专利名称：哺乳动物细胞表面抗原及相关试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及与控制哺乳动物细胞如哺乳动物免疫系统细胞的活化和扩增的蛋白相关的组合物。具体而言，本发明提供了纯化的基因，蛋白，抗体和相关试剂，用于例如控制各种细胞类型包括造血细胞的活化，发育，分化和功能。
背景技术：
静止T细胞的活化对多数免疫应答是至关重要的，并允许这些细胞表现其调节或效应功能。参见Paul(编辑，1993)《基础免疫学》第3版，Raven Press，N.Y.。T细胞和抗原呈递细胞(APC)或其它形式的初级刺激，如固定化单克隆抗体(mAb)，的粘附增加，可增强T细胞受体信号。T细胞活化和T细胞扩增依赖于T细胞受体(TCR)和辅助细胞提供的共刺激的结合。参见，例如Jenkins和Johnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5361-367；Bierer and Hahn(1993)Semin.Immunol.5249-261；June et al(1990)Immunol.Today 11211-216；Jenkins(1994)Immunity1443-446。T细胞的一种主要的研究得较为清楚的共刺激相互作用是T细胞上的CD28或CTLA-4与B7或B70的相互作用(Jenkins(1994)Immunity 1443-446)。最近对CD28缺陷小鼠(Shahinian et al(1993)Science 261609-612；Green et al(1994)Immunity 1501-508)和表达CTLA-4免疫球蛋白的转基因小鼠(Ronchese et al(1994)J.Exp.Med.179808-817)的研究已经揭示出某些T细胞应答缺陷，尽管这些小鼠具有正常的初级免疫应答和对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒及水泡性口炎病毒的正常CTL应答。因此，这两项研究的结论是其它共刺激分子必需支持T细胞功能。然而，鉴定这些介导独特共刺激信号的分子是困难的。
肿瘤坏死因子(TNF)是一个正在出现的细胞因子家族的原型成员，该细胞因子家族是免疫调节和炎症应答的主要介导者。这些配体一般为II型膜蛋白，其羧基末端同源。通常产生蛋白水解加工的可溶性蛋白。参见，例如Smith et al(1994)Cell 76959-962；Amitage(1994)Curr.Opin.Immunol.6407-413；Gruss and Dower(1995)Blood 853378-3404；Wileyet al (1995)Immunity 3673-682；Baker and Reddy(1996)Oncogene 121-9。这些家族成员的关键作用已经由许多研究证实，它们与细胞凋亡、外周耐受、Ig突变和同种型转换及普通B细胞和T细胞功能有关。参见，例如Thomson(编辑，1994)《细胞因子手册》Academic Press，San Diego，CA。这些意味着在免疫和发育网络中的基础作用。
不能调节活化信号防止了对免疫系统中不适当的发育或生理应答的控制。本发明提供了至少一种替代共刺激分子，其激动剂和拮抗剂可用于调节免疫应答过多。
发明概述本发明部分基于发现了一种抗原，其具有与作为细胞凋亡诱导物的蛋白质的序列同源性。具体而言，本发明提供了编码一种具有316个氨基酸的蛋白质的基因，该蛋白质被称为499E9，表达于高度极化的Th1 T细胞。499E9的结合可能调节效应细胞的抗原特异性增殖和细胞因子产生。499E9是一种新的细胞表面分子，结合后可能会增强免疫细胞扩增或凋亡。介绍了小鼠的实施方案，使哺乳动物基因，蛋白，抗体和其用途成为现实。由其它哺乳动物如人和非哺乳动物种类获得了具有显著序列同源性的功能性等价物。而且，499E9受体可作为其结合配体刺激其它表达该受体的细胞。
更具体而言，本发明提供了以下物质的组合物，所述物质选自基本上纯化的或重组的499E9蛋白或多肽，其中至少12个氨基酸与SEQ IDNO2具有至少约85％的序列同一性；SEQ ID NO2的天然序列的499E9；或含有499E9序列的融合蛋白。某些实施方案包括基本纯化的或分离的蛋白，其含有一个与499E9相应部分具有序列同一性的区段，其中同源性为至少约90％的同一性，该部分为至少约9个氨基酸；同源性为至少约80％的同一性，该部分为至少约17个氨基酸；或同源性为至少约70％的同一性，该部分为至少约25个氨基酸。其它实施方案包括一种组合物，其中499E9包括表1的成熟序列，或一种蛋白或多肽，所述蛋白或多肽来自包括啮齿类的哺乳动物等温血动物；含有一个SEQ IDNO2的多肽区段；具有多个表现出同一性的部分；是499E9的天然等位变体；长度至少为约30个氨基酸；具有至少两个对哺乳动物499E9特异的非重叠表位；至少约20个氨基酸与啮齿类499E9具有至少约90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；粘附在固相底物上；与另一化学实体偶合；是天然序列的五重或更少的取代物；或者是天然序列的缺失或插入变体。还提供了各种组合物，例如包含无菌499E9蛋白或肽；或499E9蛋白或肽和载体，其中载体为水性化合物，包括水、盐水和/或缓冲液；和/或配制供口服、直肠、鼻腔、局部或非肠道给药。也提供了融合蛋白，例如包括表1的成熟蛋白序列；检测或纯化标志，包括FLAG，His6或Ig序列；或其它TNF-配体蛋白的序列。还提供了试剂盒实施方案，例如包括上述蛋白或多肽；和包含上述蛋白或多肽的分隔物；和/或使用或弃置试剂盒中试剂的说明。
抗体或结合化合物实施方案包括含有特异性与天然499E9蛋白结合的抗体的一个抗原结合区的抗体或化合物，其中所述蛋白是啮齿类蛋白；结合化合物是Fv，Fab或Fab2片段；结合化合物偶合于另一化学实体上；或以下抗体针对成熟499E9产生的；针对纯化499E9产生的；是免疫选择的；是多克隆抗体；结合变性499E9；对抗原的Kd至少为30μM；偶合于固相载体上，包括珠或塑料膜；为无菌组合物；或可检测地标记，包括放射性标记或荧光标记。其它实施方案包括含有结合化合物的试剂盒，和包含结合化合物的分隔物；和/或使用弃置试剂盒中试剂的说明。其它形式包括例如一种含以下组分的组合物一种无菌结合化合物；或结合化合物和一种载体，其中载体为水性化合物，包括水、盐水和/或缓冲液；和/或配制供口服、直肠、鼻腔、局部或非肠道给药的组合物。这也容许在混合物中将499E9蛋白或肽由其它物质中纯化出来的方法，包括将混合物与上述抗体接触，分离结合的499E9与其它物质。
核酸实施方案包括编码一种蛋白或肽或融合蛋白的分离或重组核酸，其中499E9蛋白来自哺乳动物，包括啮齿类；或者是以下核酸编码表1的一个抗原肽序列；编码表1的多个抗原肽序列；与编码该区段的天然cDNA具有至少约80％的同一性；是一种表达载体；还包括复制起点；来自天然来源；含有可检测的标记；含有合成核苷酸序列；小于6kb，优选小于3kb；来自哺乳动物，包括啮齿类；含有天然的全长编码序列；是一种编码499E9蛋白的基因的杂交探针；是一种PCR引物，PCR产物或诱变引物。含有此重组核酸的细胞或组织也包含在本发明之内，如其中的细胞为原核细胞；真核细胞；细菌细胞；酵母细胞；昆虫细胞；哺乳动物细胞；小鼠细胞；啮齿类细胞或人细胞。包含上述物质的试剂盒形式包括核酸，或包含核酸的分隔物；包含499E9蛋白或多肽的分隔物；和/或使用或弃置试剂盒中试剂的说明。其它核酸实施方案包括以下核酸在以下洗涤条件下与SEQ ID NO1杂交30℃和低于2M盐，45℃和/或500mM盐，或55℃和/或150mM盐；至少约30核苷酸的一个区段与啮齿类499E9具有至少约85％的同一性，同一性至少为95％和/或该区段为至少55个核苷酸，或同一性至少为95％和/或该区段为至少75个核苷酸。
本发明还提供了调节细胞或组织培养细胞的生理或发育的方法，包括向细胞引入499E9的激动剂或拮抗剂。其它方法包括调节细胞的生理，包括使细胞与以下物质接触基本纯化的499E9或片段；特异结合499E9的抗体或结合配体；或编码499E9或肽的核酸。优选该细胞是T细胞，该生理的调节是T细胞的凋亡；或T细胞的活化。
本发明还提供了治疗免疫应答异常的患者的方法，即给予有效量的499E9特异性抗体或结合配体；499E9蛋白或多肽；或编码499E9肽的核酸。免疫应答异常的特征在于T细胞免疫缺损；慢性炎症；或组织排斥。优选实施方案详述本文引用的所有参考文献均全文引为参考，如同每一出版物或专利申请分别单独引用一样。I.概论本发明提供了编码各种哺乳动物蛋白的氨基酸序列和DNA序列，所述蛋白是见于许多T细胞亚型如Th1，Th2，极化Th1细胞和极化Th2细胞的抗原。这些蛋白是具有调节作用的抗原，如诱导或防止相互作用细胞的增殖或分化，还具有其它生理效应。全长抗原和片段或拮抗剂可用于表达该抗原反受体的细胞的生理调节。该蛋白也可用作抗原，如免疫原，以针对该蛋白上的各种表位包括线性或构象表位产生抗体。该分子可用于限定功能性T细胞或NK细胞亚群。
编码499E9的cDNA分离自极化Th1细胞cDNA文库，见Openshawet al(1995)J.Exp.Med.1821357-1367。499E9 cDNA含有长度为219lbp的区段，包含一个编码II型跨膜蛋白的大的开放读框。转录子分析已经鉴定到多个转录子，最多的是2.1到2.3kb。结构特征包括约52氨基酸的细胞内区序列，约246氨基酸的细胞外区，和约20氨基酸的疏水的推测的跨膜区。见表1和SEQ ID NO2。499E9具有TNF配体家族成员的结构基元特征。例如可与CD40配体、OX40配体、TNF、NGF和FAS比较。表1列出了小鼠499E9的核酸和推测的氨基酸序列。表1小鼠499E9核苷酸和推测的氨基酸序列。推测的细胞内区序列大约自met1到met49；残基8和11可能是酪氨酸磷酸化位点；跨膜序列可能大约自phe50到leu69；细胞外区可能大约自tyr70到asp316。见SEQ IDNO1和2。GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG60TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG120CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA GAC TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG169Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser1 5 10 15GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC217Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His20 25 30CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC265Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg35 40 45TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC313Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys50 55 60AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA361Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg65 70 75ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT409Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His80 85 90 95GAA AAC GCA GGT TTG CAG TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAA GAC ACA CTA457Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu100 105 110CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG505Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln115 120 125AAG GAA CTG CAA CAC ATT GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA553Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro130 135 140GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT601Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro145 150 155GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA649Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro160 165 170 175TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC697Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly180 185 190TGG GCC AAG ATC TCT AAC ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT745Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val195 200 205AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT793Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His210 215 220CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG841His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val225 230 235TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG889Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met240 245 250 255AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT937Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe260 265 270TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA-985Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu275 280 285ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT1033Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp290 295 300GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT1082Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 315TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT1142GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC1202TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT1262GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG1322GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTGAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC1382TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT1442CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG1502GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTTATATA1562ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT1622GTGCTATAGT ATTTGATTCA AAATATTTAA AAATGTCTCA CTGTTGACAT ATTTAATGTT1682TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG TACTCGTAGC1742TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATTTCTTTA TTCTTTTTAA1802CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA1862ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC1922TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG1982TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTCTTTTTT TACAAGAGCT ACAAATTGTA2042AATTTTGTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT2102CCACTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTCTG2162AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC2191TNF配体家族成员具有对应于残基205的保守亮氨酸残基；对应于残基211的保守甘氨酸残基；对应于残基216的保守酪氨酸残基；对应于残基277的保守甘氨酸残基；对应于残基282的保守亮氨酸残基；对应于残基307的保守苯丙氨酸残基；对应于残基308的保守甘氨酸残基。TNF配体区似乎自大约205(leu)延伸至316(asp)。糖基化位点可能是在197和262。这个克隆与小鼠TRAIL具有密切的同源性，后者可能诱导细胞凋亡。相关家族成员包括CD40和FAS配体，以及淋巴毒素β，肿瘤坏死因子等。
cDNA Southern杂交清楚地揭示，499E9表达于多种T细胞，包括Th1，Th2，3周极化的Th1或Th2细胞，前T细胞，也表达于Rag敲除胸腺cDNA文库。可能已经在树突细胞中检测到一些弱的信号。表达499E9的细胞一般含一种约2.1到2.3kb的主要转录子，但也含其它转录子。组织分布分析表明在脑、心、肾、肝、肺、脾和睾丸中有阳性信号。499E9的转录子在成纤维细胞(L细胞)、单核细胞(RAW264)、幼稚T细胞(CD4+，MEL14+，Br细胞)、巨噬细胞、Nippo感染肺/肝/脾或Rag敲除器官(脑、心、肾、肝、肺、脾或睾丸)中已经检测到。
499E9与TNF配体家族的结构同源性表明了该分子的功能。499E9作为T细胞表面分子，可能调节效应细胞的Ag特异性增殖应答，或诱导这些细胞的凋亡。499E9激动剂或拮抗剂可能也可作为共刺激分子调节T细胞介导的细胞活化，可能实际上引起T辅助细胞如Th1和Th2间的转换。因此，499E9或拮抗剂应当可用于治疗异常免疫紊乱，如T细胞免疫缺损，慢性炎症或组织排斥。
TNF配体分子一般调节细胞增殖、存活和分化。例如，TNF和FAS可杀死表达其相应受体的细胞，包括成纤维细胞，肝细胞和淋巴细胞。这类配体的某些成员可影响表达其相应受体的细胞的增殖，所述细胞如表达CD40的B细胞。这些对增殖的效应可能也会影响随后的分化步骤，可能直接或间接地导致细胞因子表达模式的改变。
TNF配体家族成员也具有共刺激作用，这也可调节细胞分化或细胞凋亡。受体表达细胞可能受到保护，免于活化诱导的细胞死亡(ACID)或细胞凋亡。例如，CD40配体可对T和B淋巴细胞具有作用。
该实施方案的特征在于来自小鼠，但也存在其它灵长类如人的变体。其它哺乳动物种类如灵长类和啮齿类的蛋白的另一些序列也可获得。见下述。以下叙述示例性涉及小鼠499E9，但同样可用于其它种类的相关实施方案。小鼠499E9蛋白是具有细胞表面抗原如TNF配体家族成员的结构特征的蛋白。该蛋白在特定细胞类型上容易检测到，其它细胞表达较少。499E9抗原应存在于鉴定的组织类型中，抗原与其结合配体的相互作用对介导细胞生理或发育的各个方面应是至关重要的，如本文所述。II.纯化499E9小鼠499E9氨基酸序列见SEQ ID NO2。这些氨基酸序列(从氨基端到羧基端)的重要性在于提供抗原的序列信息，允许区分一种蛋白和其它蛋白，例举多种变体。而且，肽序列允许制备肽，产生识别这种区段的抗体，核苷酸序列允许制备寡核苷酸探针，二者均为检测或分离如克隆编码这些序列的基因或cDNA的策略。
本文中，“小鼠499E9”用于说明蛋白质时包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，或该蛋白的一个显著的片段，或其它来源于小鼠的高度同源的蛋白。这些结合成分如抗体一般以高亲和力结合499E9，如至少约100nM，通常优于约30nM，优选优于约10nM，更优选优于3nM。同源蛋白也见于非小鼠的哺乳动物种类如灵长类或啮齿类。非哺乳动物种类应当也具有结构或功能相关的基因和蛋白，如禽类或两栖类。
“多肽”在本文中包括一个显著片段或区段，也包括一段至少约8个氨基酸的氨基酸残基区段，通常至少约12个氨基酸，一般至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，在具体实施方案中，为至少约30或更多个氨基酸。
“结合成分”指特异性与499E9结合的分子，如以细胞粘附对型方式或抗体-抗原相互作用方式结合。还包括以下化合物，如特异与499E9结合的蛋白，结合方式包括共价或非共价的天然生理相关蛋白-蛋白相互作用。该分子可以是聚合物或化学试剂。功能类似物可以是具有结构修饰的抗原或是一种具有与合适结合决定簇相互作用的分子形状的分子。该化合物可作为结合相互作用的激动剂或拮抗剂，参见如Goodman etal(编辑，1990)《Goodman&Gilman′s治疗的药理学基础》(第8版)，Pergamon Press。
基本纯化一般指该蛋白没有其它来源于原始来源生物的污染蛋白、核酸或其它生物分子。纯度可通过标准方法分析，一般以重量表示，普通情况下至少约40％纯度，一般至少约50％纯度，通常至少约60％纯度，典型地至少约80％纯度，优选至少约90％纯度，在最优选的实施方案中，至少约95％纯度。通常加入载体或赋形剂。
多肽或片段的溶解性取决于环境和多肽。多种参数影响多肽的溶解性，包括温度，电解质环境，多肽大小和分子特征，及溶剂性质。一般，多肽使用的温度为约4℃到约65℃。通常使用的温度高于约18℃。为诊断目的，温度通常约为室温或稍高，但低于分析成分的变性温度。为治疗目的，温度通常为体温，对小鼠和人一般为约37℃，但在某些条件下，该温度在原位或体外可以提高或降低。
多肽的大小和结构一般是在基本稳定状态，通常在非变性状态。多肽可与其它多肽以四级结构结合，如赋予溶解性，或与脂质或去污剂结合，结合方式类似于天然脂双层相互作用。
溶剂和电解质一般是生物相容的缓冲液，是用于保持生物活性的类型，通常接近生理水性溶剂。该溶剂通常具有中性pH，一般为约5-10，优选约7.5。在某些情况下，可以加入一种或多种去污剂，一般是温和的非变性的去污剂，如CHS(半琥珀酸胆甾醇酯)或CHAPS(3-[3-胆胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸)，或浓度足够低，从而避免蛋白的结构或生理特性的显著破坏。III.物理变体本发明也包括与499E9氨基酸序列具有基本氨基酸序列同一性的蛋白或肽。该变体包括种、多态或等位变体。
氨基酸序列同源性或序列同一性通过优化残基匹配确定，如果需要，可引入所需的缺口。参见Needleham et al(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff et al(1983)Time Warps，String Edits，andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparison第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和来自IntelliGenetics，Moutain View，CA和Wisconsin大学遗传学计算机小组，Madison，WI的软件包。当将保守性取代作为匹配时，序列同一性会发生改变。保守性取代一般包括以下组内的取代甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。同源氨基酸序列一般旨在包括各种相应蛋白序列的天然多态或等位和种间变体。通常，同源蛋白或肽与499E9的氨基酸序列具有25-100％(如果引入缺口)的同一性，到50-100％(如果包括保守取代)的同一性。同一性指标为至少约35％，一般为至少约40％，经常为至少约50％，典型地为约60％，通常为约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％。
分离的499E9 DNA可通过以下方法方便地修饰核苷酸取代，核苷酸缺失，核苷酸插入，和核苷酸区段的倒转。这些修饰产生新的DNA序列，其编码这些抗原，它们的衍生物或具有类似生理，免疫原性，抗原性或其它功能活性的蛋白。这些修饰序列可用于产生突变抗原或增强表达。增强表达可能包括基因扩增，转录增加，翻译增加和其它机制。“突变499E9”包括其与499E9的序列同一性在上述定义范围之内，但具有不同于天然所见的499E9的氨基酸序列的多肽，这种差异可以由缺失、取代或插入产生。这通常包括与具有SEQ ID NO2序列的蛋白具有显著同一性的蛋白，并与这些序列共有多种生物活性，如抗原性或免疫原性，在优选实施方案中，含有大多数公开的全长序列。全长序列一般是优选的，但截短变体如可溶性构建体和完整结构域也可使用，同样，天然来源的基因或蛋白一般是最理想的。类似的构思可应用于不同的499E9蛋白，特别是各种温血动物如哺乳动物和禽类中发现的蛋白。这些叙述通常意味着包括所有499E9蛋白，不限于具体讨论的特定小鼠实施方案。
499E9诱变可通过氨基酸插入或缺失进行。可产生取代，缺失，插入或任意组合来获得最终的构建体。插入包括氨基或羧基末端融合。随机诱变可在靶密码子进行，然后筛选表达的突变体的所需活性。在预定位点产生取代突变的方法是本领域已知的，如M13引物诱变或聚合酶链反应(PCR)。参见，例如Sambrook et al(1989)；Ausubel et al(1987 andsupplements)；Kunkel et al(1987)Methods in Enzymol.154367-382。
本发明也提供了重组蛋白，如使用来自这些蛋白的区段的异源融合蛋白。异源融合蛋白是天然状态下一般不以同样方式融合的蛋白或区段的融合体。类似的概念适用于异源核酸序列。融合蛋白可用作清除，分离和纯化其部分的来源。
此外，新的构建体可通过合并其它蛋白的类似功能区产生。例如，靶位结合或其它区段可在不同的新融合多肽或片段之间“交换”。参见，例如Cunningham et al(1989)Science 2431330-1336；O′Dowd et al(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862所述的亚磷酰胺法可产生适当的合成DNA片段。双链片段通常可通过以下方法获得合成互补链，在合适的条件下退火，或使用DNA聚合酶以合适的引物序列加入互补链，如PCR技术。IV.功能变体对499E9生理应答的阻断可能是由于抑制了抗原与其结合配体的集合，例如同种的另一分子，这可能是通过竞争性抑制实现的。因此，本发明的体外试验通常使用分离的蛋白，来自表达膜相关499E9细胞的细胞膜，包括这些蛋白的抗原结合区段的可溶性片段，或偶联于固相底物上的片段。这些试验也允许诊断性确定结合区段突变和修饰或抗原突变和修饰，如499E9类似物，的效应。
本发明也包括竞争性药物筛选试验的用途，如其中抗原或结合片段的中和抗体与试验化合物竞争结合该蛋白，如天然蛋白序列的试验。
499E9抗原的“衍生物”包括天然形式的氨基酸序列突变，糖基化变体，和与其它化学实体的共价或聚集偶合物。共价衍生物可通过以下方法制备将官能团连接于499E9氨基酸侧链中的基团，或N或C末端，如通过标准方法。参见，例如Lundblad and Noyes(1988)《蛋白修饰的化学试剂》卷1-2，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL；Hugli(ed.)(1989)《蛋白质化学技术》Academic Press，San Diego，CA；Wong(1991)《蛋白连接和共价交联的化学》，CRC Press，Boca Raton，FL。
具体而言，糖基化改变包括例如通过合成和加工或进一步加工过程中改变多肽的糖基化特征。参见，例如Elbein(1987)Ann.Rev.Biochem.56497-534。也包括具有同样的一级氨基酸序列，但具有小修饰的肽变体，所示修饰如临时氨基酸残基，如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
也提供499E9和其它同源或异源蛋白的融合多肽。多种细胞因子受体或其它表面蛋白是多聚体，如同源二聚体，重复构建体可能具有某些优点，包括对蛋白水解较不敏感。代表性实例是报告多肽如荧光素酶与蛋白的一个区段或结构域如受体结合区段融合，使得融合配体的存在或定位容易确定。参见，例如Dull et al美国专利4,859,609。其它基因融合配体包括细菌β半乳糖苷酶，trpE，蛋白A，β内酰胺酶，α淀粉酶，醇脱氢酶，酵母α交配因子，检测或纯化标志如His6序列的FLAG序列。参见，例如Gpdowski et al(1988)Science 241812-816。
融合肽一般通过重组核酸法或合成多肽法制备。核酸操作和表达的技术一般可参见，例如Sambrook et al (1989)《分子克隆实验室指南》第2版，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory；Ausubel et al(eds)(1993)《现代分子生物学方法》Greene and Wiley，NY。合成多肽的方法可参见，例如Merrifield(1 963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton et al(1989)《固相肽合成实用方法》IRLPress，Oxford；Grant(1992)《合成肽使用者指南》W.H.Freeman，NY。
本发明也包括499E9非氨基酸序列或糖基化变体的衍生物的用途。这种衍生物可包括与化学实体共价或聚集相连。共价或聚集衍生物可用作免疫原，免疫试验中的试剂，或用于纯化方法，如其它抗原等结合配体的亲和层析。499E9可通过以下方法固定化采用本领域熟知的方法共价结合于溴化氰活化的SEPHAROSE等固相支持物上，或吸附于聚烯烃表面，采用或不采用戊二醛交联，以用于抗499E9抗体的试验或纯化或用于另一种结合组合物。499E9可以用可检测的基团标记，用于如诊断试验。499E9的纯化可通过固定化抗体或互补结合配体实现。
本发明的可溶性499E9或片段可用作免疫原，产生特异性结合抗原或其片段的抗血清或抗体。纯化抗原可用来筛选单克隆抗体或抗原结合片段，包括天然抗体的抗原结合片段，如Fab，Fab′，F(ab)2等。纯化的499E9也可用作检测抗体的试剂，所述抗体是对增高水平的抗原或含抗原的细胞片段发生应答产生的，二者可用来诊断异常或特定生理或疾病状态。本发明包括针对SEQ ID NO1的核苷酸序列编码的氨基酸序列或包含其的蛋白片段产生的抗体。具体而言，本发明包括与以下特定片段具有结合亲和力或针对其产生的抗体，所述片段推测位于脂双层之外，为细胞外区或细胞内区。
本发明包括分离其它密切相关的种类的变体。Southern和Northern印迹分析应可确定，类似遗传实体存在于其它哺乳动物中。有可能499E9具有广泛的种类变体，如啮齿类，兔形动物，食肉动物，偶蹄目，奇蹄目和灵长类。
本发明也提供了分离一组相关抗原的方法，所述抗原在结构，表达和功能方面具有独特性和类似性。分离和鉴定其它独特种类的变体将大大加速该分子的多种生理效应的阐明。具体而言，本发明提供了在不同种类中鉴定其它同源遗传实体的探针。
分离的基因允许转化缺乏相应499E9表达的细胞，如缺乏相应抗原并具有负背景活性的种类或细胞。这应允许相对于对照细胞分析499E9的功能。
通过这些抗原介导行使各种活化或分化功能的关键结构元件，可使用现代分子生物学的标准方法实现，特别是与相关类别成员比较。参见，例如Cunningham等(1989)所述的同系物筛选诱变，Science 2431339-1336；和O′Dowd et al(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992；Lechleiter et al(1990)EMBO J 94381-4390中所用的方法。
细胞内功能可能与通常可接近细胞溶胶的抗原区段相关。然而，在某些情况下可能发生蛋白内化，也可能发生细胞内成分和“细胞外”区段的相互作用。499E9与其它细胞外成分相互作用的特定区段可通过诱变或直接生化手段如交联或亲和方法鉴定。晶体学或其它物理方法进行的结构分析也可使用。进一步的信号传导机制的研究包括研究相关成分，其可能可通过亲和方法或遗传手段如突变的互补分析分离。
将进行499E9的表达和控制的进一步研究。与抗原相关的控制元件应具有不同的生理，发育，组织特异的或其它表达模式。欲研究的是上游或下游遗传区，如控制元件。具体而言，已经发现了生理或发育变体，如抗原的多种可变加工形式。参见，例如SEQ ID NO1。因此，信使的不同剪接可能会导致抗原的膜结合形式，可溶形式和修饰变体的分配。
抗原的结构研究会导致新抗原的设计，特别是对该分子具有激动剂或拮抗剂特性的类似物。这可与前述筛选方法结合，分离具有所需活性范围的抗原。V.抗体可针对各种499E9产生抗体，包括种类，多态或等位变体和其片段，以其天然形式或重组形式均可。此外，可针对499E9的活性或非活性形式包括天然或变性形式产生抗体。也包括抗独特型抗体。
抗抗原的预定片段的抗体包括其结合片段和单链形式，可通过以片段与免疫原性蛋白的偶联物免疫动物产生。单克隆抗体可由分泌所需抗体的细胞制备。可筛选这些抗体结合正常或缺陷499E9的活性或者其激动剂或拮抗剂活性，例如通过抗原或其结合配体介导的活性。抗体可以是激动剂或拮抗剂，如通过空间阻断配体结合。这些单克隆抗体通常的结合KD是至少约1 mM，更通常的是至少约300μM，一般是至少约100μM，更一般的是至少约30μM，优选至少约10μM，更优选至少约3μM或更佳。
本发明的抗体可用于诊断应用。作为捕获或非中和抗体，可以其没有配体抑制结合时结合抗原的能力对其进行筛选。作为中和抗体，它们可用于竞争结合试验。它们也可用于检测499E9蛋白或其结合配体或对其进行定量。参见，例如Chan(ed)(1987)《免疫学实用指南》AcademicPress，Orlando，FLA；Price and Newman(ed)(1991)《免疫试验原理和实践》Stockton Press，N.Y.；Ngo(ed)(1988)《非同位素免疫试验》PlenumPress，NY。交叉吸附或其它试验可鉴定具有各种特异性范围的抗体，例如独特的或共有的种类特异性。
再者，本发明的抗体包括抗原结合片段可以作为强效拮抗剂，结合抗原，抑制功能性结合或抑制结合配体的能力，从而引发生物应答。它们也可用作非中和抗体，可偶联于毒素或放射性核素，所以当抗体结合抗原时，例如在其表面表达抗原的细胞即被杀死。此外，这些抗体可通过接头直接或间接偶联于药物或其它治疗剂，可进行药物打靶。
抗原片段可连接于其它物质，特别是多肽，作为融合或共价连接的多肽用作免疫原。抗原和其片段可与多种免疫原偶联或共价连接，所述免疫原如匙孔血蓝蛋白，牛血清白蛋白，破伤风类毒素等。有关制备单克隆抗血清的方法参见《微生物学》Hoeber Medical Division，Harper andRow，1969；Landsteiner(1962)《血清反应的特异性》Dover Publications，New York；Williams et al(1967)《免疫学和免疫化学方法》卷1，AcademicPress，New York；Harlow and Lane(1988)《抗体实验室指南》CSH Press，NY。
在某些情况下，需要自各种哺乳动物宿主制备单克隆抗体，如小鼠，啮齿类，灵长类，人等。制备这种单克隆抗体的技术见例如Stites et al(ed)《基础和临床免疫学》第4版，Lange Medical Publications，Los Altos，CA及其所引参考文献；Harlow and Lane(1988)《抗体实验室指南》CSH Press；Goding(1986)《单克隆抗体原理和实践》第2版，Academic Press，NewYork；特别参见Kohler and Milstein(1975)Nature 256495-497，其中讨论了产生单克隆抗体的一种方法。
其它合适的技术包括将淋巴细胞体外与抗原多肽接触或者在噬菌体或类似载体中选择适当的抗体文库。参见，Huse et al(1989)“噬菌体λ中产生免疫球蛋白的大型组合文库”Science 2461275-1281；Ward et al(1989)Nature 341544-546。本发明的多肽和抗体使用时可修饰或不修饰，包括嵌合或人源化抗体。多肽或抗体经常通过以下方法标记共价或非共价连接于提供检测信号的物质。已知有多种标记或偶合技术，在科学文献和专利文献中有大量报导。合适的标记包括放射性核素，酶，底物，辅因子，抑制物，荧光物质，化学发光物质，磁性颗粒等。有这些标记的使用的教导的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。也可产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly，美国专利4,816,567；Moore et al，美国专利4,642,334；Queen et al (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033。
本发明的抗体也可用于分离蛋白的亲和层析。使抗体与固相支持物连接制备层析柱。参见，例如Wilchek et al(1984)Meth.Enzymol 1043-55。
针对各种499E9产生的抗体可用于产生抗独特型抗体。这些抗体可用来检测或诊断各种与相应抗原表达有关的免疫疾病。VI.核酸所述肽序列和相关试剂可用于由天然来源检测，分离或鉴定编码499E9的DNA克隆。一般来说，其可用于分离哺乳动物基因，类似方法可用于分离其它种类的基因，如禽类和哺乳类等温血动物。交叉杂交允许由其它种类分离499E9。已有多种不同的方法可用于成功地分离合适的核酸克隆。
纯化蛋白或成分明确的肽可用于通过标准方法产生抗体，如上所述。合成肽或纯化蛋白可呈递给免疫系统，产生单克隆或多克隆抗体。参见，例如Coligan(1991)《现代免疫学方法》Wiley/Greene；Harlow andLane(1989)《抗体实验室手册》Cold Spring Harbor Press。或者，499E9可用作特异结合试剂，可利用其结合特异性的优点，正如使用抗体一样。
例如，特异结合组合物可用于筛选表达文库，该文库由表达499E9的细胞系产生。所述筛选可以是标准表面表达抗原染色或淘筛。细胞内表达的筛选也可通过各种染色或免疫荧光方法进行。结合组合物可用于亲和纯化或表达该蛋白的细胞的分选。
肽区段也可用于推测合适的寡核苷酸以筛选文库。遗传密码可用于选择可用作筛选探针的寡核苷酸。参见，例如SEQ ID NO1。与聚合酶链反应(PCR)技术组合，合成寡核苷酸可用于由文库中选择正确的克隆。互补序列也可用作探针，引物或反义链。基于可能的细胞外区的鉴定，各种片段应特别适用于，例如与锚定载体或polyA互补PCR技术或其它肽的互补DNA偶联。
本发明包括编码生物活性的相应499E9多肽的分离DNA或片段的用途。此外，本发明包括编码生物活性蛋白或多肽的分离或重组DNA，所述DNA在适当的条件下可与本文所述的DNA序列杂交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，具有如SEQ ID NO1所公开的氨基酸序列。再者，本发明包括分离或重组DNA或其片段的用途，所述DNA或片段编码499E9的同源蛋白，或者是使用编码499E9的cDNA作为探针分离的。该分离的DNA可在5′和3′侧翼具有调控序列，如启动子，增强子，polyA添加信号等。
“分离的”核酸是基本上与天然序列所具有的其它成分分离的核酸，如RNA，DNA或混合聚合物，所述其它成分如来自来源生物的核糖体，聚合酶和/或侧翼基因组序列。该术语包括与其天然环境分离的核酸序列，也包括重组或克隆DNA分离物和化学合成类似物或异源系统生物合成的类似物。基本上纯化的分子包括该分子的分离形式。通常，该核酸位于载体之内或者是小于约50kb的片段，通常小于约30kb，一般小于约10kb，优选小于约6kb。
分离的核酸通常是分子的同质组合物，但在某些实施方案中含有少量异源物质。该异源物质通常见于聚合物末端或对所需生物功能或活性不重要的部分。
“重组”核酸由其制备方法或结构限定。关于其制备方法，如由一种方法制备的产物，该方法使用重组核酸技术，如在核苷酸序列中包括人工干预，通常是选择或产生。或者，它可以是通过制备包括天然状态下彼此互不相邻的两个片段的融合的序列产生的核酸，但必需排除天然产物，如天然存在的变体。因此，例如用任何非天然存在的载体转化细胞制备的产物包括在内，包括使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的核酸也包括在内。这通常是为了用编码相同或保守氨基酸的丰余密码子替代一个密码子，而通常是引入或除去序列识别位点。
或者，重组是为了将具有所需功能的核酸区段连接在一起，产生不见于通常的天然形式的包括所需功能组合的单一遗传实体。限制酶识别位点经常是这种人工操作的目标，但其它位点特异性目标，例如启动子，DNA重组位点，调节序列，控制序列或其它有用特征，通常是设计时可考虑的。类似的概念可用于重组如融合多肽。具体而言，包括以下合成核酸，其通过遗传密码丰余性编码类似于这些抗原片段的多肽和不同种类变体序列的融合体。
显著的“片段”在用于核酸时是指至少约17个核苷酸的连续区段，通常至少约22个核苷酸，一般至少约29个核苷酸，更经常至少约35个核苷酸，典型地至少约41个核苷酸，普通至少约47个核苷酸，优选至少约55个核苷酸，在具体优选实施方案中是至少约60个核苷酸。
编码499E9蛋白的DNA用于鉴定编码相关或同源蛋白的基因，mRNA和cDNA种类，以及鉴定编码不同种类同源蛋白的DNA时特别有用。在其它种类中可能存在同系物，包括灵长类，啮齿类和禽类。各种499E9蛋白应当是同源的，并包括在本发明之内。然而，即使编码与抗原的亲缘关系较远的蛋白的基因，在合适的条件下使用这些序列也可以方便地分离，只要它们同源性足够。灵长类499E9蛋白尤其令人关注。
来自基因组序列的重组克隆如含有内含子的克隆可用于转基因研究，包括如转基因细胞和生物，和基因治疗。参见，例如Goodnow(1992)“转基因动物”，Roitt编辑，免疫学百科全书，Academic Press，San Diego，pp.1502-1504；Travis(1992)Science 2561392-1394；Kuhn et al(1991)Science 254707-710；Capecchi(1989)Science 2441288；Robertson(1987)编辑，《畸胎瘤和胚胎干细胞实用方法》，IRL Press，Oxford；Robertson(1992)J.Clinical Oncology 10180-199。
核酸序列比较中，基本序列同源性指所述区段或其互补链在进行比较时，优化排列后具有如下同一性(同时具有合适的核苷酸插入或缺失)至少约50％，一般至少约58％，普通情况下至少约65％，经常至少约71％，典型地至少约77％，通常至少约85％，优选至少约95-98％或更多，在具体实施方案中，为99％或更高。或者，当所述区段在选择性杂交条件下与一条链或其互补链可杂交则具有基本序列同源性，所述链通常是499E9的序列，如SEQ ID NO1中的序列。一般，选择性杂交在如下情况下会发生至少约30核苷酸的一个区段具有至少约55％的同源性，优选至少约25个核苷酸的一个区段具有至少约75％的同源性，最优选约20个核苷酸的一个区段具有至少约90％的同源性。参见，Kanehisa (1984)Nuc.Acids Res.12203-213。如本文所述，同源性比较的长度可以更长，在某些实施方案中，为至少约17个核苷酸的一个区段，通常至少约28个核苷酸，一般至少约40个核苷酸，优选至少约75-100或更多个核苷酸。
在涉及杂交中的同源性时，严紧条件是指盐，温度，有机溶剂和其它通常在杂交反应中要控制的参数的总的严紧条件。严紧温度条件通常包括超过约30℃的温度，通常超过约37℃，一般超过约55℃，优选超过约70℃。严紧盐度条件普通情况下小于约1000mM，通常小于约400mM，一般小于约250mM，优选小于约150mM。但是，参数的组合较单一参数值更为重要，参见，例如Wetmur and Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。来自其它哺乳动物种类的499E9可通过密切相关的种的种间杂交克隆和分离。在亲缘关系较远的种类之间亲缘性可能较低，因此相对来说亲缘关系较近的种类之间杂交较为理想。或者，制备具有较低物种特异性的抗体制品可用于表达克隆法。
VII.制备499E9；模拟物编码499E9或其片段的DNA可通过以下方法获得化学合成，筛选cDNA文库，或筛选制备自多种细胞系或组织样品的基因组文库。参见，例如Okayama and Berg(1982)Mol.Cell.Biol.2161-170；Gubler andHoffman (1983)Gene 25263-269；Glover编辑(1984)《DNA克隆实用方法》，IRL Press，Oxford。或者，本文提供的序列提供了有用的PCR引物，或允许合成或其它方法制备编码499E9的合适基因，包括天然存在的499E9。
该DNA可在多种宿主细胞中表达，以合成全长499E9或其片段，它们又可用来例如产生多克隆或单克隆抗体；用于结合研究；用于修饰分子的构建和表达；和用于结构/功能研究。
本文所用的载体包括质粒，病毒，噬菌体，可整合DNA片段，和其它能将DNA片段整合进入宿主基因组的载体。参见，例如Pouwels et al(1985 and Supplements)《克隆载体实验室指南》，Elsevier，NY；Rodriguezet al(1988)编辑《载体分子生物学克隆载体及其用途概述》，Battersworth，Boston，MA。
为本发明目的，当DNA序列功能上彼此相关时，它们被有效连接。例如，如果前序列或分泌先导序列被表达为前蛋白或参与指导多肽转运至细胞膜或多肽的分泌，其被有效连接于多肽。如果启动子控制多肽转录，其被有效连接于编码序列；如果核糖体结合位点的定位可进行翻译，则其被有效连接于编码序列。一般，有效连接是指相邻和符合读框，但是，某些遗传元件如抑制基因连接位置不相邻但仍能结合操纵基因序列，从而控制表达。参见，例如Rodriguez et al第10章，p205-236；Balbasand Bolivar(1990)《酶学方法》18514-37；Ausubel et al(1993)《现代分子生物学方法》，Greene and Wiley，NY。
合适的表达载体代表性实例包括pCDNA1；pCD，参见Okayama et al(1985)Mol.Cell.Biol 51136-1142；pMClneo Poly-A，参见Thomas et al(1987)Cell 51503-512；和杆状病毒载体，如pAC373或pAC610。参见，例如Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42177-199。
在提供特定或限定糖基化特征的系统中表达499E9多肽通常较为理想。参见，例如Luckow and Summers (1988)Bio/Technology 647-55；Kaufman(1990)Meth.Enzymol.185487-511。
499E9或其片段可以工程改造以磷脂酰肌醇(PI)连接于细胞膜，但可通过磷脂酰肌醇裂解酶如磷脂酰肌醇磷脂酶C由细胞膜除去。这释放了生物活性形式的抗原，允许通过标准蛋白质化学方法进行纯化。参见，例如Low(1989)Biochim.Biophys.Acta 988427-454；Tse et al(1985)Science 2301003-1008；Brunner et al(1991)J.Cell Biol.1141275-1283。
既然499E9已经被鉴定，其片段或衍生物可通过常规合成肽的方法制备。这些包括如下文献中所述的方法Stewart and Young(1984)《固相肽合成》，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky and Bodanszky(1984)《肽合成的实践》，Springer-Verlag，New York；Bodanszky(1984)《肽合成原理》，Springer-Verlag，New York；Villafranca编辑(1991)《蛋白质化学技术II》，Academic Press，San Diego，CA。
VIII.用途本发明提供的试剂可用于本文其它地方，如在概论中T细胞介导的疾病或以下有关诊断试剂盒的叙述中所述的诊断用途。
本发明也提供了具有明显治疗价值的试剂。499E9(天然存在或重组的)，其片段，其抗体，以及与499E9具有结合亲和力的化合物，应可用于治疗与异常生理或发育有关的疾病，包括异常增殖疾病如癌症或退行性疾病。具体而言，淋巴细胞发育的调节可通过使用本文所提供的组合物进行适当治疗来达到。例如，与499E9的异常表达或异常信号传导有关的疾病或紊乱应该是该抗原的激动剂或拮抗剂的可能的靶。该抗原在造血细胞如淋巴细胞(其影响免疫应答，如自身免疫紊乱)的调节和发育中起作用。
尤其是，该抗原可能提供细胞活化的共刺激信号。因此，499E9可能调节T细胞介导的与其它细胞类型如具有其受体的细胞的相互作用。这些相互作用在某些情况下可导致细胞生长的调节，这些或其它细胞的细胞因子合成，或特定效应细胞的发育。
而且，499E9或其拮抗剂可以再指导T细胞应答，如Th1和Th2极化之间或与Th0细胞的应答。这些激动剂中应当有各种识别合适表位的抗体，所述表位如模拟499E9与其受体结合的表位。或者，它们可结合空间阻断受体结合的表位。
499E9的拮抗剂如天然存在的499E9分泌型或封闭抗体也是有用的，它们可以提供调节异常状况如自身免疫紊乱以及急性和慢性炎症应答(其中T细胞活化，扩增和/或免疫T细胞记忆发挥重要作用)中的免疫应答的选择性和强效途径，上述自身免疫紊乱如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，桥本甲状腺炎。参见Samter et al(编辑)《免疫疾病》卷1和2，Little，Brown and Co.。可以用天然存在的分泌型499E9或其拮抗剂实现T细胞活化，扩增和/或细胞因子释放。
此外，某些与其它T细胞信号传导调节剂结合的组合物也是有用的。这种其它信号传导分子包括TcR试剂，CD40，CD40L，CTLA-8，CD28，SLAM，FAS及其相应拮抗剂。
已知在各种Northern印迹分析表明具有499E9 mRNA的细胞类型中的多种异常状况。参见Berkow(编辑)《Merck诊断治疗手册》，Merck&Co.，Rahway，N.J.；Thorn et al《Harrison内科医学原理》，McGraw-Hill，N.Y.；Weaterall et al(编辑)《牛津医学教科书》，Oxford University Press，Oxford。许多其它医学状况和疾病与T细胞有关或是T细胞介导的，其中许多对本发明提供的激动剂或拮抗剂治疗有反应。参见，例如Stites andTerr(编辑，1991)《基础和临床免疫学》Appleton and Lange，Norwalk，Connecticut；Samter et al(编辑)《免疫疾病》Little，Brown and Co.。这些问题对本发明提供的组合物的预防或治疗应当是敏感的。
499E9抗体可以纯化，然后给予患者(家畜或人)。这些试剂可以与其它活性或惰性成分合并用于治疗，如在常规可药用载剂或稀释剂如免疫佐剂中与生理相容的稳定剂、赋形剂或防腐剂一起组合。这些组合可以是无菌过滤，然后在单位剂量容器中冻干或以水性制品稳定储存形成单位剂型。本发明还包括抗体或其结合片段的应用，包括非互补结合的形式。
可使用499E9或其片段进行药物筛选，以鉴定与499E9具有结合亲和力或对499E9具有其它相关生物效应包括分离相关组分的化合物。随后的生物分析可用来确定该化合物是否具有内在刺激活性或其作为阻断剂或拮抗剂阻断该抗原的活性，如突变蛋白拮抗剂。同样，具有内在刺激活性的化合物可活化信号传导途径，因此其为刺激499E9活性的激动剂。本发明还包括499E9阻断抗体作为拮抗剂和刺激分子如突变蛋白作为激动剂的治疗用途。该方法对其它499E9种类变体应特别有用。
有效治疗所需的试剂量取决于多种不同的因素，包括给药方法，靶位点，患者生理状况和给予的其它药物。因此，对治疗剂量应进行滴定以优化安全性和效果。一般，体外所用的剂量对这些试剂的原位给药可提供有用的指导。治疗特定疾病的有效剂量的动物试验可提供人用剂量的预测信息。有关考虑见Gilman et al(编辑)(1990)Goodman and Gilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；《雷明顿制药科学》第17版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.。在其中及以下对各种给药方法进行了讨论，如口服，静脉，腹膜内或肌肉给药，经皮扩散等。可药用佐剂将包括水，盐水，缓冲液和其它所述化合物，如见Merck Index，Merck&Co.，Rahway，New Jersey。预计合适载剂中的剂量范围通常小于约1 mM浓度，典型地小于约10μM，一般小于约100nM，优选小于约10pM(皮摩尔)，最优选小于约1 fM(飞摩尔)。缓释制剂或缓释装置通常用于连续或长期给药。参见，例如Langer(1990)Science 2491527-1533。
499E9或其片段，其抗体或片段，拮抗剂和激动剂可直接给予治疗宿主，或根据化合物的大小，将其偶合于载体蛋白如卵清蛋白或血清白蛋白后再用药。治疗制剂可以许多常规剂型给药。尽管可以将活性成分单独给药，优选将其作为药物制剂给药。制剂一般包括至少一种如上所述的活性成分以及一种或多种可接受的载体。每一种载体若与其它成分相容和对患者无害，就应是可药用的和生理相容的。制剂包括适合口服，直肠，鼻腔，局部或非肠道(包括皮下，肌肉，静脉和皮内)给药的制剂。制剂可方便地以单位剂量形式存在，也可通过药学领域已知的方法制备。见，例如Gilman et al(编辑)(1990) Goodman and Gilman′sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；《雷明顿制药科学》第17版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avis etal(编辑)(1993)《药物剂型肠道药物》，Dekker，New York；Liebermanet al(编辑)(1990)《药物剂型片剂》，Dekker，New York；Lieberman etal(编辑)(1990)《药物剂型分散系统》，Dekker，New York。本发明的该治疗可与其它药物合并或联合使用，例如其它T细胞激活调节剂，如CD40，CD40配体，CD28，CTLA-4，B7，B70，SLAM，T细胞受体信号传导分子或其相应拮抗剂。
天然存在和本发明的重组形式的499E9尤其可用于筛选对该蛋白具有结合活性的化合物的试剂盒和试验方法中。近年已开发几种自动分析方法，可以在短时间内筛选成千上万种化合物。参见，例如Fodor et al(1991)Science 251767-773，其中叙述了通过多种在固相底物上合成的成分明确的聚合物测定结合亲和力。由本发明提供的大量纯化的可溶性499E9会大大促进合适分析方法的发展。
其它方法也可用于确定499E9-499E9受体相互作用中的关键残基。可进行突变分析，例如参见Somoza et al(1993)J.Exptl.Med.，以确定在该相互作用和/或信号传导中的具体关键残基。参与同嗜性相互作用的细胞外区或细胞内区均提供细胞间信号传导中重要的相互作用。
例如，如果抗原结构已经确定，通常可通过三级结构数据寻找拮抗剂。在发展出高度自动化的分析方法后使用纯化的499E9可测定潜在相互作用类似物。具体而言，新的拮抗剂和拮抗剂可通过本文所述筛选技术发现。尤为重要的是对499E9分子谱具有合并的结合亲和力的化合物，如可作为499E9种类变体的拮抗剂的化合物。已知药物筛选方法利用已经用表达499E9的重组DNA分子稳定转化的真核和原核宿主细胞。可分离表达与其它分子分离的499E9的细胞。这种细胞，无论是活的或固定的，均可用于标准结合配体结合试验。参见，Parce et al(1989)Science246243-247；Owicki et al(1 990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874007-4011，其中介绍了测定细胞应答的敏感方法。
药物筛选的其它技术包括提供对499E9具有合适亲和力的其它化合物的高流通量筛选，有关叙述见Geysen，欧洲专利申请84/03546，
公开日1984年9月13日。首先，在固体底物，如塑料针或某些其它合适表面，上合成大量不同小肽测试化合物，参见Fodor et al(1991)。然后所有的针与溶化的，未纯化的或溶化的，纯化的499E9反应并洗涤。下一步包括测定结合的499E9。
合理的药物设计也基于499E9和其它效应物或类似物分子形状的结构分析。效应物可以是介导对结合发生反应的其它功能的其它蛋白，或通常与499E9相互作用的其它蛋白。确定哪一个位点与特定其它蛋白相互作用的一种方法是物理结构分析法，如X射线晶体衍射或2维NMR技术。这些提供了哪一个氨基酸残基形成分子接触区的指导。蛋白结构分析的详细介绍见例如Blendell and Johnson(1976)《蛋白质晶体衍射术》，Academic Press，New York。IX.试剂盒本发明也包括499E9蛋白，其片段，肽和其融合产物在多种检测其它499E9或其结合配体的诊断试剂盒和方法中的用途。一般试剂盒包括一个分隔物，其中含有成分明确的499E9肽或基因区段或识别其中之一或另一个的试剂，如499E9片段或抗体。
确定试验化合物与499E9的结合亲和力的试剂盒一般包括试验化合物；标记化合物，例如已知对499E9具有结合亲和力的结合配体或抗体；499E9来源(天然存在的或重组的)；分离结合的和游离的标记化合物的装置，如固定该分子的固相。筛选到化合物之后，对抗原具有合适结合亲和力的化合物可在合适的生物试验中评价，如本领域已知的试验，以确定它们是否可作为499E9信号传导途径的激动剂或拮抗剂。可获得重组499E9多肽也提供了校准该试验的明确标准。
优选的确定例如在样品中的499E9浓度的试剂盒一般包括已知对抗原具有结合亲和力的标记化合物，如结合配体或抗体，抗原来源(天然存在的或重组的)和分离结合的和游离的标记化合物的装置，如固定499E9的固相。通常也提供放置试剂的分隔物和说明书。
对499E9或其片段特异的抗体，包括抗原结合片段，可用于诊断应用中，测定较高水平的499E9和/或其片段的存在。这种诊断试验可使用裂解物，活细胞，固定细胞，免疫荧光，细胞培养物，体液，并可进一步包括检测与血清中抗原相关的抗原等。诊断试验可以是同质的(没有游离试剂和抗原-结合配体复合物的分离步骤)或异质的(有分离步骤)。有多种商用试验，如放射免疫试验(RIA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶免疫试验(EIA)，多酶免疫试验技术(EMIT)，底物标记荧光免疫试验(SLFIA)等。参见，例如Van Vunakis et al(1980)Meth.Enzymol.701-525；Harlow and Lane(1980)《抗体实验室手册》，CSHPress，NY；Coligan et al(编辑)(1993)《现代分子生物学方法》，Greeneand Wiley，NY。
同样，抗独特型抗体也可用于诊断抗499E9抗体的存在，它们可能是某些异常状态的诊断指标。例如，499E9的过量产生会导致各种免疫反应的产生，它们可能是异常生理状况的诊断指标，特别是在增殖细胞性疾病如癌症或异常活化或分化中。
诊断试验的试剂经常以试剂盒提供，从而优化试验的敏感性。对本发明而言，取决于试验的性质，方法和标记，提供标记或未标记抗体或结合配体，或标记499E9。这通常与其它附加物一起，如缓冲液，稳定剂，产生信号所需的材料如酶底物等。优选，该试剂盒也包括使用和使用后弃置内含物的正确方法。一般试剂盒对每一有用试剂均具有分隔。理想的是，试剂以冻干粉末提供，进行试验时，试剂可在提供合适浓度试剂的水性介质中重配。
前述的药物筛选和诊断试验中的许多成分可不经修饰即使用或以多种方式修饰后使用。例如，可通过将直接或间接提供检测信号的实体共价或非共价连接进行标记。在任一试验中，结合配体，试验化合物，499E9或其抗体可直接或间接标记。直接标记的可能性包括标记基团放射标记如125I，酶(美国专利3,645,090)如过氧化物酶和碱性磷酸酶，和能监测荧光强度，波长偏移或荧光极化变化的荧光标记(美国专利3,940,475)。间接荧光标记的可能性包括一种成分的生物素化，然后与偶联于上述标记基团之一的亲和素结合。
有多种分离结合的和游离的499E9，或者结合的与游离的试验化合物的方法。499E9可固定在多种基质上，然后进行洗涤。合适的基质包括塑料如ELISA板，滤膜和珠。参见，例如Coligan et al(编辑)(1993)《现代免疫学方法》卷1，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合适的分离技术包括但不限于荧光素抗体磁化颗粒法，Rattle et al(1984)Clin.Chem.301457-1461，和双抗体磁性颗粒分离，美国专利4,659,678。
将蛋白或其片段连接于标记物的方法在文献中有广泛的报导，本文无需详述。多种这样的技术涉及使用活化羧基，通过使用碳二亚胺或活性酯形成肽键，通过巯基与活化卤素如氯乙酰或活化烯烃如马来酰亚胺反应形成硫醚，从而形成连键等。
本发明其它诊断方面包括来自499E9序列的寡核苷酸或多肽序列的使用。这些序列可用作探针检测怀疑有异常状况如癌症或发育问题的患者样品中的499E9信使水平。由于抗原是活化的标志，其可用于确定活化T细胞的数目，从而确定例如何时会需要额外的抑制。RNA和DNA核苷酸序列的制备，序列的标记和优选的序列大小在文献中有充分的叙述和讨论。参见，例如Langer-Safer et al(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.794381-4385；Caskey(1987)Science 236962-967；Wilchek et al(1988)Anal.Biochem.1711-32。
本发明也包括定性或定量测定其它标志的诊断试剂盒。诊断或预测可根据用作标志的多种指标的组合。因此，试剂盒可测定标志的组合。参见，例如Viallet et al (1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。其它试剂盒可用来评价T细胞亚群。X.分离499E9特异结合配体的方法499E9蛋白基于例如其结构和功能与其它具有类似结构和表达细胞类型特异性的细胞表面抗原类似，应当与受体相互作用。可制备用于筛选的纯化499E9使得分离受体的方法成为可行。使用本发明的499E9序列的可溶性或其它构建体允许筛选或分离499E9特异受体。有多种方法可进行表达克隆，淘筛，亲和分离或以其它方式鉴定受体。
正如本领域技术人员所知，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对其进行多种改进和调整。本文所述的具体实施方案仅为举例，本发明仅由所附权利要求书和其等效物限定。
实施例通用方法某些标准方法可参见例如Maniatis et al(1982)《分子克隆实验室指南》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrooket al(1989)《分子克隆实验室指南》第2版，卷1-3，CSHPress，NY；Ausubel et al《生物学》，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；Ausubel et al(1987 and Supplements)《现代分子生物学方法》，Greene andWiley，NY；Innis et al(编辑)(1990)《PCR方法和应用指南》，AcademicPress，NY。蛋白纯化的方法包括例如硫酸铵沉淀，柱层析，电泳，离心，结晶等。参见，例如Ausubel et al(1987 and periodic supplements)；Deutscher(1990)“蛋白质纯化指南”，《酶学方法》，卷182及其它卷；和蛋白质纯化产品的使用说明，如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，CA。与重组技术组合允许与合适区段融合，如与FLAG序列或可通过蛋白酶可除去的序列融合的等效物。参见，例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白”，Setlow(编辑)《遗传工程原理和方法》1287-98，PlenumPress，NY；Crowe et al(1992)《QIAexpress高水平表达和蛋白纯化系统》，QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。细胞培养技术参见Doyle et al(编辑)(1994)《细胞和组织培养实验室技术》，John Wiley and Sons，NY。
FACS分析参见Melamed et al(1990)《流式细胞术和分选》，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY；Robinson et al(1993)《流式细胞术方法手册》，Wiley-Liss，New York，NY。合适试剂的荧光标记按照标准方法进行。实施例1小鼠499E9的克隆3W Th1或Th2细胞的产生参见Openshaw et al(1995)J.Exp.Med.1821357-1367。简而言之，Th1或Th1细胞群体来自IL12或IL14存在时抗原和抗原呈递细胞刺激的CD4+细胞。每周刺激细胞1次，共3周，然后收获细胞，重新用例如PMA和离子霉素刺激4小时。参见，Murphyet al(1996)J.Exp.Med.183901-913。
总RNA可使用例如硫氰酸胍/CsCl梯度法分离，该方法见Chirgwin，et al(1978)Biochem.185294-5299。Poly(A)+RNA使用例如OLIGOTEXmRNA分离试剂盒(QIAGEN)分离。来自这些细胞的这种RNA用来合成第1链cDNA，使用例如NotI/Oligo-dT引物(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。合成双链cDNA，与BstXI连接物连接，用NotI消化，大小分离大于0.5kb的片段，连接进入pCDSRα载体衍生物pJFE14的NotI/BstXI位点。参见Takebe et al(1985)Mol.Cell Biol.8466-472。电转化感受态大肠杆菌DH10α细胞(Gibco-BRL)用于电转化。
随机挑取独立的克隆，使用已知细胞因子cDNA混合物通过杂交筛选。从不与细胞因子探针杂交的克隆制备质粒DNA。这些克隆按照插入片段大小分组，进一步通过DNA测序鉴定。分离相应于499E9的克隆。实施例2小鼠499E9的细胞表达编码小鼠499E9的cDNA的特异探针用来确定编码该抗原的信使的组织分布。标准杂交探针可用于合适来源的RNA的Northern分析，所述来源可以是例如经刺激的细胞，处于各种生理状态的细胞，各种组织如脾、肝、胸腺、肺等的细胞，或各种物种的细胞。cDNA文库的Southern分析也可提供分布的有价值的信息。标准组织印迹或物种印迹可商购。类似技术也可用来评价可能与各种细胞类型的表达相关的诊断或医学状况。
使用合适引物的PCR分析也可使用。抗体分析包括免疫组织化学或FACS可用于确定细胞或组织分布。实施例3499E9蛋白的纯化筛选多种转染细胞系，获得相对其它细胞以高水平表达抗原的膜结合形式或可溶形式的细胞系。筛选各种细胞系，选择易于处理的有利特性。天然499E9可自天然来源分离或使用合适的表达载体在转化细胞中表达分离。表达蛋白的纯化可通过标准方法进行，或结合使用从细胞裂解物或上清中高效纯化的工程化手段。FLAG或His6区段可用于这些纯化。实施例4同源499E9基因的分离499E9 cDNA可用作杂交探针，筛选来自所需来源的文库如灵长类细胞cDNA文库。可对多种不同的物种筛选易于杂交的严紧性条件，并使用探针筛选其存在。合适的杂交条件可用来选择具有杂交特异性的克隆。
使用基于肽序列的变性探针的杂交或PCR筛选允许分离合适的克隆。或者，使用PCR筛选的合适引物会获得合适核酸克隆的富集。
类似方法可用于分离种类，多态或等位变体。种类变体使用种间杂交技术分离，基于作为探针的一个物种的全长分离物或片段的分离。
或者，针对小鼠499E9产生的抗体可用于筛选表达来自合适的如cDNA文库的交叉反应性蛋白的细胞。纯化蛋白或成分明确的肽可用于标准方法产生抗体，如上述。合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统，以产生单克隆或多克隆抗体。参见，例如Coligan(1991)《现代免疫学方法》，Wiley/Greene，Cold Spring Harbor Press。产生的抗体用于例如筛选，淘筛或分选。实施例5499E9特异性抗体的制备合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统，以产生单克隆或多克隆抗体。参见，例如Coligan(1991)《现代免疫学方法》，Wiley/Greene；Harlow andLane(1989)《抗体实验室手册》，Cold Spring Harbor Press。可制备多克隆血清或杂交瘤。在合适的情况下，结合试剂或如上所述进行荧光或其它标记或固定于底物上用于淘筛。实施例6499E9受体的分离499E9构建体表达产物可用作特异结合试剂，利用其结合特异性鉴定其结合配体如受体，正如抗体一样。499E9试剂或如上所述进行荧光或其它标记或固定于底物上用于淘筛。
结合组合物用于筛选由表达结合配体即受体的细胞系制备的表达文库。使用标准染色技术检测或分选细胞内或表面表达的受体，或者表面表达的转化细胞通过淘筛进行筛选。细胞内表达的筛选通过各种染色或免疫荧光方法进行。参见McMahan et al(1991)EMBO J.102821-2832。
或者，499E9试剂用于亲和纯化或分选表达受体的细胞。参见，例如Sambrook等或Ausubel等。
另一种策略是通过淘筛筛选膜结合受体。含受体cDNA的cDNA如上所述构建。配体可被固定并用于固定表达细胞。固定化可通过使用合适的抗体完成，所述抗体识别如499E9融合构建体的FLAG序列，或是针对第一抗体产生的抗体。选择和扩增的重复循环导致合适克隆的富集和受体表达克隆的最终分离。
噬菌体表达文库可通过499E9筛选。合适的标记技术如抗-FLAG抗体允许合适克隆的特异性标记。
本文引用作为参考的所有参考文献均同样被引用，如同每一篇文献或专利申请分别和特别引用一样。
本领域技术人员清楚，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行多种改进和调整。本文所述的具体实施方案仅为示例，本发明由所附权利要求书和其等效物限定。
序列表SEQ ID NO1为小鼠499E9核酸序列。
SEQ ID NO2为小鼠499E9氨基酸序列。(1)一般资料(i)申请人Schering Corporation(ii)发明名称哺乳动物细胞表面抗原及相关试剂(iii)序列数2(iv)通讯地址(A)收件人Schering-Plough Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)国家美国(F)邮政编码07033-0530(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机Apple Macintosh(C)操作系统Macintosh 7.5.3(D)软件Microsoft Word 6.0(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日1997年12月12日(C)分类号(vi)在先申请资料(A)申请号US 60/032,846(B)申请日1996年12月13日(viii)代理人/代理资料
(A)姓名Thampoe，Immac J..
(B)登记号36,322(C)资料/文档号DX0686 PCT(ix)通讯资料(A)电话(908)298-506 1(B)传真(908)298-5388(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度2191个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(ix)特性(A)名称/关键词CDS(B)位置125..1072(xi)序列描述SEQ ID NO1GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG60TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG120CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA GAC TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG169Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser1 5 10 15GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC217Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His20 25 30CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC265Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg35 40 45TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC313Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys50 55 60AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA361Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg65 70 75ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT409Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His80 85 90 95GAA AAC GCA GGT TTG CAG GAC TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAC ACA CTA457Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu100 105 110CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG505Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln115 120 125AAG GAA CTG CAA CAC ATT GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA553Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro130 135 140GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT601Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro145 150 155GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA649Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro160 165 170 175TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC697Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly180 185 190TGG GCC AAG ATC TCT AAC ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT745Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val195 200 205AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT793Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His210 215 220CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG841His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val225 230 235TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG889Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met240 245 250 255AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT937Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe260 265 270TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA985Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu275 280 285ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT1033Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp290 295 300GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT1082Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 315TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT1142GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC1202TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT1262GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG1322GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTGAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC1382TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT1442CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG1502GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTTATATA1562ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT1622GTGCTATAGT ATTTGATTCA AAATATTTAA AAATGTCTCA CTGTTGACAT ATTTAATGTT1682TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG TACTCGTAGC1742TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATTTCTTTA TTCTTTTTAA1802CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA1862ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC1922TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG1982TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTCTTTTTT TACAAGAGCT ACAAATTGTA2042AATTTTGTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT2102CCACTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTCTG2162AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC2191(3)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度316个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu1 5 10 15Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro20 25 30Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser35 40 45Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser
50 55 60Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile65 70 75 80Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu85 90 95Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro100 105 110Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys115 120 125Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala130 135 140Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu145 150 155 160Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser165 170 175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp180 185 190Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn195 200 205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His210 215 220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225 230 235 240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys245 250 255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr260 265 270Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile275 280 285Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala290 295 300Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 31权利要求
1.至少12个氨基酸与SEQ ID NO2具有至少约85％的序列同一性的基本上纯化的或重组的多肽。
2.包括权利要求1的多肽的融合蛋白。
3.编码权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白的分离核酸。
4.具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的分离核酸。
5.一种以下核酸a)其在30℃的洗涤条件和小于2M盐时与SEQ ID NO1杂交；或b)其中至少约30个核苷酸的区段与编码499E9多肽的核酸具有至少约85％的同一性。
6.包括权利要求4或5的核酸的重组载体。
7.包括权利要求4-6任一项的核酸或载体的宿主细胞。
8.制备多肽或融合蛋白的方法，包括在表达核酸的条件下培养权利要求7的宿主细胞。
9.包括特异性结合权利要求1的多肽的抗体或抗原结合片段的结合化合物。
10.包括权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白的组合物。
11.包括以下组分的试剂盒a)权利要求1的多肽或权利要求2的融合蛋白；b)特异性结合权利要求1的多肽的抗体；或c)权利要求4或5的核酸。
全文摘要
本发明提供了编码哺乳动物T细胞表面抗原的纯化基因,与其相关的试剂,包括纯化蛋白,特异抗体和编码该抗原的核酸。还提供了使用该试剂和诊断试剂盒的方法。
文档编号C07K16/28GK1245534SQ97181715
公开日2000年2月23日 申请日期1997年12月12日 优先权日1996年12月13日
发明者D·M·戈尔曼, J·D·马特森 申请人:先灵公司