糖、麦芽糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油，例如转 化成发酵性糖。因此，本发明的细胞可表达一种或多种酶，如将纤维素转化成葡萄糖单体和 将半纤维素转化成木糖和阿拉伯糖单体所需的纤维素酶（内切纤维素酶或外切纤维素酶）、 半纤维素酶（内切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶），能够将果胶转化为葡萄糖醛酸和半乳糖 醛酸的果胶酶或将淀粉转化为葡萄糖单体的淀粉酶。
[0315]酵母细胞还优选包含将丙酮酸盐/酯转化为期望发酵产物，如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙 烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的那些酶活性。
[0316] 本发明的一种优选细胞是天然能够酒精发酵，优选能够厌氧酒精发酵的细胞。本 发明的细胞优选具有对乙醇的高耐受性、对低pH(即能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH 下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物如糠醛和羟甲基糠醛的高耐受性 和/或对升高温度的高耐受性。
[0317] 本发明的细胞的任何以上特征或活性可天然存在于酵母细胞中或可通过遗传修 饰引入或修饰。
[0318] 本发明的细胞可为适于生成乙醇的细胞。然而，本发明的细胞可适于生成除乙醇 外的发酵产物。此类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生成的 任何散制(bulk)或精炼化学药品。
[0319] 发酵方法优选在对于酵母细胞而言最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或 真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42°C，优选低于约38°C的温度下进行。对于酵母或丝 状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选在低于约35°C、约33°C、约30°C或约28°C的温度下和在 高于约20°C、约22°C或约25°C的温度下进行。
[0320] 该方法中木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选为至少约50%、约60%、约70%、约 80%、约90%、约95%或约98%。本文将乙醇产率定义为理论最高产率的百分比。
[0321 ]本发明还涉及一种用于生产发酵产物的方法。
[0322]该发酵方法可按分批、分批补料或连续模式进行。也可应用单独水解发酵(SHF)方 法或同时糖化发酵(SSF)方法。为了最佳生产率，这些发酵方法模式的组合也是可行的。
[0323] 根据本发明所述的发酵方法可在需氧和厌氧条件下进行。优选地，该方法在微需 氧或限氧条件下进行。
[0324] 本文将厌氧发酵方法定义为在无氧或其中基本不消耗氧，优选低于约5mmol/L/h、 约2.5mmo 1 /L/h或约lmmo 1 /L/h的情况下进行的、其中有机分子用作电子供体和电子受体两 者的发酵过程。
[0325] 限氧发酵方法是其中耗氧受到从气体到液体的氧传递限制的方法。限氧程度由进 气气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。优选地，在限氧条件下的 方法中，耗氧速率为至少约5.5mmol/L/h，更优选为至少约6mmol/L/h，如至少7mmol/L/h。本 发明的方法包括回收发酵产物。
[0326] 为了回收发酵产物，使用现有的技术。对于不同发酵产物而言，不同的回收方法适 合。从含水混合物回收乙醇的现有方法通常使用分馏和吸附技术。例如，蒸馏釜可用于加工 在含水混合物中含有乙醇的发酵产物，以生成富含乙醇的混合物，然后进行分馏(例如，分 级蒸馏或其它类似技术）。接下来，含有最高浓度的乙醇的级分可通过吸附器以从乙醇中去 除大部分(若非所有)剩余的水。
[0327] 本说明书中引用的所有专利和文献参考的全部内容据此通过引用并入。
[0328] 提供以下实施例仅仅是为了说明性目的，而非旨在以任何方式限制本发明的范 围。 实施例
[0329] 为了在速率和量上提高甘油和乙酸两者的厌氧（共）转化，试验了替代性基因组 合。对于途径中的多个酶，即甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和乙醛脱氢酶，试验了能够进一 步增强酵母菌株在厌氧条件下除戊糖和己糖外将甘油和乙酸转化成乙醇的能力的多个替 代基因。
[0330] 表8中给出了选定酶候选物。
[0331] 编码期望酶活性的选定酶候选物和参照蛋白质序列(表中给出了SEQ ID N0)
[0332]
[0334] 如TO 2008/000632中所述，基因经密码子对优化以在S.cerevisiae中最佳表达。 表8中指出了蛋白质序列的SEQ ID NO:。
[0335] 定义了四个类别的基因：A)AADH组，由SEQ ID N0:l-5组成；B)ACS组，由SEQ ID NO:6组成；C)GLD组，由SEQ ID NO:7-10组成和D)DAK组，由SEQ ID NO:11-14组成。
[0336] 制备了表达构建体，允许每个基因以高水平和以中等/低水平表达。
[0337] 对于A组而言，选择TDH3-和TDH1-启动子(分别为SEQIDN0:15和16)。就一切情况 而论，这些基因的终止子均为PGK1-终止子(SEQ ID N0:17)。
[0338] 对于B组而言，选择PGK1-和PRE3-启动子(分别为SEQIDN0:18和19)。就一切情况 而论，这些基因的终止子均为PGI1-终止子(SEQ ID N0:20)。
[0339] 对于C组而言，选择EN01-和ACT1-启动子(分别为SEQ ID NO: 21和22)。就一切情况 而论，这些基因的终止子均为CYC1-终止子(SEQ ID N0:23)。
[0340] 对于D组而言，选择TPI1-和ATG7-启动子(分别为SEQIDN0:24和25)。就一切情况 而论，这些基因的终止子均为EN01-终止子(SEQ ID N0:26)。
[0341 ] 如表9中所示，总计，组装了 28个不同的表达盒。
[0342] 表9:骨架质粒载体中产生的所有组装表达盒(ASS)概述（详情请参见材料和方 法）。第一个SEQ ID N0:定义所用的启动子，第二个SEQ ID N0:定义0RF，而第三个SEQ ID NO:定义转录终止子。生成ASS号以便更易参照。
[0343]
[0344]
LuJ40j 卯囹2屮尸/r油纭，便用仕母TW異共仴按大的引籾，旭过項狃莰衣込显 (ASS)。为PCR产物指定CAS。如图2中所描绘，CAS元件与整合侧翼和/或另一 CAS和/或选择标 记部分重叠，在引入感受态酵母细胞后，允许遗传元件重组到转化感受态酵母菌株的基因 组中。
[0346] 在多因子途径设计中，使用专利申请PCT/EP2013/056623中描述的技术，组合出四 个类别(A、B、C和D组）的独立成员的所有可能组合。产生总共1280种不同的可能表达盒组合 并且用于转化菌株RN1069，gpdlgpd2双缺失菌株(参见材料和方法）。
[0347] 如图2中所描绘，在多因子途径设计中包括抗生素抗性标记，以使得选择已经通过 重组成功地将期望途径整合到其基因组中的酵母转化株成。选择标记的序列作为SEQ ID NO: 27给出。
[0348] 另外，在转化混合物中包括图2中命名为5'-ΙΝΤ1和3'-ΙΝΤ1的两个整合侧翼。在 PCR反应中使用宿主菌株的基因组DNA作为模板及I NT 1的5 侧翼的引物组合SEQ ID N0:30 和31(图2)和3'-ΙΝΤ1侧翼的引物组合SEQ ID N0:42和43(图2)，生成这些两个侧翼区的序 列。
[0349] 材料和方法
[0350] 一般分子生物学技术
[0351] 除非另有说明，否则所用方法为标准生物化学技术。适合的通用方法教科书的实 例包括Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(1989)和Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley&Sons，Inc·〇
[0352] 培养基
[0353] 实验中使用的培养基是如实施例中所示补充了糖的YEP培养基（10g/l酵母提取 物、20g/1蛋白胨)或固体YNB培养基(6.7g/1酵母氮源、15g/1琼脂）。对于固体YEP培养基而 言，在灭菌之前向液体培养基中添加15g/l琼脂。
[0354] 在厌氧筛选实验中，使用矿质培养基。Verduyn等(Yeast(1992)，第8卷，501-517) 已经描述了矿质培养基的组成。然而，避免使用硫酸铵;相反，使用2.3g/l尿素作为氮源。另 外，添加麦角固醇(〇. 〇 1 g/L)、吐温80(Tween 80) (0.42g/L)和糖(如所示）。
[0355] 菌株RN1069的转化株(通过整合DNA构建体)为组氨酸营养缺陷型。
[0356] 菌株
[0357] 实验中使用的菌株为RN1041和RN1069。在W0 2012/067510中已经描述了RN1041。 该菌株具有以下基因型：
[0358] MAT a、ura3_52、leu2_l12、his3::loxP、gre3::ΙοχΡ、ΙοχΡ-ρΤΡΙ1::TALI、ΙοχΡ-pTPIl: :RKIUloxP-pTPIl-TKLUloxP-pTPIl-RPEU5： ：pADHl-XKSl-tCYCl-LEU2^5： ：URA3- pTPIl-xylA-tCYCl
[0359] MAT a =接合型a
[0360] 分别在URA3、LEU2和HIS3基因中的ura3-52、leu2-112、HIS3: :loxP突变。ura3-52 突变由Piromyces xylA过表达构建体上的URA3基因补充；leu2-112突变由XKS1过表达构建 体上的LEU2基因补充。HIS3基因的缺失产生组氨酸营养缺陷型。出于这个原因，RN1041需要 培养基中的组氨酸才能生长。
[0361] gre3::l〇xP是编码醛糖还原酶的GRE3基因缺失。去除标记后ΙοχΡ位点留在基因组 中。
[0362] ΙοχΡ-ρΤΡΙΙ指在本文描述的实验中，通过用TPI1基因的启动子置换天然启动子， 非氧化磷酸戊糖途径的基因的过表达。去除标记后组成型TPI1强启动子上游的ΙοχΡ位点留 在基因组中（Kuyper等，FEMS Yeast Research5(2005)925-934)〇
[0363] δ::意为在Tyl反转座子的长末端重复序列上重组后，构建体的染色体整合。
[0364] 菌株RN1001是菌株RN1041的亲本菌株，即在HIS3-基因缺失之前。
[0365] 菌株RN1069源自RN1041:通过基因置换破坏了GPD1和GPD2基因。为了这个目的，通 过PCR构建两侧是与正好在GPD1或GPD2的开放阅读框(0RF)旁边的序列同源的序列的显性 抗生素抗性标记，并用于转化菌株RN1041。这些基因破坏盒已经分别作为SEQ ID N0:28和 29包括在序列表中。在W02013/081456中也详细描述了菌株RN1069的构建。菌株RN1069的基 因型为：MAT a、ura3_52、leu2_l 12、his3 : : ΙοχΡ、gre3: : ΙοχΡ、loxP-pTPIl: : TALI、ΙοχΡ-pTPIl: :RKIUloxP-pTPIl-TKLUloxP-pTPIl-RPEU5： ：pADHl-XKSl-tCYCl-LEU2^5： ：URA3-pTPIl-xylA-tCYClgpdl::hphMX、gpd2::natMX。
[0366] 菌株RN1189用作参照菌株。在W02013/081456中描述了菌株RN1189。简言之，通过 用质粒PRN977转化菌株RN1069构建菌株RN1189。质粒pRN977为2μ质粒并且含以下特征：用 于选择转化株的HIS3-基因，E.coli中用于选择的氨苄青霉素抗性标记，来自于E.coli的在 PGK1-启动子和ADH1-终止子控制下的adhE-基因，来自于S.cerevisiae的在TPI1-启动子和 PGI1-终止子控制下的DAK1-基因和在ACT1-启动子和CYC1-终止子控制下的E.coli gldA-基因。所有启动子和终止子均来自于S.cerevisiae。
[0367] 菌株构建
[0368] 在专利申请PCT/EP2013/056623中描述了菌株构建方法。其描述了使得能够由多 个目标基因构建表达盒的技术，所述构建的方式使得这些盒组合成途径并且在该酵母转化 后整合到酵母基因组的特定位点。图2中描绘了示意图。
[0369] 首先，选择酵母基因组中的整合位点（例如，INT1)。使用PCR扩增整合位点上游和 下游部分约500bp的DNA片段，两侧为接头。这些接头是允许在酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)中转化后该途径正确体内重组的50bp序列。通过PCR产生目标基因以及选择抗 性标记(例如kanMX)，如图2中所示，在每个侧翼整合不同接头。酵母细胞经DNA片段转化后， 在期望位置发生体内重组并整合到基因组中。这种技术允许途径调谐，因为来自于该途径 的一个或多个基因可被其它基因或遗传元件置换，只要允许同源重组的接头保持不变(专 利申请PCT/EP2013/056623)。
[0370] 表达盒构建
[0371] 在DNA 2.0(Menlo Park，CA 94025，USA)合成开放阅读框(0RF)、启动子序列和终 止子。这些遗传元件的序列作为SEQ ID NO: 1直到且包括26列出。如Engler等(2011)和其中 的参考文献所述，使用Golden Gate技术组装启动子、0RF和终止子序列。组装的表达盒连接 到经Bsal消化的骨架载体中；A组(表2)连接到p5Abbn中（SEQ ID NO: 44); B组(表2)连接到 pBCbbn中（SEQ ID N0:45);C组（表2)连接到pCDbbn中（SEQ ID N0:46)且D组（表2)连接到 pD3bbn中（SEQ ID N0:47)。
[0372] 表达盒扩增
[0373] 使用描述为SEQ ID N0:30-43的引物(参见下文），通过PCR扩增如以上（"表达盒构 建"部分)所述产生的组装的表达盒、整合侧翼和选择标记。kanMX-标记，如同酵母中用于选 择的G418抗性标记，扩增自含有这种标记的质粒。将该标记的序列描述为SEQ ID N0:27。
[0374] 使用SEQ ID N0:30和31(5'-INT1侧翼）及42和43(3'-ΙΝΤ1侧翼），由来自于菌株 CEN. PK113-7D的基因组DNA扩增I NT 1 -侧翼。
[0375] 表10:用于由ASS(组装的表达盒)扩增CAS(具有用于在酵母中同源重组的重叠序 列的表达盒）的引物概述。使用相应编号(例如，CAS01来自于ASS01)。
[0376]
[0377] 酵母细胞的转化
[0378]根据Schiestl和Gietz(Current Genetics( 1989)，第16卷，339-346)描述的方法 进行酵母转化。
[0379] 微孔板中的厌氧生长实验
[0380]在平底NUNC微孔板(MTP)中进行生长实验。每个孔装满275μ1的培养基。培养基的 组成如下：
[0381] 矿质培养基(基于Verduyn等（1992)，尿素代替硫酸铵）
[0382] 2 %葡萄糖
[0383] 2 % 木糖
[0384] 1% 甘油
[0385] 2g/l 乙酸
[0386] 200μg/ml组氨酸(在为菌株RN1069和衍生株的情况下，其为his3: :1οχΡ)ρΗ 4.5
[0387] 所有MTP经铝密封物密封。然后将MTP置于厌氧培养箱（Infors)中。生长48小时后， 将MTP从厌氧Infors中取出。然后该板在微孔板离心机中在2750rpm下旋转10分钟。然后将 150μ 1上清液转移到适于NMR分析的MTP中。
[0388] NMR 分析
[0389]为了量化样品中的葡萄糖、木糖、甘油、乙酸和乙醇，向适合的小瓶中精确地转移 150μ1样品。随后添加 100μΙ内标溶液，其含有在D20中的马来酸（20g/l)、EDTA(40g/l)和微 量DSS (4，4-二甲基-4-硅戊烷-1 -磺酸）和450yL D20。
[0390] 在装备有冷冻探针的Bruker Avance III 700MHz上，使用脉冲程序，以水峰抑制 (功率相当于3Hz)在27°C的温度下记录1D咕NMR谱。
[0391]基于以下信号(δ相对于DSS)计算分析物浓度：
[0392] · 5.22ppm下的α-葡萄糖峰（d，0.38H，J = 4Hz)，
[0393] · 5.18ppm下的α-木糖峰（d，0.37H，J = 4Hz)，
[0394] · 3.55ppm下的甘油峰（(1(1，2!1，了1,2 = 6抱和了1￡1,：^=12抱）
[0395] · 1 · 91ppm 下的乙酸峰（s, 3H)
[0396] · 1 · 17ppm 下的乙醇峰（t, 3H, J = 7Hz)
[0397] ?标准的信号使用者：
[0398] · 6.05ppm下的马来酸峰(s,2H)
[0399] 实施例1
[0400] 酵母转化株的全部组合阵列的构建
[0401] 如上所述构建菌株的完整组合阵列。为了这个目的，用全部1280种基因混合物(见 上)转化菌株RN1069。将转化混合物铺板在含20g/l葡萄糖和200yg G418/ml的YEP-琼脂上。 [0402]从每种转化，选择两个独立转化株并转移到微孔板中的YEPD琼脂中（每孔1个菌 落）。在每个微孔板上，也接种了参照菌株:RN1189。
[0403] 实施例2
[0404] 生长实验和结果分析
[0405] 在材料和方法中描述的实验设置中试验所选菌落和菌株的阵列(实施例1)。
[0406] 简言之，具有YEro-琼脂的微孔板中的菌株用于接种微孔板中275μ1含200μg/ml组 氨酸、2 %葡萄糖、2 %木糖、1 %甘油和2g/l乙酸的矿质培养基。培养基的pH设为4.5，低于乙 酸的pKa。密封微孔板并且在厌氧条件下培育48小时。通过离心使细胞沉降并且通过NMR分 析上清液。表11中给出了前150个结果。
[0407]
[0408]
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413]
[0414]
[0415]
[0416]
[0417] 在图3中，根据残留甘油浓度绘制发酵液中的残留乙酸浓度。结果清晰地显示，在 残留甘油浓度和残留乙酸浓度之间存在强相关:发酵后残留甘油浓度越低，残留乙酸浓度 越低。这表明两种途径相互关联，正如已经在专利申请W02013/081456中所示。
[0418] 其中一个菌株消耗几乎所有乙酸（图3中左下角数据点）并且表现优于其它转化 株。该菌株命名为YD01247。
[0419] 总的来说，筛选2592个菌株，包括参照菌株RN1189。参照菌株RN1189被包括了27 次。图6中描绘了参照菌株RN1189相对于其它菌株(总共2592个)的性能。如前所述为菌株分 级，其中表现较良好的菌株用较浅的颜色指示(并且更靠近图的左下角）。表现良好性较低 的菌株用较深的颜色指示;颜色的变化是渐变的。参照菌株RN1189例外，其用最深的颜色指 不。
[0420] 为了评估表达盒的最佳组合，使用NMR数据进行计算。根据以下为所有菌株评分：
[0421 ] 1)培养基中剩下的残留乙酸浓度，
[0422] 2)培养基中剩下的残留甘油浓度，
[0423] 3)由甘油和乙酸生成的乙醇的量，从生成的乙醇总量中减去由木糖和葡萄糖生成 的乙醇的理论量。
[0424] 将三个得分加起来为所有样品分级(表11)。基于这最后一项得分最佳的150个菌 株被可视化，并且也显示在图4中。
[0425] 从最佳的150个菌株，确定了属于A、B、C和D组(见上）的哪些表达盒过表达。参见表 11和表12。
[0426] 表12:下表中描绘了前150个表现最佳的转化株中每种表达盒出现的次数
[0427]
[0428]
[0429] 观祭结采为：
[0430] a) -般而言，对强启动子使用的计数比（较)弱启动子的使用更频繁，因为具有强 启动子的表达盒与(较)弱启动子相比，在150个菌株中更多出现(overrepresented);
[0431 ] b) CAS2和CAS3在AADH组中更多出现；
[0432] c)CASll和CAS12大致相同地良好出现(well represented);
[0433] d)虽然表达盒CAS15和CAS16也良好出现，但CAS13和CASH表现为在GLD组中略微 更多出现；