[0434] e)虽然CAS21和CAS23在前150个菌株中也良好出现，但CAS23在DAK组中更多出现；
[0435] f)试验的所有表达盒(CAS)在前150个菌株中均出现，表明存在多个解决方案。
[0436] 然而，表达盒的许多组合与参照菌株RN1189相比，由于甘油和乙酸转化增大，导致 乙醇产率提高。这表明表达盒的许多其它组合可提供将甘油和乙酸在由这两种化合物和发 酵性糖组成的混合物中转化为乙醇的解决方案。菌株YD01247，筛选中的最佳菌株（图3和图 4)是对此的例证:其由表达盒CAS01、CAS12、CAS13和CAS23组成。
[0437]许多菌株几乎消耗掉所有可用乙酸。这些菌株能够消耗3_4g甘油/升。
[0438] 实施例3
[0439] 表达盒最佳组合的再试验
[0440]在多因素设计中，再试验了表达盒最佳组合（实施例2)。因为在菌株YD01247中， ACS2-基因的表达受具有弱启动子的构建体(即CAS12)的控制，所以在实验设计中也采用了 这种表达盒，尽管在实施例2中的前150个菌株中没有更多出现这种表达盒。
[0441 ]用选自A、B、C和D组的表达盒的8个组合转化菌株RN1069 (表13)。
[0442] 表13:表达盒最佳组合的再试验
[0443]
[0444] 转化后，将细胞涂在补充了20g葡萄糖/升和200yg G418/ml的YEP琼脂上。每次转 化，使用8个独立菌落接种装有补充了20g葡萄糖/L和200yg G418/ml的YEP琼脂的微孔板， 除R2外;在这种情况下，仅获得3个转化株。
[0445] 作为参照菌株，RN1069、RN1189和YD01247也按8倍包括在内。
[0446] 具有YEH)琼脂和G418的微孔板中的菌株用于接种微孔板中275μ1含200μg/ml组氨 酸、2%葡萄糖、2%木糖、1 %甘油和2g/l乙酸的矿质培养基，一式三份。培养基的pH设为 4.5,低于乙酸的pKa。密封微孔板并且在厌氧条件下培育。在3个不同的时间间隔，即在24、 48和72小时后，每个时间点将一个板从厌氧振荡器中取出。通过离心使细胞沉降并且通过 NMR分析上清液。图5中示出了孵育72小时后的NMR结果，尤其是甘油和乙酸的残留浓度。
[0447] 菌株RN1069(参照菌株之一）中的残留乙酸浓度仍接近2.0g/l，这与预期相符。同 样，这个菌株也未消耗甘油。
[0448] 概念验证菌株RN1189(W02013/081456)平均消耗0.9g乙酸/L和1.5g甘油/L。
[0449] 参照菌株YD01247在所有中表现最佳；残留乙酸浓度仅为0.2g/L(消耗90 %的乙 酸)并且残留甘油浓度仅为5.5g/L。
[0450] 重构转化株(除R2外）的残留乙酸浓度介于0.3g/L和0.6g/L之间并且残留甘油浓 度介于6 · 6g/L和7 · Og/L之间。
[0451] 转化R2不但产生的转化株较少，而且在结果中观察到很大范围。因此，未解释这些 结果。
[0452] 总之，所有试验的表达盒组合，除R2外，在厌氧甘油和乙酸转化方面与参照菌株 RN1189相比导致性能改善。
[0453] 实施例4
[0454] 对选定转化株的厌氧摇瓶实验
[0455] 在摇瓶中试验选择的转化株的性能。为了这个目的，制备实施例2中产生的表14中 的菌株的预培养物。
[0456] 表14:用于厌氧摇瓶实验的菌株及表达盒的存在
[0457]
[0458」 图7中将菌株YU01247、YU01248、YU01249和YU01250分别表不为数子1、2、3和4。菌 株YD01251是在甘油和乙酸消耗方面表现中等良好的菌株。
[0459]为100ml摇瓶填充25ml每升含有约：20g葡萄糖、20g木糖、10g甘油、200mg组氨酸和 2g乙酸(HAc) (pH 4.5)的矿质培养基(如材料和方法中所述）。
[0460]用来自于预培养物的经洗涤细胞，以达到0.5的初始0D600所需的量接种这些摇 瓶，一式两份。烧瓶经水封封闭以在发酵期间达到厌氧条件。在32°C和lOOrpm下进行培育。 96小时后，终止发酵并且通过离心使细胞沉降。通过NMR分析上清液。结果示于表15中。
[0461] 表15:厌氧摇瓶实验的平均NMR结果
[0462]
[0463] 菌株CEN.PK113-7D仅使葡萄糖发酵，这与预期相符。根据消耗的糖计算的乙醇产 率为0.44，这符合在摇瓶发酵中通常所发现的。理论最高乙醇产量为每克糖0.51g乙醇。
[0464] 原则上，菌株RN1069使葡萄糖和木糖两者发酵。然而，这个菌株具有GPD1和GPD2两 者的缺失，这使得在厌氧条件下的辅因子再生不可能。然而，这个菌株部分地转化葡萄糖和 木糖，推测是因为在实验开始时，在摇瓶的顶部空间一些残留氧以及培养基中溶解的氧可 用，使得能够在实验开始时回收一些辅因子。然而，乙醇产率低，每克消耗的糖为〇.39g乙 醇。
[0465] 表达来自于质粒的AADH、GLD和DAK(RN1189)或表达来自于基因组中的整合构建体 的AADH、ACS、GLD和DAK(YD01247至YD01251)的转化菌株显示每消耗的糖的乙醇产率增加。 达到0.48多至0.50的乙醇产率。由于甘油和乙酸向乙醇的厌氧转化和/或没有甘油生成，所 以达到这些较高值。
[0466] 菌株YD01247比其它YD菌株消耗的木糖更少。然而，正如已经在实施例2和3中所 示，这个菌株已经消耗掉几乎所有乙酸。这个菌株还已消耗大部分甘油。这个菌株显示出最 高的乙醇产率。
[0467] 其它YD菌株相对于菌株RN1189还显示出性能改善：消耗更多的甘油和乙酸，导致 乙醇滴度更高。
[0468] 这些实验证实，表达盒的多种替代组合导致与参照菌株RN1189相比，在甘油和乙 酸厌氧转化方面性能改善，导致在所有情况下乙醇滴度更高并且在一些情况下乙醇产率更 尚。
[0469] 文献
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[0477] 专利申请PCT/EP2013/056623(未公开）；
[0478] 专利申请TO 2013/081456;
[0479] 专利申请TO 2011/010923。
【主权项】
1. 经遗传修饰的细胞，其包含： a) 编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列； b) 编码乙酰-CoA合成酶(E.C. 6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列； c) 编码甘油脱氢酶(E.C. 1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和 d) 编码二羟基丙酮激酶(E.C. 2.7.1.28或E.C. 2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的细胞，其包含编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷 酸脱氢酶基因的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。3. 根据权利要求2所述的细胞，其中 c)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:7具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或 编码SEQIDN0:9表示的异源甘油脱氢酶（E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:9具有至少 60%序列同一性的SEQIDN0:9功能同源物的一个或多个核苷酸序列。4. 根据权利要求3所述的细胞，其中 c) 是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:7具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的细胞，其中 d) 是编码SEQIDN0:11表示的二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)或与 SEQIDNO: 11具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 11功能同源物的一个或多个异源核 苷酸序列;和/或 编码SEQIDN0:13表示的二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)或与SEQ IDNO: 13具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 13功能同源物的一个或多个核苷酸序列。6. 根据权利要求5所述的细胞，其中 d)是编码SEQIDN0:13表示的二羟基丙酮激酶(E·C·2·7·1·28或E·C·2·7·1·29)或与SEQIDNO: 13具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 13功能同源物的一个或多个核苷酸 序列。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的细胞，其中 a)是编码SEQIDN0:1表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDN0:1具 有至少60%序列同一性的SEQIDNO: 1功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或 编码SEQIDNO: 2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 2具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或 编码SEQIDNO: 3表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 3具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:3功能同源物的一个或多个核苷酸序列。8. 根据权利要求7所述的细胞，其中 a)是编码SEQIDN0:1表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDN0:1具 有至少60%序列同一性的SEQIDNO: 1功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或 编码SEQIDNO: 2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 2具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列。9. 根据权利要求8所述的细胞，其中 a)是编码SEQIDNO: 2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 2具 有至少60%序列同一性的SEQIDN0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列。10. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中 b)是编码SEQIDNO:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQID NO:6具有至少60%序列同一性的SEQIDNO:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中 a) 是编码SEQIDNO:3表示的NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO:3具有至 少60%序列同一性的SEQIDNO:3功能同源物的一个或多个核苷酸序列； b) 是编码SEQIDNO:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQID NO:6具有至少60%序列同一性的SEQIDNO:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列； c) 是编码SEQIDNO:7表示的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDNO:7具有至少 60%序列同一性的SEQIDNO:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和 d) 是编码SEQIDΝΟ:11表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQIDNO: 11具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 11功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。12. 根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中 a) 是编码SEQIDNO: 2表示的NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 2具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列； b) 是编码SEQIDN0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQIDN0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列； c) 是编码SEQIDN0:9表示的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:9具有至少 60%序列同一性的SEQIDN0:9功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和 d) 是编码SEQIDN0:11表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQIDNO: 11具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 11功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。13. 根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中a)是编码SEQIDN0:2表示的NAD+依 赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 2具有至少60%序列同一性的SEQIDNO: 2功能同 源物的一个或多个异源核苷酸序列； b) 是编码SEQIDN0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQIDN0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列； c) 是编码SEQIDN0:7表示的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:7具有至少 60%序列同一性的SEQIDN0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和 d) 是编码SEQIDN0:13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQIDNO: 13具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。14. 根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中a)是编码SEQIDNO: 1表示的NAD+依 赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQIDNO: 1具有至少60%序列同一性的SEQIDNO: 1功能同 源物的一个或多个核苷酸序列； b)是编码SEQIDN0:6表示的乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQIDN0:6具有至 少60%序列同一性的SEQIDN0:6功能同源或异源同源物的一个或多个核苷酸序列； c) 是编码SEQIDN0:7表示的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:7具有至少 60%序列同一性的SEQIDN0:7功能同源物的一个或多个异源核苷酸序列；和 d) 是编码SEQIDNO:13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQIDNO: 13具有至少40%序列同一性的SEQIDNO: 13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。15. 根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。16. 根据权利要求15所述的细胞，其中在所述酵母细胞中编码甘油3-磷酸磷酸水解酶 的所有内源核苷酸序列和编码甘油3-磷酸脱氢酶的所有内源核苷酸序列缺失。17. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述酵母细胞无编码NADH依赖型甘油3-磷酸脱 氢酶的基因。18. 根据权利要求15-17中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自 Saccharomycetaceae，特另lj是选自Saccharomyces，如Saccharomycescerevisiae； Kluyveromyces，如Kluyveromycesmarxianus;Pichia，如Pichiastipitis或Pichia angusta;Zygosaccharomyces，如Zygosaccharomycesbai1ii;和Brettanomyces，如 Brettanomycesintermedius，Issatchenkia，如Issatchenkiaorientalis^PHansenul^9 组。19. 根据权利要求1-14中任一项所述的细胞，其中所述细胞为原核细胞。20. 根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞选自Clostridium，Zymomonas， Thermobacter，Escherichia，Lactobaci1lus，Geobaci1lus和Baci1lus〇21. 编码SEQIDNO:1-14中任一个表示的多肽的多核苷酸。22. 包含权利要求21的一个或多个多核苷酸的核酸构建体。23. 用权利要求22的核酸构建体转化的宿主细胞。24. 根据权利要求1-20或24中任一项所述的细胞用于制备乙醇的用途。25. 用于制备发酵产物的方法，其包括由乙酸盐/酯和发酵性碳水化合物一一尤其是选 自葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的组的碳水化合物一一制 备发酵产物，所述制备在厌氧条件下使用根据权利要求18-20中任一项的酵母细胞进行。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述制备在包含摩尔比为0.7或更低，尤其为至 少0.004至0.5,更尤其为0.05至0.3的乙酸盐/酯和碳水化合物的发酵培养基中进行。27. 根据权利要求25或26所述的方法，其中所述碳水化合物的至少一部分和所述乙酸 盐/酯的至少一部分已经通过水解选自木质纤维素、纤维素、半纤维素和果胶的组的多糖获 得。28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述木质纤维素是已经水解从而获得发酵性碳 水化合物和乙酸盐/酯的木质纤维素生物质。29. 根据权利要求28所述的方法，其中木质纤维素或半纤维素材料与酶组合物接触，其 中生成一种或多种糖，并且其中生成的糖被发酵以产生发酵产物，其中所述发酵用权利要 求1-18中任一项的经转化宿主细胞进行。30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、 溶剂、动物饲料添加剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料中的一种或多种。
【专利摘要】经遗传修饰的细胞，其包含：a)编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列；b)编码乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列；c)编码甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列；和d)编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序列。
【IPC分类】C12N9/04, C12P7/06, C12N15/54, C12N15/52, C12N15/53, C12N9/00, C12N9/02, C12P7/10
【公开号】CN105492599
【申请号】CN201480047282
【发明人】保罗·克莱斯森, 沃特·威廉·安东尼奥斯·哈特曼
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年8月29日
【公告号】EP3039130A2, US20160208291, WO2015028582A2, WO2015028582A3