，4 °C下离心 lOmin，离心得率为92. 32%。4、本发明确定了菌体冷冻干燥过程中保护剂为10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液， 最终丁酸梭菌冻干存活率为94. 6%，活菌数为3. 92X 101(lCfU/g。5、采用本发明方法制备的直投式丁酸梭菌发酵剂按1%。的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为10.2X109cfu/mL，采用本发明方法制备的直投式丁酸梭菌发酵剂按1%0 的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为10. 5X109cfu/g。6、本发明制备的丁酸梭菌发酵剂具有以下优点活菌含量很高，活力高，因而接种量小；能直接使用，避免了繁冗的扩大培养过程，既节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便；易于控制生产工艺，产品品质稳定；经简单复水处理后可直接作为种子菌株应用。
图1为本发明200L发酵罐生长曲线；图2为本发明单一保护剂对丁酸梭菌冻干存活率的影响，(注1水平各保护剂浓度为脱脂奶粉10 %，可溶性淀粉10 %，麦芽浸出液10 %，蔗糖10 %，甘油1 %，抗坏血酸
水平各保护剂浓度为脱脂奶粉15%，可溶性淀粉15%，麦芽浸出液15%，蔗糖15%， 甘油2%，抗坏血酸2% )；图3为本发明复合保护剂对丁酸梭菌冻干存活率的影响，(注1号10%脱脂奶粉；2号10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液；3号10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液+1 %甘油； 4号10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液+1%抗坏血酸；5号10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液 +10%蔗糖)；图4为本发明直投式丁酸梭菌发酵剂液态发酵接种效果比较；图5为本发明直投式丁酸梭菌发酵剂固态发酵接种效果比较。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种丁酸梭菌TK2，分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为CGMCC No. 47 ，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，以下叙述均基于该菌株。1.种子及发酵培养基液态种子及发酵培养基(% )蛋白胨1. 75-2 ；葡萄糖0. 5，MgSO4O. 02,K2HPO4O. 5、 MnSO4O. 02，ρΗ7· 4。2.菌体的种子制备将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的试管中，37°C静置厌氧培养16h。3.菌体的液态深层发酵培养将培养至对数期中期的液体种子以5%的接种量接到装液量为200mL的250mL平底烧瓶中，于37 士 1 °〇静置培养16h。4.菌体的高密度放大培养(1)50L种子罐培养以8%的接种量将丁酸梭菌接种于起始装液量为40L的种子罐中，补料后进行轻微搅拌，于38 士 0. 5°C静置培养16h。(2) 200L发酵罐培养以5 %的接种量将丁酸梭菌接种于200L罐进行发酵培养，装液量160L，于 38士0. 5°C培养18h。采用蠕动泵添加2mol/L的NaOH溶液调节pH，使之维持在5. 8以上，发酵采用静置补料分批发酵，补料后进行轻微搅拌，添加0. 3%重量百分比的豆油作消泡剂。5.离心分离采用离心法浓缩分离菌体，分离条件为5000r/min离心lOmin，离心温度为4°C。离心效果测定
权利要求
1.一种直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于包括丁酸梭菌种子培养、 丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L 蛋白胨1. 75-2 ；葡萄糖 0. 5，MgSO4O. 02、K2HPO4O. 5、MnSO4O. 02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为离心转速 5000r/min，离心lOmin，离心温度为4°C，冻干保护剂为10% g/ml脱脂奶粉+10% g/ml麦芽浸出液。
2.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为CGMCC No. 4729，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述种子培养条件为PH7. 4，培养16小时，培养温度为37°C厌氧培养。
4.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述直投式丁酸梭菌发酵剂中丁酸梭菌的存活率为94. 6%，活菌数为3. 92X 101(lCfU/g。
5.根据权利要求5所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述直投式丁酸梭菌发酵剂按1%。的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为10. 2X109cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于直投式丁酸梭菌发酵剂按1%。的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为10. 5X109cfu/g。
7.一种直投式丁酸梭菌发酵剂，其特征在于包括冻干保护剂和丁酸梭菌，所述冻干保护剂为10% g/ml脱脂奶粉+10% g/ml麦芽浸出液。
8.根据权利要求7所述的直投式丁酸梭菌发酵剂，其特征在于所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为=CGMCC No. 4729，保藏日期2011年 4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
全文摘要
本发明涉及一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法，包括丁酸梭菌种子培养、丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为离心转速5000r/min，离心10min，离心温度为4℃，冻干保护剂为10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液。用本方法生产的直投式丁酸梭菌发酵剂的存活率为94.6％，活菌数为3.92×1010cfu/g，按照1‰的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。基于本菌株开发了一种新型高活性的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法应用于丁酸梭菌的发酵培养。
文档编号C12R1/145GK102334605SQ20111019912
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者刘菲菲, 戚薇, 李安东, 王海宽 申请人:天津科技大学