专利名称：水稻通气组织形成关键基因OsLSD2 的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及水稻通气组织形成关键基因0sLSD2的应用。
背景技术：
氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中很多生命物质的组成成分，比如氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干重的 1. 5-2%和植物总蛋白的 16% (Frink CR. , Waggoner ΡΕ. and Ausubel JH. Nitrogen fertilizer :retrospect and prospect. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1999. 96 :1175 1180.)。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30% (彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh,Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002，35 (9) :1095 1103.)，成为世界第一大消费国。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70%。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。水稻虽然喜铵作物， 但是已经有研究表明一定量的硝态氮能够促进水稻对铵的吸收，而且在水稻生长发育的后期田里和旱作水稻主要以硝态氮为主。水稻的根系发育受硝酸盐调控，其中主要硝酸盐促根系生长的机制是硝酸盐调控了生长素的运输分布。近年来，分子生物学技术的发展很快， 为作物遗传与育种工作提供了新的手段。人们也十分重视用生物学方法来提高氮肥利用率以解决氮肥问题。与其他水生作物一样，水稻根系的泌氧过程是其能在厌氧环境中生长的必需过程，这种泌氧过程必然导致水稻根际发生不同程度的硝化作用，在根表和根际产生的硝酸盐如果能被根系迅速吸收，就会对作物的氮素营养和其他生理过程产生刺激作用， 从而显著促进作物生长发育。我们的试验结果表明(Li et al.，2008)氮高效品种扬稻6 号通过其发达的通气组织分泌出更多的氧气，与对照氮低效品种农垦57相比，其根表富集更多硝化细菌产生了更多的硝酸盐，从而氮高效水稻杨稻6号在同等水田中表现出地上积累更多的硝酸盐和总氮，氮素利用酶活显著高于对照农垦57。最终产量和氮素利用效率杨稻7号都显著高于农垦57。但是，如果根表的硝酸盐如果不能被根系迅速吸收，就没有这些刺激作用，而且，这些硝酸盐就会反硝化作用而损失掉。我们的研究表明氮高效品种杨稻7 号不仅具有了发达的通气组织同时其吸收(Fan et al 2005)和再利用硝酸盐(Fan et al 2007)的能力都显著高于农垦57。这说明氮高效水稻品种是在那些从陆生到水生过程中自身进化和适应能力最佳的品种，它们不但已经在组织形成时表现出进化或适应性的优势， 同时也优化或保留了更多陆生氮素吸收利用特征。通气组织(aerenchyma)是植物薄壁组织内一些气室或空腔的集合。许多水生和湿生植物在根茎内均形成通气组织，其它一些植物在缺氧环境中也分化产生或加速通气组织的发育(Watkin等，1998)。在淹水条件下，水稻通过形成通气组织增加气体导度 (Miyamoto et al2001)，根基部诱导产生防止氧气外溢的隔层(Colmer，2003)，从而延长氧气向根尖方向传递。但不同水稻品种表现出很大差异。COlmeH200;3)在比较7个旱稻，3 个水稻和2个耐深水水稻品种的在淹水条件下通气组织与防止氧气外溢的隔层的形成差异，发现，部分旱稻根基部不能形成防止氧气外溢的隔层，且根尖的氧气外泌存在着显著的品种差异。Seago et al. (2005)、Evans et al. ^00 都对通气组织的形成和分类进行的综述。与裂生性通气组织相比，溶生性通气组织的研究相对较多。溶生性通气组织形成受细胞编程性死亡(PCD)控制(Gimawardena A，2008综述)。水稻根系中髓部，大规模的细胞自溶几乎使所有的中心细胞消失，形成空心，气体运输受到的阻力减小到最小(Delia 等，1999)。一般认为细胞死亡发生在皮层的中部。透射电镜观察玉米皮层细胞的结果表明，液泡的解体是最早看到的物理过程(Campbell & Drew，1983)。水稻细胞的中胶层变化似乎更早，缺氧Id内即可看到其结构发生变化，细胞壁解体在整个细胞解体之前(Webb & Jackson, 1986) 0 Kawai等(1998)研究水稻根的细胞学发现细胞酸化是后来细胞解体的较早标志。这意味着液泡膜损伤释放出的酸性内含物会导致质膜完整性的破坏。不同于木质部的形成，通气组织细胞壁是完全降解的(Gimawardena et al 2001)。这可能与木葡聚糖转葡萄糖苷酶xet基因，丙酮酸脱羧酶pdc基因，磷酸甘油脱氢酶gpc基因等有关 (Subbaiah & Sachs，2003)。Muhlenbock et al 2007 利用拟南芥 lsdl，edsl，pad4_5 单突变体以及edsl/lsdl，pad4-5/sdl双突变体研究在低氧条件下通气组织形成和乙烯的合成，认为LSDl基因负控制EDSl和PAD4-5基因的表达，而EDSl和PAD4-5基因又正调控乙烯的合成和低氧条件下根系通气组织的形成。水稻中从PBZl基因的表达部位来看该基因参与水稻的PCD，包括叶片衰老与根系的通气组织形成，通过突变该基因发现该基因参与了 DNA Ladder形成，与所有发生PCD的细胞都表达(Kim et al 2008)。
发明内容
本发明的目的是提供水稻通气组织形成关键基因0sLSD2的应用。本发明的目的通过如下技术方案实现水稻控制通气组织形成的关键基因0sLSD2在增加植物株高、提高植物氮肥利用效率和/或产量方面的应用，该基因的序列登录号为AKl 11759。其中，所述的植物优选单子叶植物，进一步优选水稻、玉米或小麦，特别优选水稻。水稻控制通气组织形成的关键基因0sLSD2的编码产物水稻通气组织形成关键蛋白0sLSD2在增加植物株高、提高植物氮肥利用效率和/或产量方面的应用。本发明的有益效果1、本发明通过系统研究，首次提供了水稻生长素运输蛋白基因0sLSD2的生物学功能。2、利用特异引物研究0sLSD2在水稻中的表达，发现0sLSD2在地上、地下部均表达 (图1)，将0sLSD2超表达后提高了氮素利用效率(表1)。3、0sLSD2超表达后增大了水稻的株高与分蘖数，有利于改善水稻株型(图4)使产量得到提高30%以上(表2)。本发明通过转基因手段获得的0sLSD2超表达材料使得0sLSD2在叶片表达大量增加(图2)，由此使水稻植株根系的通气组织发生变化，与对照野生型相比，转基因材料获得了更高大的植株，有利于水稻对养分尤其是氮素的吸收和利用，提高氮素利用效率。
图10sLSD2在水稻不同部位(叶片，根)表达特征，其中，1 根2 叶片。图20sLSD2超表达材料(0_1、0_2、0_3、0_4)的分子鉴定，四个超表达株系在叶片
中表达量比野生型明显增强。图30sLSD2超表达材料southern拷贝数的鉴定，其中，WT 野生型，CK 空白对照；0-1、0-2、0-3、0-4 分别表示0sLSD2超表达材料。图40sLSD2超表达材料(04)与野生型(武育粳7)相比株高提高、分蘖数增多。图50sLSD2超表达材料(04)与野生型(武育粳7)通气组织显微图片。其中，WT 野生型，0-4 表示0sLSD2超表达材料，右侧图片为距根尖Icm处的通气组织显微图片，左侧为距根尖1. 5cm处的通气组织显微图片。
具体实施例方式实施例10sLSD2基因(登录号为AKl 11759)在水稻中表达特征1)总RNA的提取水稻武育粳7号种子经质量比30% NaCLO2消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5. 5的1/2国际水稻所IRRI 营养液中，四叶一心时换为国际水稻所IRRI全营养液(Mao D R. The methods of plant nutrition research. Beijing :Bei jing Agricultural University Press, 1994.),培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0. Ig左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入Iml iTrizol试剂，加入0. 2mL氯仿，离心后吸取上清，加入 0. 5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1%0)， 用质量比为1. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；2)总cDNA合成每个RNA样品2 μ g，加入50 μ molL^Oligo dT18，加体积比 1% DEPC水补足10 μ L, 70°C下水浴5min,冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor
0.5 μ L 禾口 5xRT buffer5 μ L, IOmM dNTP 2. 5 μ LjM-MLV 反转录酶 1 μ L,体积比 1%0 DEPC 水补足25yL，42°C水浴60min后，70°C水浴IOmin终止反应(Oligo dT18由南京金思瑞公司合成；反转录试剂盒购自！^ermentas公司，Canada)。3)半定量PCR反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为 20 μ L，包含 IOpmoir1 正、反向引物各 1 μ L，IOx PCR buffer 2μ L,2. 5mM dNTP
1.6 μ L，Taq酶0. 4 μ L，然后用灭菌水补足20 μ L (引物由南京金思瑞公司合成；PCR试剂购自Takara公司，大连)。加模板量因其浓度不同而不同，由内参基因水稻细胞骨架蛋白基因 (OsActin)的量来校正，基因OsActin与0sLSD2的PCR程序如下94°C预变性4min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，30个循环后，72°C 7min,扩增的PCR产物通过质量比为 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。通过澳化乙淀(EB)染色后，在凝胶成像系统成像。基因的序列号和引物设计如下表基因名称序列号引物序列产物长度OsActinNM_197297F:5'-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3' (SEQ ID NO. 1)750bp (*)R:5'- AGTCTCATGGATACCCGCAG-3‘ (SEQ ID NO. 2)OsLSDZAK111759F:5'- GTCTCGTCTCCTTCCTGCTG -3，(SEQ ID NO. 3)495bpR:5'- GGCGTTCATACTTTCCTTTG -3' (SEQ ID NO. 4)* 参考文献，Xiaorong Fan, Lijun Jia, Yilin Li, Susan J. Smith, Anthony J Millerand Qirong Shen,2007 Comparing nitrate storage and remobilization in two ricecultivars that differ in their nitrogen use efficiency, Journal of Experimental Botany58(7) :1729-40通过对该基因在水稻不同部位(叶片，根)进行表达分析发现0sLSD2在根、叶片中均表达，而在叶片中表达量高于根部(图1)。实施例20sLSD2基因的超量表达植株1)总RNA的提取同实施例1 ；2)总cDNA合成同实施例1 ；3) 0sLSD2基因的cDNA全长的获得用以上获得的水稻武育粳7号总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的0sLSD2阅读框(从起始密码子ATG至3’端非编码区)，引物序列为0verLSD2-F 5，-TTGAGGATCCGTGCCATTTACACCTC-3，(SEQ ID N0. 5，含 BamH I 酶切位点)0verLSD2-R :5，-ATATGGTACCACAGACCTTGCGCCAT-3，(SEQ ID N0. 6，含 Kpn I 酶切位点)PCR 20yL 体系2yL 2. 5mM dNTP，2uL IOx PCR buffer, 1 μ L 0verLSD2-F, 1 μ L0verLSD2-R,1 μ L cDNA,13 μ L ddH20。PCR程序如下94°C预变性％iin，98°C变性10s，68°C复性延伸2min，30个循环后，72°C lOmin，扩增的PCR产物通过质量比1 %琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为822bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与pMD-19载体连接，酶连体系总体积 ο μ L，包含5μ L连接液，1 μ L的pMD_19载体，3_4μ L的PCR纯化产物， 用水补足10 μ L，然后16°C连接过夜；再转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中涂在含有安苄 100 μ gmL-1的LB固体培养基上生长l i-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，0sLSD2基因登录号为AK111759，0sLSD2的cDNA全长序列包括开放阅读框(ORF) 552bp及3，端非编码区UTR270bp ；将测序正确的菌液加入等体积体积比30%甘油于_70°C保存备用，获得含有目的基因0sLSD2cDNA全长序列的重组质粒，命名为0LSD2-T ；4)超量表达载体pW3i-LSD2的构建用以上获得的0LSD2-T质粒为模板，0verLSD2-F(SEQID NO.幻和0verLSD2_R(SEQ IDN0.6)为引物，进行PCR扩增0sLSD2基因片段，PCR程序如下:94°C预变性％iin，98 °C 变性10s，68°C复性延伸2min，30个循环后，72°C lOmin，扩增的PCR产物通过质量比
琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为822bp。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI、KpnI进行双酶切，同时双酶切植物过量表达载体 pCAMBIA1300(购于Biovector Science Lab co.)质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4°C下连接过夜，转化到大肠杆菌Dffia感受态细胞中，涂在含有卡那霉素 50 μ gmL-1的LB固体培养基上生长1 后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamH I,Kpn I酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积体积比30%甘油于_70°C保存，提取阳性克隆质粒命名为pW3i-LSD2 ；最后通过电击法将邱bi_LSD2质粒转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50 μ gmL-1的YEP固体培养基上生长4 后，挑取阳性菌落， 提取质粒，经BamH I,Kpn I酶切验证无误后，菌液加入等体积体积比30%甘油于_70°C保存，转基因备用。5)转基因植株的获得将以上获得的转有pW3i-LSD2质粒的农杆菌，侵染武育粳7号水稻愈伤组织，共培养60天，经过选择培养、分化、生根、炼苗得到Tl代转基因植株。5. 1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下6-BA(6-苄基腺嘌呤)；Car (羧苄青霉素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-DQ，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu (L-谷氨酰胺)；MES (2-吗啉乙磺酸)； N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA (AA大量元素成份)；Agar (琼脂)。5. 2)溶液与培养基配方1) N6培养基母液每升含量OO倍)
权利要求
1.水稻控制通气组织形成的关键基因0SLSD2在增加植物株高、提高植物氮肥利用效率和/或产量方面的应用，该基因的序列登录号为AKl 11759。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物为单子叶植物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的植物为水稻、玉米或小麦，优选水稻。
4.所述的水稻控制通气组织形成的关键基因0sLSD2的编码产物水稻通气组织形成关键蛋白0sLSD2在增加植物株高、提高植物氮肥利用效率和/或产量方面的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，公开了水稻通气组织形成关键基因OsLSD2的应用。水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD2能在增加植物株高、提高植物氮肥利用效率和/或产量方面应用，该基因的序列登录号为AK111759。本发明通过系统研究，首次提供了控制通气组织形成的关键基因OsLSD2的生物学功能。本发明通过转基因手段获得的OsLSD2超表达材料使得OsLSD2在根系叶片表达大量增加，由此使水稻植株根系的通气组织发生变化，与对照野生型相比，转基因材料获得了更高大的植株，有利于水稻对养分尤其是氮素的吸收和利用，提高氮素利用效率和增加单株产量30％以上。
文档编号C12N15/84GK102260709SQ20111020043
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者徐国华, 朱静雯, 沈其荣, 范晓荣 申请人:南京农业大学