与y染色体相关的精细胞表面抗原结构的制作方法

专利名称：与y染色体相关的精细胞表面抗原结构的制作方法
技术领域：
本发明涉及存在于精细胞(精子)上并且与Y染色体相关的抗原 结构，以及针对该抗原结构的分子，特别是抗体或抗体的部分。
本发明还涉及使得能够表征在细胞特別是精细胞(精子)中Y染 色体的存在的方法。
本发明还涉及一种方法，所述方法通过分离出已确定为雄性并携 带Y染色体的精细胞来表征哺乳动物(包括人)的后代的性别，并且 基于利用该抗原结构与针对该抗原结构的优选地经标记的分子(特别 是经标记的抗体)之间的相互作用。
作为本发明基础的技术背景和现有技术
在杂交育种和人工授精(AI)的自然条件下，后代的性别比例大 约为50°/。的雄性(XY)和50°/。的雌性(XX)。
长期以来，农民和其他动物育种者就表达了他们的愿望提高产 生具有所选择的性别的后代的概率(优选通过在哺乳动物授精之前选 择携带Y染色体或携带X染色体的精细胞)。
除了显而易见的生理学方面的考虑外，按照性别来选择后代还具 有重要的经济意义，当在生产动物性食品(羊的、牛的和猪的)方面 考虑这些应用时，以及当在动物(特别是马和狗)竟赛的范围内考虑 这些应用时。
已采取了各种不同的技术方向以在哺乳动物中实现性别选择，这 既是为了在物种的动物技术方面的意义，也是为了那些濒临灭绝的物 种，以及还为了家畜和为了人类的辅助生殖。为此存在有两种备选方案将携带X染色体的精细胞与携带Y染色体的精细胞分开；或者在 再植入之前确定胚胎的性别。
在人类中，选择胚胎的性别牵涉强烈的伦理学约束，这一约束可 通过性别鉴定而被消除。精细胞的性别鉴定还可以具有临床应用，以 在人类中预防与X染色体连锁的疾病，例如迪谢纳肌营养不良、血友 病A或B、视网膜脱色素、莱-尼综合征或脆性X综合征(其导致精神 发育迟緩)(ZARUTSKIE等人，1989 )。存在大约6000种遗传异常， 而其中超过370种与X染色体连锁(C0TIN0T等人，1993; JOHNSON 等人，1993 )。
已进行了各种尝试以实现根据性别来选择后代。那些在获得所需 结果方面显得最令人感兴趣的尝试已被导向进行X或Y精细胞的获取 和选择。
为了能够有效，任何分离技术应当利用X精细胞和Y精细胞之间 的表型差异。将携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子相分开， 有赖于检测这些表型之间的至少一种差异。在这种背景下，已基于X 精细胞和Y精细胞之间各种明显的差异(化学的或物理的)(例如荧 光、大小、质量、密度、游动速度、对pH的敏感性、对Sephadex的 附着等的差异)进行了分离试验。
还已提出了携带Y染色体的精子与携带X染色体的精子的免疫学 分离方法。
专利US 4448767描述了一种方法，该方法需要形成针对能够区分 X细胞与Y细胞的特异性细胞表面标记物的抗体。
已经使用H-Y抗原作为标记物来分开携带X染色体或Y染色体的 精细胞(Ali等人，1990; Peter等人，1993 )。然而，其他研究者报 导，他们使用H-Y抗原标记物不能分离X型或Y型细胞(Hendriksen 等人，1993; Sins等人，1998 )。目前的共识是，H-Y抗原不能够允 许分开携带X染色体或Y染色体的细胞。
专利US 5660997描述了性连锁的膜蛋白(SAM蛋白)的用途。这 些SAM蛋白的特征在于具有在SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE )上测定的
5特定分子量，和通过在pH梯度凝胶上停止移动(IPG)而测定的等电 点(PI )。在Chinchilla狗中，SAM-X蛋白具有分别为19 kDa、 25 kDa、 29 kDa、 32 kDa、 39 kDa、 72 kDa和120 kDa的分子量，而Y染色体 的SAM蛋白具有15 kDa、 45 kDa、 55 kDa、 64 kDa和125 kDa的分 子量。
然而，该专利申请没有给出该方法有效性的数据，而且没有给出 证据证明这些特征性的蛋白质确实与细胞的X或Y染色体连锁，以及 因而所述连锁在哺乳动物物种中具有显著的性比偏离。
专利US 5021244描述了特异性地结合在携带X染色体(X-SAM) 的细胞的膜上的抗体。所述抗体(优选单克隆抗体)基本上没有能够 与这样的膜蛋白相结合的抗体，所述膜蛋白与Y染色体相关或与H-Y 抗原相关，或与存在于细胞质膜上的性别非特异性组分相关。
专利申请CA 1341328描述了与性别相关的膜蛋白，其中包括一种 分子量为9. 6 kDa和等电点为6. 58的蛋白质。
发明目标
本发明旨在提供新型精细胞表面抗原结构，其与Y染色体相关， 并且使得能够区分携带Y染色体的精细胞(精子)与携带X染色体的 细胞。
本发明还旨在提供特异性地针对该抗原结构的优选地经标记的分 子，特别是经标记的抗体，例如单克隆抗体或其部分，以便利用该抗 原结构和这些分子之间的相互作用来特异性地标记这些细胞，并且还 为了能够区分和任选地分开仅携带Y染色体的细胞与其他细胞(携带 X染色体和/或任选地携带Y染色体)。本发明还涉及通过所述经区分的细胞来进行哺乳动物授 精的方法。
发明概述本发明涉及特异于Y染色体的精细胞(精子)表面抗原结构，其 具有小于15 kDa，优选小于10 kDa的分子质量，更特别地具有5至 10kDa的分子质量，以及大于9，优选约9至约11，更特别地约9至 约10的等电点。优选地，该抗原结构具有分别约5 kDa的分子质量和 约9. 35的PI，约7 kDa的分子质量和约9. 07的PI，或者约10 kDa
的分子质量和大于或等于10的PI。
该抗原结构的特异性可以通过Western印迹法来测定，所述 Western印迹法特异性地和唯一地标记仅存在于Y染色体上的该目的 抗原结构。
因此，本发明的首要目标涉及使用本发明的目的抗原结构来相对 于不表达Y染色体的细胞(仅包含X染色体的细胞)而言特异性地标 记表达Y染色体的细胞。
该分析可以通过对细胞的表面进行标记而在活细胞上进行，或者 例如通过Western印迹法在细胞提取物上进行。
本发明的另一个方面涉及优选地经标记且针对(和特异于)该抗 原结构的分子。
优选地，这些分子为(特异性地)针对该抗原结构的经标记的抗 体或者这些抗体的高变且特异的部分。这些分子还可以是 nanobodies ,其是一类新型类别的源自抗体的治疗性蛋白质。这些分 子的实例为来自骆驼科(Camelidae)的抗体的衍生物，其没有抗体的 特异性轻链但保留了 (特异性地)结合抗原的完整能力。因此，有可 能获得仅由抗体末端的可变结构域部分构成的nanobodies (www, ablynx. com) e
优选地，所述抗体为单克隆抗体。
本发明的另一个方面涉及能够产生这些抗体或这些抗体的高变且 特异的部分的(杂交瘤)细胞。
本发明还涉及(性别鉴定)诊断试剂盒，其包含特异性地针对该 抗原结构的所述分子(任选地经标记的)，特别是所述抗体或所述抗体的高变部分，以及用于表征这些抗原结构和(特异性地)针对这些 抗原结构的所述分子之间的相互作用的所有介质和试剂。
这些介质和试剂例如为洗涤溶液和针对(特异于)该抗原结构的 所述分子的标记成分(例如比色的、发光的、化学发光的、生物发光 的、荧光的或放射性的标记物)。这些介质和试剂还可以包括能够与 针对(特异于)该抗原结构的所述分子相互作用的固体支持物。能够 与这些分子相互作用的固体支持物为珠粒、琼脂糖珠或金属珠(特别
是磁珠)，其具有适当的大小(约50nm至约4或9jum)从而可以有 效地结合和标记活细胞，并随后从精细胞混合物中分离出特异地携带 Y染色体的精细胞。
本发明的试剂盒还可以包含用于证明由所述经区分的精子所携带 的染色体的性别特征的工具。这些工具由X染色体或者Y染色体的特 异基因的基因扩增试剂盒构成。这些工具优选地由使得能够进行基因 扩增的引物、酶和反应介质构成，所述基因扩增通过选自PCR、 LCR 或NASBA的方法来进行。
本发明的试剂盒还可以用于确认其他的细胞分离手段(通过物理 的、化学的或生物技术的方法)是否有效。因此，本发明的试剂盒可 以用作用于证明在细胞上或在细胞提取物中存在Y染色体的工具。
本发明的另一个方面涉及包含特异性地针对本发明的抗原结构的 所述分子的固体支持物，所述分子以直接或间接的方式(通过一对分 子(结合对)例如生物素和链霉抗生物素蛋白/ (或)抗生物素蛋白的 相互作用)固定在固体支持物的表面上，并且能够通过所述抗原结构 和所述分子之间的相互作用而特异性地结合包含Y染色体的精细胞。
所述固体支持物可以例如由色镨柱、多孔板、珠粒(其大小优选 为约50nm至约4Mm或约9pm，优选约100至约400或约500纳米) (特别是磁珠)的固体支持物构成，其允许细胞的该抗原结构和针对 (特异于)该抗原结构的分子之间的相互作用，这使得能够区分和有 利地使得能够分开各种不同类别的细胞(分开仅携带Y染色体的细胞 与其他细胞(携带X染色体的细胞，和任选地，携带Y染色体的其他
8细胞))。
本发明还涉及用于通过利用该抗原结构和针对(特异于)该抗原 结构的这些分子(特别是这些抗体或其部分)之间的相互作用来区分
(非治疗性的)和任选地分开携带Y染色体或X染色体的细胞的方法。 本发明的方法包括下列步骤
-在适合于获得所述抗原结构和所述分子之间的特异性相互作用 (结合或标记)的条件下，使精细胞与(特异性地)针对本发明抗原 结构的分子或本发明的固体支持物(包含所述分子)接触，所述抗原 结构是Y染色体所特异性的并且存在于所述细胞的表面上；
-通过所述分子和所述抗原结构之间的相互作用而结合或标记携 带Y染色体的细胞，所述标记过程通过由于存在于细胞表面上的所述
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-任选地，分开被所述分子结合或标记的细胞与未被所述分子结 合和/或标记的细胞；
-任选地，收集被结合或标记的细胞，或者其他细胞(未被结合 和未被标记且主要携带X染色体)；和
-任选地，用所述细胞对哺乳动物进行一次或几次授精(非治疗 性的)(用经收集的且仅携带Y染色体的所述细胞对哺乳动物进行授 精)，以及任选地，用经收集的且主要携带X染色体的其他细胞对哺 乳动物进行一次或几次授精(非治疗性的)。
根据本发明，针对(特异于)所述抗原结构的分子为抗体(优选 单克隆抗体)或者抗体的高变部分。这些抗体可以通过比色的、发光 的、化学发光的、荧光的或放射性的标记成分直接或间接地进行标记。 该标记过程可以是直接或间接的标记。
直接标记是指标记物(比色的、发光的、荧光的、放射性的)在 所述分子上，优选在所述抗体上共价结合。
间接标记是指第一分子与已结合至该标记物的第二分子结合。例 如可以使第一分子(为抗体)与(特异性地)针对一抗的恒定部分的第二分子(二抗)发生反应，所述二抗优选与比色的、发光的、化学 发光的、荧光的或放射性的标记物，能够产生该标记物的酶，或者固 体支持物(珠粒)共价结合。
在本发明的方法中，细胞的表征是通过使本发明的分子与细胞进 行接触来获得的。该操作在这样的介质中进行，所述介质允许所述细 胞存活且还使得能够消除任何的组分干扰，所述组分可能干扰所述细 胞和针对(特异于)细胞的该抗原结构的所述分子之间的相互作用。
分开和收集仅携带Y染色体的细胞和其他细胞的步骤借助于用与 该抗原结构相互作用的分子对细胞进行标记来施行。优选地，该分开 步骤可以固体支持物(优选地，磁珠)上进行，在所述固体支持物上 固定有所述细胞可能与之相互作用的所述分子。
允许洗脱未被结合或未被标记的其他细胞的介质使得能够获得有 效的分开。分开和任选地收集被结合或标记的细胞这一步骤是本领域 技术人员已知的。
还通过本领域技术人员熟知的方法来进行下述步骤用仅包含Y 染色体的细胞对哺乳动物进行授精，和/或任选地，用主要包含仅携带 X染色体的细胞(和任选地，更低比例的携带Y染色体的细胞)的精 液对哺乳动物进行授精。
术语"主要包含仅携带X染色体的细胞的精液"是指这样的事实 大于约50%，优选大于约75%,更特别地大于约90%或约95%的比例的 细胞仅携带X染色体。
通过这些授精步骤，可能获得仅为雄性的后代，或者基本上为雌 性，优选地仅为雌性的后代。
可授精的哺乳动物优选为对于生产动物性食品而言重要的哺乳动 物，例如羊、牛和猪(优选牛)，但也可以是诸如马、兔、狗或猫的 家畜或者属于濒临灭绝的物种的哺乳动物。所述哺乳动物还可以是灵 长类，包括人，尤其是其双亲为X染色体连锁遗传疾病携带者的受试 者，所述X染色体连锁遗传疾病例如为迪谢纳肌营养不良、血友病A 或B、视网膜脱色素、莱-尼综合征或脆性X综合征(其导致精神发育迟緩)。
本发明的方法可以任选地与将携带Y染色体或X染色体的细胞分 开的其他方法相结合，例如基于与携带X染色体的细胞或携带Y染色 体的细胞相关的化学或物理差异的分离方法，所述化学或物理差异例 如为荧光、大小、质量、密度、游动速度、对pH的敏感性、对Sephadex 的附着等的差异。
本发明方法的各个不同步骤可以任选地与在全体所选择的细胞上 或在其样品上进行的细胞性别的特异表征步骤相组合，以确保这些细
胞表征步骤以最佳方式进行。
该表征步骤可以例如由下列构成 一个或多个基因扩增步骤(通 过PCR、 LCR、 NASBA ...)，或者一个或多个给细胞添加一种或多种 特异于X染色体或Y染色体的标记物的步骤。
根据本发明，针对该抗原结构(特异于该抗原结构)的分子还可 以是能够破坏所述细胞的分子，例如裂解性抗体或者这样的分子，所 述分子包含能够被特异性地识别的标记物并且使得能够通过适当的手 段(激光)来破坏携带所述表面抗原结构(即与Y染色体相关的精细 胞表面抗原结构)的经标记的细胞。
因此，该方法可如此进行修改，即借助于经由特异性地针对本发 明的所述抗原结构的分子或者经由使得能够只特异性地消除经标记的 细胞的手段(激光)破坏经标记的细胞，来分开被所述分子结合或标 记的细胞与未被所述分子结合或标记的其他细胞。随后，该方法将包 括收集未被结合和未被标记的且主要携带X染色体的细胞；和任选地， 仅用这些未被结合和未被标记的细胞来对哺乳动物进行授精。
通过参考附图，在以本发明方法的非限制性举例说明方式给出的 下面的实施方案中将更详细地描述本发明。
附图简述
3_1_显示了细胞的总蛋白质组分析，其使得能够分离出特异于Y型细胞的蛋白质级分(级分F)。
图2显示了该蛋白质级分的三种同种型，其特征为它们在电泳凝 胶上的分子量.
图3显示了用本发明的抗体来进行的精细胞体内免疫定位的标记 过程。图3中显示了经标记的和未标记的细胞。
发明详述
1. 获得特异的蛋白质级分
对借助于人工阴道例如从牛中获取以便随后进行稀释并在PUC麦 管(paillettes enPUC)中冷藏处理的精子进行总蛋白质组分析，这 使得能够分离出特异于Y型细胞的蛋白质级分(级分F)(

图1)。
该蛋白质级分包含三种同种型
-分子质量分别为5、 7和10 kDa。
2. 获得抗体
将经鉴定的级分注射给两只兔子以获得抗体。
3. 验证抗体的特异性
已就其特异性测试了包含多克隆抗体的兔血清所进行的 Western印迹法清楚地表明，该多克隆抗体特异于携带Y染色体的精 细胞，因为只有以50/50从雄性和雌性细胞中提取的蛋白质级分与血 清发生反应。
按照"碱性磷酸酶缀合底物试剂盒"17016432 (BI0-RAD)的供应 商的指示，通过1: 500比例的一抗稀释物来实施该实验方案。
将无性别以及性别为X的细胞的蛋白质提取物置于12. 5%的丙烯 酰胺电泳凝胶上；将此细胞提取物转移至PVDF膜上后，在4X:下将膜 用TBST溶液(含有0. 15%Tween-20的Tris緩冲盐水)饱和过夜。在 用TBST洗涤三次后，将膜与以用TBST稀释至的适当稀释度(即1/500 )
12进行测试的兔血清(通过注射目的色谱级分而获得的)反应1小时30 分钟。在用TBST再次洗涤三次后，在根据供应商的方案在TBST緩冲 液中进行稀释后，添加用碱性磷酸酶标记的山羊"抗兔免疫球蛋白" 抗体(例如Biorad的产品170-6460 )并保持2小时，再次进行三次 洗涤，接着在没有Tween-20的TBS中进行最后一次洗涤，并根据供应 商的指示(Biorad的170-6432 )添加5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和 氮蓝四唑，直至获得结果。阳性结果相应于在膜上在目的蛋白质的位 置处出现底物沉淀。
在图2上观察到3条蛋白质条带，它们只在包含携带混合的X和 Y染色体的细胞的提取物中出现，而在包含仅携带X染色体的细胞的 蛋白质提取物中不出现条带。
4,验证该蛋白质的细胞定位精细胞上的免疫定位实验方案 生物材料由以存活状态获取和使用的细胞构成。将500 pi新鲜
精液在4ml处于37TC的稀释剂中进行稀释。在带至4X:之前，让精液
慢慢恢复至环境温度。
5.在活细胞上的免疫定位(在Eppendorf管中)
-抽取300 ju 1经稀释的精液并置于无菌Eppendorf管中;
—以1: 50的最终稀释度添加一抗；
-在4TC下温育4小时至过夜，不时进行摇动；
一以600 g离心2分钟；
-除去上清液；
-加1 ml稀释剂以漂洗和悬浮细胞； -以600 g离心2分钟； -除去上清液；
-在500ju 1稀释剂中重悬浮细胞； —以1: 50的最终稀释度添加二抗； -在环境温度下温育1至2小时或者在4'C下温育过夜；-以600 g离心2分钟； —除去上清液；
-添加1 ml稀释剂以进行漂洗； -以600 g离心2分钟； -除去上清液；
-在300 ml中重悬浮粒状沉淀； -取20ju 1置于栽玻片上； -放置载玻片； —在荧光显微镜下观察。
并非所有以5 0/5 0的比例包含X型和Y型细胞的精液样品的细胞 都被标记。看起来标记分布按35至50°/。的被抗体标记的细胞这样的比 率来进行。
在进行允许抗体附着的处理后，细胞仍是活的，不论是否被抗体 结合、标记。
因此，本发明的抗体特异于Y型细胞的表面(图3)。在图3中， 标记出现在图的灰色部分，白色部分表示细胞。
6. 细胞亚群的获得
纯化血清的抗体以便去除兔血清蛋白质，特别是白蛋白。 实验方案按照"蛋白A抗体纯化试剂盒"PURE-1A试剂盒 (SIGMA-ALDRICH)的供应商的指示来进行。
使纯化的抗体固定在磁珠上。基于所述抗体对于携带Y染色体的 精子的表面蛋白质的特异性，将这些固定在珠粒上的抗体用于制备精 细胞的亚群。按照DYNAL， dynabeads M450 epoxy试剂盒的供应商的 指示来施行该实验方案。
7. 产生两个亚群的操作程序
在获取后尽可能快地使用细胞。将细胞在允许保持细胞的完整性 并同时允许抗体附着的稀释剂中进行稀释(以2xlQ7个细胞/ml)。使细胞与抗体接触30分钟，所述抗体或者直接偶联(接枝)到磁珠(大 小为约50至约500 mn或约9jam，优选约100至约400或500 nm)上， 或者借助于结合包含在血清中的所述抗体的二抗(山羊抗兔抗体)而 间接偶联到这些珠粒上，该接触于约41C至约25X:的温度在轻轻摇动 下和于约41C至约25E的温度进行12。然后，将与配备有磁珠的抗体 相附着的细胞置于磁场中以便保留下Y型细胞。回收含有X细胞的上 清液。这样，上清液的精细胞可供人工授精使用。
8. 验证两个经表征的细胞亚群的性别
在所述两个细胞群体(结合和未结合在珠粒上的)中进行每种性
别的细胞比例的验证测试。这包括扩增X染色体或Y染色体所特异的
基因。对这两个群体的构成所进行的该验证测试使得能够比较在所述 两个群体中每种细胞类型的比例。
理论上认为，从所进行的观测来看，被保留的群体，即所谓的Y 型细胞，只包含携带Y染色体的细胞。然而，包含在上清液中的细胞 群体，即所谓的X型细胞，主要表现为X型细胞，但还包含一定比例 的携带Y染色体的细胞。这是因为，根据原位免疫定位的观测，看来 并非所有Y型精子都在其表面上携带所述抗原。这些观测表明，所述 目的结构存在于精子的头部区域和鞭毛的第二部分区域内。
将包含在上清液中的细胞群体用于人工授精。所获得的胚胎的性 别鉴定给出了下面的在性比方面的结果(在进行中)。
9. 在牛中用精子进行授精的方法
在-196t:的液氮中，将根据本发明的方法选择出的细胞保存在薄 壁PUC麦管中。
将所述麦管引入输精枪(pistolet)(—次性的覆盖有塑料的金 属管)中，所述输精枪包含能够将麦管中所包含的液体推出的活塞。 该输精枪使得能够通过手工操作将细胞注射进位于两个子宫角底部处 的子宫颈中。
权利要求
1. 精细胞表面抗原结构，其与Y染色体相关，并且具有5kDa至12kDa的分子量和大于9的等电点。
2. 根据权利要求1的抗原结构，其特征在于，所述抗原结构的等 电点在9和11之间。
3. 根据权利要求1的抗原结构，其特征在于，所述抗原结构具有 5 kDa的分子量和9. 35的等电点，7 kDa的分子量和9. 7的等电点， 或者10 kDa的分子量和大于或等于10的等电点。
4. 特异性地针对根据权利要求1至3的抗原结构的分子。
5. 根据权利要求4的分子，其特征在于，所述分子是抗体或抗体 的高变部分。
6. 根据权利要求5的分子，其特征在于，所述分子是单克隆抗体。
7. 性别鉴定试剂盒，其包含根据前述权利要求4至6中任一项的 分子，和任选地，根据权利要求1至3的抗原结构。
8. 固体支持物，其包含根据前述权利要求4至6中任一项的分子， 所述分子固定在所述固体支持物的表面上。
9. 根据权利要求8的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物 包括珠粒，优选》兹珠。
10. 根据权利要求8的固体支持物，其特征在于，所述固体支持 物包括直径为50 nm至9jum,优选100 nm至400 nm的珠粒。
11. 用于区分携带Y染色体的精细胞与携带X染色体的精细胞的 方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟-使所述细胞与根据前述权利要求4至6中任一项的分子或者根据 权利要求8至10中任一项的固体支持物接触，在适合于获得所述分子 或所述固体支持物和权利要求1至3的抗原结构之间的结合的条件下；-通过所述分子和所述抗原结构之间的相互作用而结合或标记携 带Y染色体的细胞；-任选地，分开被所述分子标记或结合的分子与未被所述分子标记或结合的细胞；-任选地，收集被标记或结合的细胞，或者未被标记和未被结合的 细胞。
全文摘要
本发明涉及与Y染色体相关的精细胞表面抗原结构；针对该抗原结构的分子，特别是抗体；以及使得能够通过该抗原结构与针对该结构的分子之间的相互作用来表征仅携带Y染色体的细胞的方法。
文档编号C12N5/00GK101501074SQ200780029988
公开日2009年8月5日 申请日期2007年6月21日 优先权日2006年6月22日
发明者L·列格奥伊斯, S·杜邦-德威尔 申请人:基因扩散公司