实（Kruskal，J · B · (1983 )An overview of sequence comparison在D · Sankoff和 J·B.Kruskal (编）中，Time warps , string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison，第1-44页，Addison Wesley)。可以使用用于两个序列 比对的Needleman和Wunsch算法测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。（Needleman， S.B.和Wunsch，C. D. (1970)J.Mol. Biol. 48，443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸 序列。已经在计算机程序NEEDLE中执行Needleman-Wunsch算法。为了本发明的目的，使用来 自于EMBOSS包的NEEDLE程序（2.8.0或更高版本，EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A.Trends in Genetics 16, (6)第276-277页，http://emboss·bioinformatics.nl/) 〇对于蛋白质序列， 将EBL0SUM62用于替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可指定其他矩阵。用于氨基酸 序列比对的任选参数为10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分。技术人员将认识到，所有 这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是当使用不同的算法时两个序列的总体同一性 百分比无显著改变。
[0285] 全局同源性定义
[0286] 同源性或同一性是两个完整序列之间在包括任何空位或延伸的整个比对区域上 相同匹配的百分比。比对的两个序列之间的同源性或同一性按如下计算：比对中在两个序 列中显示相同氨基酸的相应位置的数量除以包括空位在内的比对总长度。如本文所定义的 同一性可由NEEDLE获得并且在程序的输出中标记为"同一性（IDENTITY)"。
[0287]最长同一1性定义
[0288]比对的两个序列之间的同源性或同一性按如下计算：比对中在两个序列中显示相 同氨基酸的相应位置的数量除以减去比对中空位总数后的比对总长度。如本文所定义的同 一性可由NEEDLE通过使用N0BRIEF选项获得，并且在程序的输出中标记为"最长同一性"。
[0289]本文描述的本发明的多个实施方案可交叉合并。
[0290]本发明的另一些实施方案。
[0291] 在一个实施方案中，酵母细胞包含编码NAD+依赖型醇脱氢酶活性(EC1.1.1.1)的 一个或多个核酸序列。这种酶催化乙醛转化为乙醇。酵母细胞可天然地包含编码此类脱氢 酶的基因，如同Saccharomyces cerevisiae (ADH1-5)的情况一样，参见 ' Lutstorf和 Megnet·1968Arch.Biochem.Biophys·126:933-944' 或 'Ciriacy，1975，Mutat·Res·29:315-326'），或宿主细胞可被提供编码这种活性的一个或多个异源基因，例如S. cerevi siae的 ADH1-5基因中的任一个或每一个或其功能同源物可并入根据本发明所述的细胞中。
[0292] 在一个实施方案中，酵母细胞选自Saccharomycetaceae，尤其选自 Saccharomyces，如Saccharomyces cerevisiae;Kluyveromyces，如Kluyveromyces marxianu;Pichia，如Pichia stipitis或Pichia angusta;Zygosaccharomyces，如 Zygosaccharomyces bai1i i;和Brettanomyces，如Brettanomyces intermedius, Issatchenkia，如 Issatchenkia oriental is和Hansenula的组。
[0293] 在一个实施方案中，所述细胞为原核细胞。在一个实施方案中，细胞选自 Clostridium、Zymomonas、Thermobacter、Escherichia、Lactobacillus、Geobacillus和 Bacillus。
[0294] 本发明还涉及根据本发明所述的酵母细胞用于制备发酵产物优选乙醇的用途。本 发明还提供了一种用于制备发酵产物的方法，其包括由乙酸盐/酯和发酵性碳水化合 物一一尤其是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的组的碳 水化合物一一制备发酵产物，所述制备在厌氧条件下使用根据本发明所述的酵母细胞进 行。在一个实施方案中，所述制备在包含摩尔比为0.7或更低，尤其为至少0.004至0.5,更尤 其为0.05至0.3的乙酸盐/酯和碳水化合物的发酵培养基中进行。在制备发酵产物的一个实 施方案中，碳水化合物的至少一部分和乙酸盐/酯的至少一部分已经通过水解选自木质纤 维素、纤维素、半纤维素和果胶的组的多糖获得。木质纤维素优选为已经水解从而获得发酵 性碳水化合物和乙酸盐/酯的木质纤维素生物质。
[0295] 在一个实施方案中，木质纤维素或半纤维素材料与酶组合物接触，其中生成一种 或多种糖，并且其中生成的糖被发酵以产生发酵产物，其中所述发酵用根据本发明所述的 酵母细胞进行。
[0296] 本发明的发酵产物可以是任何有用产物。在一个实施方案中，其是选自以下的产 物：乙醇、正丁醇、异丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、己二酸、富马酸、苹果 酸、衣康酸、马来酸、柠檬酸、己二酸、氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨 酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素、维生素、药物、动物饲料添加剂， 专用化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料，包括生物燃料和生物气体或有机聚合物，和工业 酶，如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或 木聚糖酶。
[0297] 在一个实施方案中，发酵产物可为乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料 添加剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料中的一种或多种。
[0298] 在一个优选的实施方案中，细胞厌氧生长。厌氧生长条件在本文中为厌氧或限氧。 本文将厌氧定义为在无氧或其中基本不消耗氧，优选低于约5mmol/L/h、约2.5mmol/L/h或 约lmmol/L/h的情况下进行的生长过程，并且其中有机分子用作电子供体和电子受体两者。
[0299] 限氧生长过程是其中氧消耗受到从气体到液体的氧传递限制的过程。限氧程度由 进气气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。优选地，在限氧条件下 的过程中，氧消耗速率为至少约5.5mmol/L/h，更优选为至少约6mmol/L/h，如至少7mmol/L/ h。本发明的方法包括回收发酵产物。发酵期间，当存在乙酸时，乙酸/乙酸盐/酯的比率将取 决于pH。步骤d)中的乙酸盐/酯浓度可选择为类似于酵母菌株满足其最终用途的浓度（例 如，在木质纤维素水解产物发酵成发酵产物时，此类水解产物可含有l-10g/l乙酸盐/酯，例 如2g/l乙酸盐/酯）。
[0300] 有利的是，当根据本发明生成乙醇时，其以低于0.04:1，尤其低于0.02:1，优选低 于0.01:1的甘油：乙醇摩尔比生成。可不存在甘油生成(不可检测），尽管至少在一些实施方 案中（其中NADH-依赖性甘油合成减少，而未被完全抑制），一些甘油可作为副产物，例如以 0.001:1或更高的甘油：乙醇比率生成。
[0301 ] 本发明通过提供重组酵母细胞，尤其是Saccharomyces cerevisiae，使其可以通 过经由NADH依赖性反应将乙酸还原为乙醇使NADH重氧化，来允许完全消除甘油生成，或其 至少显著减少。
[0302]这不但有利于避免或至少减少甘油生成，而且因为在NADH重氧化中形成的产物也 是期望产物，即乙醇，所以本发明的方法也可提供增加的产物产量(确定为转化成乙醇的被 转化原料（即碳水化合物加乙酸）的重量％)。因为乙酸通常在木质纤维素水解产物中大量 可用，所以这使得本发明对于使用木质纤维素生物质作为发酵性碳水化合物的来源制备乙 醇特别有利。进一步地，可含有大量乙酸盐/酯的碳水化合物源包括甜菜糖蜜（sugar beet molasse)(水解产物)和淀粉(含有例如来自于玉米干磨过程，来自于玉米湿磨过程;来自于 淀粉废料处理过程，例如经釜馏物回收的废弃产物）。
[0303]在另一优选的实施方案中，本发明的宿主细胞具有以下的至少一种:a)使木糖异 构化为木酮糖的能力;和b)将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力。对于a)而言，酵母 细胞优选具有功能性外源木糖异构酶基因，所述基因赋予酵母细胞使木糖异构化为木酮糖 的能力。对于b)而言，酵母细胞优选具有编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮 糖-5-磷酸4-差向异构酶的功能性外源基因，所述基因一起赋予酵母细胞使L-阿拉伯糖异 构转化为D-木酮糖5-磷酸的能力。
[0304]具有使木糖异构化为木酮糖的能力的真菌宿主细胞如例如W0 03/0624430和W0 06/009434中所描述。优选通过用包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化来 赋予酵母细胞使木糖异构化为木酮糖的能力。优选地，酵母细胞因此获得使木糖直接异构 化为木酮糖的能力。更优选地，酵母细胞因此获得通过木糖向木酮糖的直接异构化(及木酮 糖的进一步代谢），以木糖作为唯一能量和/或碳来源而需氧和/或厌氧生长的能力。在本文 中应理解，木糖向木酮糖的直接异构化在由木糖异构酶催化的单个反应中发生，与分别由 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的木糖经由木糖醇中间体向木酮糖的两步转化不同。
[0305] 可成功用于赋予本发明的酵母细胞使木糖直接异构化为木酮糖的能力几种木糖 异构酶(及其氨基酸和编码核苷酸序列）在本领域中已有描述。这些包括Piromyces sp.和 属于Neocall imastix、Caecomy ces、Piromyces或Ruminomyces (W0 03/0624430)、 Cyllamyces aberensis(US 20060234364)、0rpinomyces(Madhavan等，2008，D0I 10.1007/ s00253-008-1794_6)的其它厌氧真菌的木糖异构酶，Bacteroides细菌属，包括例如 B · thetaiotaomi cron (TO 06/009434)、B · fragil is和B .uniformis(TO 09/109633)的木糖 异构酶，厌氧细菌Clostridium phytofermentans的木糖异构酶（Brat等，2009， Appl.Environ.Microbiol.75:2304-2311),^.Clostridium difficile、Ciona intestinales和Fusobacterium mortiferum(W0 10/074577)的木糖异构酶。
[0306] 具有使L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力的真菌宿主细胞如例如在 Wisselink等（2007，Appl·Environ.Microbiol·doi:10·1128/AEM.00177-07)和EP 1499708 中所述。优选通过用包含编码a)阿拉伯糖异构酶;b)核酮糖激酶，优选L-核酮糖激酶木糖异 构酶;和c)核酮糖-5-P-4-差向异构酶，优选L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶的核苷酸序列的 核酸构建体转化来赋予酵母细胞将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力。优选地，在 本发明的酵母细胞中，将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力是通过以下反应将L-阿 拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力：1)阿拉伯糖异构化为核酮糖;2)核酮糖磷酸化为核 酮糖5-磷酸;和3)核酮糖5-磷酸差向异构化为D-木酮糖5-磷酸。编码阿拉伯糖异构酶、核酮 糖激酶和核酮糖-5-P-4-差向异构酶的适合核苷酸序列可获自Bacillus subtilis、 Escherichia coli(参见例如EP 1499708)、Lactobacilli例如Escherichia coli(参见例 如Wisselink等，同上；W02008/041840)或Clavibacter、Arth;robacte;r和Gramella的物种， 其中优选Clavibacter michiganensis、Arthrobacter aurescens和Gramella forsetii (参见 W02009/011591)。
[0307] 本发明的经转化细胞还优选包含木酮糖激酶活性，以致由木糖异构化的木酮糖可 代谢为丙酮酸盐/酯。优选地，酵母细胞含有内源性木酮糖激酶活性。更优选地，本发明的细 胞包含增强特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰。优选地，遗传修饰引起木酮糖激酶的过表 达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达。编码木酮糖激酶的基因可为酵母细 胞内源的或可为与酵母细胞异源的木酮糖激酶。可用于在本发明的酵母细胞中过表达木酮 糖激酶的核昔酸序列为，例如Deng和Ho( 1990，Appl .Biochem. Biotechnol .24-25:193-199) 所述来自于S. cerevisiae(XKSl)的木酮糖激酶基因。另一种优选的木酮糖激酶是与来自于 Piromyces(xylB;参见W0 03/0624430)的木酮糖激酶相关的木酮糖激酶。这种Piromyces木 酮糖激酶实际上与原核激酶比与所有已知的真核激酶如酵母激酶更相关。已经指出真核木 酮糖激酶为非特异性糖激酶，其具有包括木酮糖的广泛底物范围。相反，已经表明与 Piromyces激酶最密切相关的原核木酮糖激酶是木酮糖的更特异性激酶，即具有更窄的底 物范围。在本发明的酵母细胞中，与除引起过表达的遗传修饰外遗传上相同的菌株相比，待 过表达的木酮糖激酶被过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。应理解，这些过表达水平 可适用于酶活性的稳态水平、酶蛋白的稳态水平以及编码该酶的转录物的稳态水平。
[0308] 本发明的细胞还优选包含增加 WO 06/009434中描述的磷酸戊糖途径的通量的遗 传修饰。在一个实施方案中，遗传修饰包含(非氧化部分)磷酸戊糖途径的至少一种酶的过 表达。优选地，该酶选自编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、转酮醇 酶和转醛醇酶的酶。
[0309] 本发明还优选的细胞包含降低在酵母细胞中的非特异性醛糖还原酶活性的遗传 修饰。优选地，非特异性醛糖还原酶活性在宿主细胞中通过降低编码非特异性醛糖还原酶 的基因的表达或使该基因失活的一个或多个遗传修饰而降低。优选地，该遗传修饰降低酵 母细胞基因组中编码能够还原戊醛糖包括木糖、木酮糖和阿拉伯糖的非特异性醛糖还原酶 的基因的每个内源拷贝的表达或使其失活。由于二倍性、多倍性或非整倍性，给定细胞可包 含编码非特异性醛糖还原酶的基因的多个拷贝，和/或细胞可含有在氨基酸序列上不同并 且各自由不同基因编码的具有醛糖还原酶活性的几种不同的（同工）酶。同样在此类情况 下，优选地，使编码非特异性醛糖还原酶的每个基因的表达降低或失活。优选地，通过使基 因的至少一部分缺失或破坏基因而使基因失活，由此在这种情况下术语基因还包括在编码 序列上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还 原酶活性的表达降低。编码要使其活性在本发明的酵母细胞中降低的醛糖还原酶的核苷酸 序列及此类醛糖还原酶的氨基酸序列在W0 06/009434中有描述并且包括例如 S. cerevisiae GRE3基因的（非特异性）醛糖还原酶基因（Τ????等，2 0 0 1， Appl .Environm.Microbiol. 67:5668-5674)及其在其它物种中的直系同源物。
[0310] 在一个实施方案中，根据本发明所述的酵母细胞还可包含产生选自以下的一种或 多种特征的遗传修饰：（a)木糖和/或阿拉伯糖向酵母细胞的转运增加；（b)对分解代谢产物 阻遏的敏感性降低；（c)对乙醇、渗透性或有机酸的耐受性增加;和，（d)副产物的生成减少。 副产物应理解为意指除期望发酵产物外的含碳分子，并且包括，例如木糖醇、阿拉伯糖醇、 甘油和/或乙酸。本文描述的任何遗传修饰均可通过传统诱变和对期望突变体的筛选和/或 选择来引入，或简单地通过对具有期望特征的自发突变体的筛选和/或选择而引入。或者， 遗传修饰可由内源基因的过表达和/或内源基因的失活组成。对于增加阿拉伯糖和/或木糖 向酵母细胞的转运而言期望其过表达的基因优选选自编码己糖或戊糖转运蛋白的基因。在 5.〇6代￥丨8丨36和其它酵母中，这些基因包括取1'1、取了2、取了3、取了4、取了5、取了7和641^，其中 最优选取了7、取了5和641^2(参见56(113〇1^和!1〇，￥638七2004 ;21:671-684)。用于在酵母中表达 的另一优选转运蛋白是由P. stipitis SUT1基因编码的葡萄糖转运蛋白（Katahira等， 2008,Enzyme Microb.Techno 1.43:115-119)。类似地，其它物种中这些转运蛋白基因的直 系同源物可过表达。在本发明的酵母细胞中可过表达的其它基因包括编码糖酵解酶和/或 产乙醇酶如醇脱氢酶的基因。供失活的优选内源基因包括己糖激酶基因，例如 S · cerevisiae HXK2基因（参见Diderich等，2001，Appl · Environ .Microbiol. 67 :1587-1593);S.cerevisiae MIG1或MIG2基因，编码甘油代谢中涉及的酶的基因如S.cerevisiae 甘油-磷酸脱氢酶1和/或2基因；或其它物种中这些基因的（杂交)直系同源物。用于木糖发 酵的宿主细胞的其它优选修饰在van Maris等（2006，Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418)、102006/009434、102005/023998、102005/111214和恥2005/091733中有描述。如本文 所述的本发明酵母细胞的任何遗传修饰尽可能优选通过自克隆遗传修饰引入或修饰。
[0311] 根据本发明所述的优选宿主细胞具有以木糖和阿拉伯糖中的至少一种作为碳源/ 能量来源，优选作为唯一碳源/能量来源，并且优选在厌氧条件，即如本文所定义的用于厌 氧发酵方法的条件下生长的能力。优选地，当以木糖作为碳源/能量来源生长时，宿主细胞 基本上不产生木糖醇，例如产生的木糖醇低于检测限或按摩尔计，例如低于消耗的碳的 5%、2%、1%、0.5%或0.3%。优选地，当以阿拉伯糖作为碳源/能量来源生长时，酵母细胞 基本上不产生阿拉伯糖醇，例如产生的阿拉伯糖醇低于检测限或按摩尔计，例如低于消耗 的碳的 5%、2%、1%、0.5%或0.3%。
[0312]本发明的一种优选细胞具有以己糖、戊糖、甘油、乙酸及其组合中的至少一种，在 厌氧条件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或0.311_1的速率，或更优选地，在厌氧条 件下以至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15或0.211- 1的速率生长的能力。因 此，优选地，宿主细胞具有以木糖和阿拉伯糖中的至少一种作为唯一碳源/能量来源，在厌 氧条件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或0.311_ 1的速率，或更优选地，在厌氧条件 下以至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15或0.211- 1的速率生长的能力。更优选 地，宿主细胞具有以己糖(例如葡萄糖)与木糖和阿拉伯糖中的至少一种的混合物(按1:1重 量比）作为唯一碳源/能量来源，在厌氧条件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或 〇.3h- 1的速率，或更优选地，在厌氧条件下以至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、 0.15或0.21Γ 1的速率生长的能力。更优选地，宿主细胞具有以己糖(例如葡萄糖）、木糖和阿 拉伯糖中的至少一种与甘油的混合物(按1:1:1重量比)作为唯一碳源/能量来源，在厌氧条 件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或0.31^的速率，或更优选地，在厌氧条件下以 至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15或0.211- 1的速率生长的能力。
[0313] 多年以来，对于引进用于由作物糖生产生物乙醇的多种生物提出了建议。然而，实 践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这 是由于Saccharomyces物种对工业方法的许多有吸引力的特性，即高酸、乙醇和渗透耐受 性、厌氧生长的能力并且当然还有其高酒精发酵能力。作为宿主细胞的优选酵母物种包括 S·cerevisiae、S.bulderi、S·barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S·diastaticus、K.lactis、 K.marxianus或K fragilis。
[0314] 本发明的酵母细胞可以能够转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半 乳糖、果糖、麦芽