95 % 的置信度切割(P<〇.05)用于除去假阳性识别。肽长度的相对标准偏差在插图中显示。 [0190] 图6显不了在37°C下，消化1分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，60分钟，130分 钟，360分钟或810分钟之后通过LC-MS/MS识别的肽的数量，以长度分组。数据如图5所示。 [0191]图7显示了与图5的数据相同的数据，作为在37°C下消化10分钟，60分钟，120分钟， 360分钟或810分钟之后获得某一长度的概率。
[0192] 实施例6
[0193] 猪笼草蛋白酶提取物的纯化
[0194] 提取物的纯化
[0195] 50x 2cm ID柱中的琼脂糖固定的胃酶抑素在20mM甘氨酸-HCl(pH2.5-3)中平衡。 过滤的瓶状体液体（如实施例1所述的制备）通过柱循环两次，并且用100mL平衡缓冲液 (20mM甘氨酸HC1，pH2.5)洗涤柱。用100mM碳酸氢铵(pH 8.7)洗脱柱并且收集各部分。为了 保持最大酶活性，在用PH2.5的2M甘氨酸HC1收集部分之后立即将pH降低至4。使用消化分析 验证活性，合并最大活性部分并且基于原始流体体积将其浓缩至大约80倍。
[0196] 实施例7
[0197] 重组猪笼草蛋白酶I
[0198] 猪笼草蛋白酶I的基因（参见SEQ ID N0:1，编码氨基酸残基20-413,来自小猪笼 草，没有植物信号序列）由猪笼草蛋白酶I cDNA制备，使其位于Ndel和Hindlll限制位点之 间。使用T4DNA连接酶（1U) (New Eng 1 and Bi〇，NEB)，T4DNA连接酶缓冲液(NEB)，ATP(0 · 5mM) (NEB)，0.5yg pET21a载体和2yg猪笼草蛋白酶I cDNA，将该序列克隆至pET21a中。在18°C下 孵育4小时。将连接反应混合物(5yL)加至200yL NovaBlue感受态细胞中并在冰上孵育15分 钟。通过热休克(42°C下45秒，随后立即放在冰上，带有lml LB培养基)转化细胞并且在37°C 下孵育1小时，且与抗生素（四环素和氨苄青霉素)一同接种。在确认基因存在于若干白色集 落中之后，选择代表性的集落用于大量质粒提取(maxiprep)。得到的重组质粒pET21a/ R.NepI通过上述热休克转化至大肠杆菌C41中，以在IPTG的诱导下进行表达。在此，细胞生 长至OD66q为0.6并且在37°C下用0.1 mM IPTG诱导四个小时。所表达的蛋白质进入包涵体内。 [0199]包涵体如下进行分离。对细胞进行离心处理，加入蔗糖裂解缓冲液（25%蔗糖， 50mM TrisCl pH 7.4，lmM EDTA，lmM NaN3,以及蛋白酶抑制剂），细胞经历四轮冷冻/融化 并且进行超声处理。随后加入DNAse和RNAse持续30分钟，在室温下孵育。对制备得到的产物 进行离心（约15min，在5000x g条件下）以使包涵体和膜片段成为小粒。将这种小粒重悬于 Triton缓冲液（50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，lmM0-疏基乙醇，ImM NaN3,0.5%Triton X100+蛋白酶抑制剂)并在冰上进行超声处理。再进行一次离心处理，以使包涵体成为小粒， 并且用不含Triton的缓冲液（50mM TrisCl pH 7.4,10mM NaCl，lmM0-巯基乙醇，ImM NaN3， 蛋白酶抑制剂)在冰上洗涤小粒两次(搅拌并进行超声处理）。
[0200] 随后对蛋白质小粒进行再折叠。将lg包涵体悬浮于1L pH为10.5的50mM CAPS，8M 尿素 ，ImM EDTA，ImM甘氨酸，500mM NaCl，300πιΜβ-巯基乙醇中并震荡1小时。用pH为11的 50mM Tris透析悬浮液两次，每次持续1小时，随后用pH为7.5的50mM Tris透析一天，最后用 含有300mM的NaCl的pH为7.0的磷酸盐缓冲液透析。
[0201] 在高速条件（lOOOOx g，持续15分钟）下离心处理溶液，以除去任何未再折叠的蛋 白质，并且通过0.22μπι的膜过滤上清液。在pH为2.5 (甘氨酸-HC1)、4°C条件下活化猪笼草蛋 白酶I过夜。从1L细胞培养物开始，折叠的活化的蛋白质的产量为1 Omg至100mg。
[0202] 实施例8
[0203] 重组猪笼草蛋白酶II
[0204]猪笼草蛋白酶II的cDNA(来自小猪笼草，没有植物信号序列）用于制备猪笼草蛋白 酶II cDNA。使用T4DNA连接酶（lU)(New England Bio，NEB)，T4DNA连接酶缓冲液(NEB)，ATP (0.5mM)(NEB)，0.5yg pET21a载体和2yg猪笼草蛋白酶II cDNA，将该序列克隆至pET21a中， 位于Ndel和Hindlll限制位点之间。在18°C下孵育4小时。将连接反应混合物(5yL)加至200μ L NovaBlue感受态细胞中并在冰上孵育15分钟。通过热休克(42°C下45秒，随后立即放在冰 上，带有lml LB培养基)转化细胞并且在37°C下孵育1小时，且与抗生素（四环素和氨苄青霉 素)一同接种。在确认基因存在于若干白色集落中之后，选择代表性的集落用于大量质粒提 取。得到的重组质粒pET21a/R.NepI通过上述热休克转化至大肠杆菌C41中，以在IPTG的诱 导下进行表达。在此，细胞生长至〇D 66q为0.6并且在37°C下用0.1 mM IPTG诱导四个小时。所 表达的蛋白质进入包涵体内。
[0205]包涵体如下进行分离。对细胞进行离心处理，加入蔗糖裂解缓冲液（25%蔗糖， 50mM TrisCl pH 7.4，lmM EDTA，lmM NaN3,以及蛋白酶抑制剂），细胞经历四轮冷冻/融化 并且进行超声处理。随后加入DNAse和RNAse持续30分钟，在室温下孵育。对制备得到的产物 进行离心（约15min，在5000x g条件下）以使包涵体和膜片段成为小粒。将这种小粒重悬于 Triton缓冲液（50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，lmM0-疏基乙醇，ImM NaN3,0.5%Triton X100+蛋白酶抑制剂)并在冰上进行超声处理。再进行一次离心处理，以使包涵体成为小粒， 并且用不含Triton的缓冲液（50mM TrisCl pH 7.4,10mM NaCl，lmM0-巯基乙醇，ImM NaN3， 蛋白酶抑制剂)在冰上洗涤小粒两次(搅拌并进行超声处理）。
[0206] 随后对蛋白质小粒进行再折叠。将lg包涵体悬浮于1L pH为10.5的50mM CAPS，8M 尿素 ，ImM EDTA，ImM甘氨酸，500mM NaCl，300πιΜβ-巯基乙醇中并震荡1小时。用pH为11的 50mM Tris透析悬浮液两次，每次持续1小时，随后用pH为7.5的50mM Tris透析一天，最后用 含有300mM的NaCl的pH为7.0的磷酸盐缓冲液透析。
[0207] 在高速条件（lOOOOx g，持续15分钟）下离心处理溶液，以除去任何未再折叠的蛋 白质，并且通过0.22μπι的膜过滤上清液。在pH为2.5 (甘氨酸-HC1)、4°C条件下活化猪笼草蛋 白酶II过夜。从1L细胞培养物开始，折叠的活化的蛋白质的产量为1 Omg至1 OOmg。
[0208] 实施例9
[0209]猪笼草蛋白酶对麦胶蛋白的消化绘图
[0210]猪笼草蛋白酶提取物如实施例1所描述的那样制备。纯化的猪笼草蛋白酶提取物 如实施例6所描述的那样制备。重组猪笼草蛋白酶I如实施例7所描述的那样制备。
[0211 ]麦胶蛋白消化如实施例5所描述的那样进行，除了底物与酶的比例为约1000 :1。麦 胶蛋白用猪笼草蛋白酶提取物、纯化的猪笼草蛋白酶提取物或重组的猪笼草蛋白酶I在37 °C下消化2小时。
[0212] 麦胶蛋白是在小麦和其他谷物中发现的一类蛋白质。麦胶蛋白高度富含脯氨酸和 谷氨酰胺残基。我们已确定重组猪笼草蛋白酶I在pH为2-3的条件下非常有效地消化麦胶蛋 白。重组猪笼草蛋白酶I优先进行P1裂解非常类似于浓缩的液体提取物和提取物的纯化部 分（图8A)。意想不到的是，相对于纯化的提取物和重组猪笼草蛋白酶I，提取物表现出对谷 氨酰胺更高的优先性。
[0213] 重组猪笼草蛋白酶I优先进行P1裂解与浓缩的液体提取物以及提取物的纯化部分 非常类似（图8B)。意想不到的是，相对于纯化的提取物或重组猪笼草蛋白酶I，提取物表现 出对脯氨酸更高的优先性。
[0214] 提取物包含猪笼草蛋白酶I和II，但是纯化策略回收的活性猪笼草蛋白酶II比猪 笼草蛋白酶I少得多。不受任何理论的限制，提取物在P1谷氨酰胺位置和ΡΓ脯氨酸位置的 裂解的加强被认为是由猪笼草蛋白酶II和/或猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的协同作 用引起的。
[0215] 实施例10
[0216]猪笼草蛋白酶蛋白质的比较
[0217]已知和推定的猪笼草蛋白酶蛋白质的蛋白质序列使用Clustal 2.1多序列比对进 行比对。猪笼草蛋白酶I的序列是：奇异猪笼草（GenBank登录号：AFV26024)，小猪笼草 (GenBank登录号：BAD07474)，翼状猪笼草(GenBank登录号：BAF98915)，玉米(NCBI参考序 列：NP_001150925)和水稻(GenBank登录号：BAD38020)。猪笼草蛋白酶II的序列是：奇异猪 笼草(GenBank登录号:AFV26025)，小猪笼草(GenBank登录号:BAD07475)，玉米(NCBI参考序 列:NP_001149229)和水稻(GenBank登录号:BAD82000)。得到的比对结果在图9中显示。图10 显示了说明不同物种之间的猪笼草蛋白酶蛋白质的相关性的系统树。表1显示了各个序列 之间成对比对分数。
[0218] 表1
[0219]
[0221] 上述实施例中列举的数据表明猪笼草蛋白酶(不论作为混合物或其纯化的成分或 重组成分)有效消化麸质，然而，胃蛋白酶却不能有效消化麸质。因此，本发明提供了通过使 用猪笼草蛋白酶的混合物或其纯化的成分或重组成分消化含有麸质的蛋白质中的麸质的 方法。
[0222]虽然出于清楚理解的目的通过举例说明以及实例的方式对上述内容做了详细描 述，但是本领域技术人员会理解的是，可在所附的权利要求的范围内进行一些改变和改良。 此外，本文提供的每个参考文献的全部内容通过引用并入本文，这与通过引用单独合并每 个参考文献的程度相同。
【主权项】
1. 一种调节有此需要的患者体内的麸质不耐受或相关病症的方法，所述方法包括将有 效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。2. 如权利要求1所述的方法，其中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在所述患者食用含有麸质 或怀疑含有麸质的食品之前给药于所述患者。3. 如权利要求1所述的方法，其中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在所述患者食用含有麸质 或怀疑含有麸质的食品的同时给药于所述患者。4. 如权利要求1所述的方法，其中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在所述患者食用含有麸质 或怀疑含有麸质的食品之后给药于所述患者。5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，给药猪笼草蛋白酶。6. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是提取的猪笼草蛋白 酶I和/或猪笼草蛋白酶II，纯化的猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II或重组猪笼草蛋白 酶I和/或猪笼草蛋白酶II。7. 如权利要求6所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白 酶II的混合物。8. 如权利要求6所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I。9. 如权利要求6所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶II。10. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶衍生物与猪笼草蛋 白酶I共享至少约85%的序列同源性并且保持蛋白酶活性。11. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶衍生物与猪笼草蛋 白酶II共享至少约85%的序列同源性并且保持蛋白酶活性。12. -种包含重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物。13. 如权利要求12所述的组合物，其是膳食补充品。14. 如权利要求12所述的组合物，其是药物组合物。15. 如权利要求12所述的组合物，其是食品。16. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白 酶I和猪笼草蛋白酶II的混合物。17. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草 蛋白酶I。18. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草 蛋白酶II。19. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白 酶I和猪笼草蛋白酶II的混合物。20. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草 蛋白酶I。21. 如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草 蛋白酶II。22. -种用于优化麸质蛋白质在脯氨酸残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组 猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。23. -种用于优化麸质蛋白质在谷氨酰胺残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重 组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。24. -种包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含通过在麸质的脯氨酸残基 处裂解麸质而产生的麸质片段。25. -种包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含通过在麸质的谷氨酰胺残 基处裂解麸质而产生的麸质片段。26. -种治疗有此需要的患者体内的胃肠道感染的方法，所述方法包括将有效量的猪 笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。27. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是提取的猪笼草蛋白酶I和/或 猪笼草蛋白酶II、纯化的猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II或重组猪笼草蛋白酶I和/或 猪笼草蛋白酶II。28. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋 白酶II的混合物。29. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I。30. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶II。31. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶衍生物与猪笼草蛋白酶I共享 至少约85 %的序列同源性并保持蛋白酶活性。32. 如权利要求26所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶衍生物与猪笼草蛋白酶II共享 至少约85%的序列同源性并且保持蛋白酶活性。33. 如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中，所述感染由螺旋杆菌属、梭菌属或芽 孢杆菌属的细菌引起。34. 如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中，所述细菌是幽门螺旋杆菌。35. 如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中，所述细菌是艰难梭状芽胞杆菌。36. 如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中，所述细菌是炭疽杆菌。37. -种制备重组猪笼草蛋白酶或其同源物的方法，所述方法包括在所选择的宿主生 物体内表达编码所述猪笼草蛋白酶或其同源物的核酸序列，并且将所述核酸序列插入适当 设计的载体中。38. 如权利要求37所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I。39. 如权利要求37所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶II。40. 如权利要求37所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶同源物与猪笼草蛋白酶I共享 至少约85%的序列同源性并且保持蛋白酶活性。41. 如权利要求37所述的方法，其中，所述猪笼草蛋白酶同源物与猪笼草蛋白酶II共享 至少约85%的序列同源性并且保持蛋白酶活性。42. -种包含内部赋形剂和有效量的消化麸质的猪笼草蛋白酶的分配器。43. 如权利要求42所述的分配器，其中，所述内部赋形剂包括氯化钠或碘化钠或其混合 物。44. 如权利要求42所述的组合物，其中，所述猪笼草蛋白酶是颗粒形式，并且其尺寸为 从所述分配器中有效分配出来的尺寸。
【专利摘要】本发明提供含有猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物，食品以及使用猪笼草蛋白酶或其衍生物调节麸质不耐受以及相关病症(例如乳糜泻)的方法。本发明进一步提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的药物组合物以及使用猪笼草蛋白酶或其衍生物治疗胃肠道的细菌(例如，艰难梭状芽胞杆菌或幽门螺旋杆菌)感染的方法。本发明进一步提供包含重组猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II或同源蛋白质的组合物以及制备所述组合物的方法。
【IPC分类】A61P1/14, A23L33/00, A61P31/04, A61K38/48, C12N9/50
【公开号】CN105492602
【申请号】CN201480024012
【发明人】戴维·施里默, 彼得·曼, 海尼克·马策克, 马尔什·雷伊
【申请人】内佩泰克斯有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月14日