ES(IRL Press(1986));B.Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CL0NING(1984)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H.Miller 和 M.P.Calos 编辑（ 1987)Cold Spring Harbor Laboratory) ;GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS(S.C.Makrides编辑 (2003))IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BI0L0GY(Mayer和Walker,编 辑，Academic Press，London(1987));WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL MMUN0L0GY (L. A.Herzenberg等人，编辑（1996))。
[0036] 如说明书和权利要求书中所使用的，除非另有明确说明，单数形式冠词"a"，"an" 和"the"包括复数指代物。
[0037] 如本文使用的，术语"包括"是指组合物和方法包括所记载的元素，但是不排除其 他元素。当使用"基本由……构成"定义组合物和方法时，其是指排除对组合有任何实质影 响的其他元素。例如，如本文定义的，基本由多个元素构成的组合物不排除不会对要求保护 的本发明的基本特点和新特点产生实质影响的其他元素。"由……构成"是指排除高于痕量 的其他成分和所记载的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方式在本 发明的范围内。
[0038]如本文所使用的，术语"麸质"通常是指存在于小麦或相关谷物物种中的蛋白质， 所述谷物物种包括大麦和黑麦，所述蛋白质对某些个体具有潜在的有害作用。麸质蛋白质 包括麦胶蛋白和麦谷蛋白，所述麦胶蛋白例如，α-麦胶蛋白，β-麦胶蛋白，γ -麦胶蛋白和 ω -麦胶蛋白，这些蛋白是单体蛋白质，所述麦谷蛋白是由二硫化物键结合在一起的高分子 量亚单位和低分子量亚单位的聚集体的高度异质性混合物。许多小麦麸质蛋白质已被表 征，参见，例如，Woychik et al. , Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten，J · Agric · Food Chem ·，9 (4)，307-310 (1961)。本文使用的术语麸质还包括可从来自 含麸质的食品的麸质蛋白质的正常人体消化衍生得到的且导致异常免疫反应的寡肽。这些 寡肽中的一些对正常消化酶具有耐受性。包括上述蛋白质和寡肽的麸质被认为在患有麸质 不耐受的患者体内的乳糜泻中充当T细胞抗原。
[0039]术语"猪笼草蛋白酶"是指酶学委员会编号为EC3.4.23.12的天冬氨酸蛋白酶并且 包括猪笼草蛋白酶的所有同种型和变体(例如，I型猪笼草蛋白酶和II型猪笼草蛋白酶)和 重组猪笼草蛋白酶及其盐。盐类是指由猪笼草蛋白酶和一种或多于一种碱或者一种或多于 一种酸形成的那些盐，所述盐保留游离猪笼草蛋白酶的生物有效性和性质，并且，所述盐不 是生物学上不理想的或其他方面不理想的。由无机碱衍生得到的盐包括但不限于:钠盐、钾 盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐，等等。由有机碱衍生得到的盐包括 但不限于:下列胺的盐，伯胺、仲胺和叔胺，包括天然生成的取代的胺在内的取代的胺，环胺 和碱性离子交换树脂，例如，异丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡 因、海巴明青霉素(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙烯基二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、 嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂，等等。可形成盐的酸包括但不限于:无机酸和有机 酸，所述无机酸例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，等等;所述有机酸例如，乙酸、丙酸、乙 醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃 酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸，等等。
[0040]猪笼草蛋白酶衍生物包括生物等同物、其片段和延长的猪笼草蛋白酶及其盐，这 些衍生物保持了蛋白水解活性。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物包括猪笼草蛋白 酶的生物等同物。"生物等同物"包括与猪笼草蛋白酶具有至少约80%同源性或一致性的那 些生物等同物，可选地，与猪笼草蛋白酶具有至少约85%同源性的那些生物等同物，或可选 地，与猪笼草蛋白酶具有至少约90%同源性的那些生物等同物，或可选地，与猪笼草蛋白酶 具有至少约95%同源性的那些生物等同物，或可选地，与猪笼草蛋白酶具有98%同源性的 那些生物等同物，或者可选地，"生物等同物"包括由在严格条件下与编码猪笼草蛋白酶核 苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽或蛋白质，同时该多肽或蛋白质保持期 望的结构并表现出猪笼草蛋白酶蛋白水解活性的至少一部分。
[0041 ]在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物是具有全长猪笼草蛋白酶蛋白质中的至 少约20个连续氨基酸的猪笼草蛋白酶片段，或者是具有全长猪笼草蛋白酶蛋白质中的至少 约50个连续氨基酸的猪笼草蛋白酶片段，或者是包含猪笼草蛋白酶中的100或多于100个连 续氨基酸至猪笼草蛋白酶的完整蛋白质的猪笼草蛋白酶片段。猪笼草蛋白酶衍生物还包括 具有额外序列的猪笼草蛋白酶。
[0042]在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物具有猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的 至少约10%，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约50%，或猪笼草蛋白酶的蛋白水 解活性中的至少约70%，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约90%，或猪笼草蛋白 酶的蛋白水解活性的100 %或更高。
[0043] 本文使用的"其生物等同物"是"其等同物"的同义词，"其等同物"在涉及参比蛋白 质，抗体，多肽或核酸时是指具有最小同源性但仍然保持期望的结构或功能性的那些等同 物。在可选的实施方式中，术语多核苷酸的"生物等同物"是指在严格条件下与参比多核苷 酸或其互补序列杂交的多核苷酸的生物等同物。除非在本文中另有明确记载，应当考虑到 的是，本文提到的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等同物。例如，等同物是指具有至 少约80%的同源性或一致性，可选地具有至少约85%的同源性或序列一致性，或可选地具 有至少约90 %的同源性或序列一致性，或可选地具有至少约95 %的同源性或序列一致性， 或可选地具有98 %的同源性或序列一致性，或可选地具有99 %的同源性或序列一致性，并 且表现出与参比蛋白质、多肽或核酸基本等同的生物活性。
[0044] 多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域）与另一序列具有某一百分比（例 如，80 %，85%，90%或95 % )的"序列一致性"是指当比对时进行比较的两个序列中相同碱 基(或氨基酸）的百分比。比对和百分同源性或序列一致性可使用本领域已知的软件程序确 定，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1987)补充部分 30,第7.7.18节，表7.7.1中所描述的那些软件程序。优选地，缺省参数用于比对。一种比对 程序是BLAST，其使用缺省参数。程序的实例包括使用下列缺省参数的BLASTN和BLASTP: Genetic code = standard；fiIter = none；strand = both；cutoff = 60；expect = 10；Matrix =BL0SUM62 descriptions = 50sequences; sort by = HIGH SCORE ; Databases = non redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+ SPupdate+PIR。这些程序的具体细节可在如下网址找到：ncbi · nlm.nih · gov/cgi-bin/ BLAST。
[0045] 合适的表达载体包括能够表达操作性地连接至调节元件的多核苷酸的载体，所述 调节元件例如，能够调节这些DNA表达的启动子区域和/或增强子。因此，表达载体是指重组 DNA或RNA构建体，例如，质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，所述其他载体在引入合适的宿 主细胞之后使插入的DNA表达。合适的表达载体包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的 那些表达载体以及维持为附加型（episomal)的那些表达载体或整合至宿主细胞基因组的 那些表达载体。
[0046] 本文使用的术语"载体"是指非染色体核酸，该非染色体核酸包括完整复制子，这 样，所述载体可在进入细胞内部时被复制，例如通过转化过程进入细胞内部。载体可以是病 毒载体或非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、乳多空病毒 (papovirus)或其他改良的天然生成的病毒。用于递送核酸的示例性的非病毒载体包括裸 DNA，与阳离子脂质体络合的DNA，与阳离子聚合物一起或与阳离子聚合物结合的DNA;阴离 子和阳离子脂质体;DNA-蛋白质络合物和包含与阳离子聚合物缩合的DNA的颗粒(所述阳离 子聚合物例如，异源聚赖氨酸，限定长度寡肽以及聚乙烯亚胺），在一些情况下，DNA包含在 脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元络合物。
[0047] 非病毒载体可包括质粒，所述质粒包含能够在体外、体内或从体内至体外被递送 至靶细胞的异源多核苷酸。所述异源多核苷酸可包含目标序列并且可被可操作地连接至一 个或多于一个调节元件并且可控制目标核酸序列的转录。本文使用的载体无需能够在最终 靶细胞或受治者中复制。术语载体可包括表达载体和克隆载体。
[0048] "同源性"或"一致性"或"类似性"是指两种肽或两种核酸分子之间的序列类似性。 同源性可通过比较每个序列的某一个位置来确定，所述序列可出于比较的目的进行比对。 当被比较的序列中的某一位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源 的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配位置或同源位置的数目的函数。"不相关"或 "非同源性"序列与本发明公开的序列中的一个序列共享小于40%的一致性，或可选地共享 小于25 %的一致性。
[0049] "杂交"是指可在不同"严格程度"条件下进行的杂交反应。增加杂交反应的严格程 度的条件是本领域周知的并且在本领域中公开，参见，例如，Sambrook and Russe 11编辑. (2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版。相关条件的实例包括（以严格 程度增加的顺序）：孵育温度25°C，37°C，50°C和68°C;缓冲液浓度10X SSC，6X SSC，1X SSC， 0.1X SSC(其中，SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液）以及使用其他缓冲系统的它们 的等同物；甲酰胺浓度〇%，25%，50%和75% ;孵育时间5分钟至24小时，以及逐渐增加洗涤 持续时间，逐渐增加洗涤频率或逐渐减低洗涤的缓冲液浓度。
[0050] 在一种实施方式中，"治疗有效量"是指预防或改善患者体内的症状或产生期望的 生物结果(例如，改善临床指征，延缓疾病的发作，等等）的化合物的量。有效量可由本领域 普通技术人员来确定。所选择的剂量水平可取决于正在治疗的病症的严重程度以及正在被 治疗的患者的病症和先前医疗史。然而，以低于实现期望的治疗效果所需的剂量作为化合 物的起始剂量并且逐渐增加剂量直至实现期望的效果在本领域技术人员的能力范围内。
[0051] 本文使用的"同时给药"或共治疗包括一同给药药剂，或在彼此之前或之后给药。 [0052] 术语"调节(modulate或modulating)"是指对受治者体内的疾病或失调的任何治 疗，所述受治者例如，哺乳动物，所述"调节"包括：
[0053] ?预防疾病或失调或者防止受到疾病或失调的影响，即，使异常生物反应或症状 不发展；
[0054] ?抑制疾病或失调，即，阻止或抑制异常生物反应和/或临床症状的发展;和/或
[0055] ?缓解疾病或失调，即，使异常生物反应和/或临床症状衰退。
[0056] 本文使用的术语"预防"是指对有此需要的患者进行预防性治疗。所述预防性治疗 可通过向处于患上疾病风险中的受治者提供合适剂量的治疗剂来完成，从而基本上防止疾 病的发作。
[0057] 本文使用的术语"病症"是指疾病状态，将本文提供的化合物、组合物和方法用于 该疾病状态。
[0058] 本文使用的术语"患者"或"受治者"是指哺乳动物，并且包括人类和非人类哺乳动 物。在本文的【具体实施方式】中，患者或受治者是人类。
[0059]在数值之前使用的术语"约"表示数值可在合理的范围内发生改变，例如，±5%， ±1%,和 ±0.2%。
[0060] II.方法
[0061] -方面，本发明提供用于调节患有麸质不耐受的患者体内的麸质不耐受的方法， 所述方法包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶 或其衍生物给药于所述患者。
[0062] 在一种实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物作为食品添加剂施用，这样，猪笼草 蛋白酶或其衍生物与含有麸质的食品结合以调节或抑制与麸质不耐受相关的病症。猪笼草 蛋白酶或其衍生物可单独使用或与这些食品联合使用。
[0063] 另一方面，本发明提供调节患者体内由麸质不耐受介导的病症的方法，所述方法 包括将有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。这些病症包括，例如，乳糜泻、 小麦过敏、麸质敏感和疱疹样皮炎。猪笼草蛋白酶或其衍生物可在食用含有麸质或怀疑含 有麸质的食品之前给药于患者，在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品的同时给药于患 者，或在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之后立即给药于患者。
[0064] 在一些实施方式中，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白 酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之前给药于患者。在一些实施方 式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在所述猪笼草蛋白酶或其衍生物至少部分有效(例如，原始 活性的至少约10 %，20 %，50 %，70 %，90 % )降解将要被患者食用的食品中的麸质的时间段 内施用。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用食品之前不超过约4小 时，3小时，2小时，1小时或30分钟施用。
[0065] 在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸 质的食品的同时给药于患者。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与食品一同施 用，例如食品的成分或食品的添加剂。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与食品 分开施用。
[0066] 在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸 质的食品之后立即给药于患者。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在食品中的 麸质的至少一部分(例如，至少约10 %，20 %，50 %，70 %，90 % )仍然在患者胃中的时间段内 施用。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用食品之后不超过4小时，3小 时，2小时，1小时或30分钟施用。
[0067] 另一方面，本发明提供预防或治疗患者的胃肠道细菌感染或寄生虫感染的方法， 所述方法包括将包含有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物给药于所述患者。例如， 所述细菌感染可由诸如錯样芽孢杆菌（Bacillus cereus)，炭疽杆菌（Bacillus anthracis)，幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori )，沙门氏菌（Salmonella)，弯曲菌 (Campy lobac ter)，大肠杆菌（E.coli)，志贺氏杆菌（Shigella)，艰难梭状芽胞杆菌 (Clostridium difficile)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)，肉毒杆菌（Clostridium bo tul inum)，空肠弯曲杆菌（Campy lobac ter jejuni)和李斯特单核细胞增生菌（Listeria monocytogenes)之类的细菌引起。一方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一 方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶 I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。
[0068] 艰难梭状芽胞杆菌是天然生成的肠道菌群的小亚群。然而，作为医院、疗养院或类 似机构中的患者的大部分人通过摄取细菌孢子而暴露于艰难梭状芽胞杆菌。艰难梭状芽胞 杆菌在伺机条件下可在胃肠道中泛滥，这通常由于采用破坏正常肠道菌群的广谱抗生素进 行治疗而引起。细菌释放可导致腹胀、腹泻和严重腹痛的毒素。艰难梭状芽胞杆菌感染是假 膜性结肠炎的最常见的病因，在极少数病例中，所述假膜性结肠炎发展成威胁生命的中毒 性巨结