专利名称：乳腺癌干细胞分离方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞分离方法，尤其是一种乳腺癌干细胞分离方法，属于肿瘤研究技术领域。
背景技术：
2003年Al-Hajj等利用乳腺癌细胞表面抗原的差异，使用特异性荧光标记的抗体和流式细胞技术，将乳腺癌细胞分选为单独的群体，再将分选出不同表型的细胞分别注射到免疫缺陷小鼠体内，结果发现只有表面抗原标志为ESA+Lin-CD44+CD24-/low的一小群细胞具有连续性成瘤特性，并唯一能够自我复制，启动肿瘤的发生，且其比例很小，仅占肿瘤细胞的2％，这就是乳腺癌干细胞。此外，也可用干细胞功能性指标SP表型来分选肿瘤干细胞。2004年，Kondo等在C6、MCF-7、B104和Hela四个细胞系中检测到了SP细胞，其中MCF-7中SP细胞占2％。但是，同正常组织中的干细胞相似，由于乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中所占的比例低，仅占2％左右，直接用流式细胞仪来分选难度大，效果差，分选后乳腺癌干细胞纯度不够高，总的来说分选的效率不高。
另外，1987年，Ponti等发现通过体外干无血清培养方式能够将使肿瘤干细胞存活下来，而非肿瘤干细胞则逐渐死亡，从而可以使肿瘤干细胞的含量提高。上述方法虽然较简单，能够使肿瘤干细胞的含量提高，但是此方法较为粗略，使肿瘤干细胞富聚的能力有限，不可能达到很高的分选效率和纯度(如95％以上)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种可以保证高分选效率和分离纯度的乳腺癌干细胞分离方法，为进一步研究乳腺癌干细胞的各种生物学特性提供条件。
为了解决以上技术问题，本发明的乳腺癌干细胞分离方法之一包括以下步骤1)将乳腺癌细胞系或原代乳腺癌组织消化成单细胞悬液；2)按预定密度和层数配置不同密度Percoll分离液，按密度高低依次叠加，制成Percoll不连续密度梯度分离液；3)将消化后的单细胞悬液叠加到Percoll不连续密度梯度分离液顶端，离心分离；4)吸出离心后Percoll分离液中分层的各亚群细胞，PBS洗；5)将分离出的各亚群细胞中每个亚群各设实验管和对照管，实验管和对照管分别加入Hoechst 33342以及Hoechst 33342、Verapamil至预定终浓度，水浴并PBS洗后，用流式细胞仪检测出肿瘤干细胞比例最高的亚群；6)如该肿瘤干细胞比例最高的亚群达到预定的富聚度，则用流式细胞仪分选备用；7)如该肿瘤干细胞比例最高的亚群未达到预定的富聚度，则调整Percoll分离液的密度，重复以上相关步骤，直至筛选出肿瘤干细胞达到预定富聚度的Percoll分离液密度，再用流式细胞仪分选已富聚亚群中的肿瘤干细胞备用。
本发明的乳腺癌干细胞分离方法之二包括以下步骤1)将乳腺癌细胞系或原代乳腺癌组织消化成单细胞悬液；2)在无血清培养液中添加生长因子，制备成无血清培养液；3)将消化后的单细胞悬液置于无血清培养液中，培养预定时间；4)将经培养富聚的肿瘤干细胞消化成单细胞悬液；5)将步骤4)的单细胞悬液分为实验管和对照管，实验管中加入CD44-FITC、CD24-PE，对照管中不加，PBS洗后用含多聚甲醛的PBS液重悬固定细胞，用流式细胞仪检测经无血清培养富聚后肿瘤干细胞的比例；6)如以上无血清培养后肿瘤干细胞含量达到预定富聚度，则用流式细胞仪分选备用；7)如以上无血清培养后肿瘤干细胞含量仍未达到预定富聚度，则调整无血清培养的时间，重复以上相关步骤，直至达到预定富聚度，再用流式细胞仪分选已富聚的肿瘤干细胞备用。
总之，本发明克服了现有分离方法的存在的问题，首先通过Percoll分选或无血清培养，使乳腺癌中的肿瘤干细胞富聚，再通过流式细胞仪精分选，从而保证了分选的效率，经过初步富聚后肿瘤干细胞相关亚群(SP细胞或CD44+CD24-/low细胞)比例可达25％以上，再经过流式细胞仪精分选，肿瘤干细胞的纯度可达到99％以上，从而为进一步研究乳腺癌干细胞的各种生物学特性提供条件。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例一的检测图，反映通过Percoll分选，人乳腺癌细胞系MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群(SP细胞)富集，比例已达25.23％。
图2为本发明实施例二的检测图，反映通过无血清培养，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的肿瘤干细胞相关亚群(CD44+CD24-/low细胞)富聚，比例已达到了29.35％。
具体实施例方式
实施例一本实施例按照以下步骤分离乳腺癌细胞系MCF-7中的肿瘤干细胞相关亚群1)将乳腺癌细胞系MCF-7用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液。
2)配置六个不同密度Percoll分离液，密度分别为1.035g/ml、1.040g/ml、1.050g/ml、1.060g/ml、1.070g/ml、1.080g/ml，每个密度层2ml，按密度高低依次叠加，制成Percoll不连续密度梯度分离液。
3)将制备好的单细胞悬液仔细叠加到Percoll不连续密度梯度分离液顶端，2000转/min离心30分钟。
4)仔细吸出离心后Percoll分离液中分层的各亚群细胞，PBS洗两遍备用。
5)上述分离出的各亚群细胞每个亚群各设实验管和对照管，每管细胞数105个/ml，实验管加入Hoechst 33342至终浓度为5μg/ml，对照管同时再加入Verapamil至终浓度为50μg/ml，37℃水浴90min，PBS洗2遍后用流式细胞仪检测各亚群中SP细胞比例，发现第四层(D亚群)中SP细胞比例高达25％(参见图1)。
6)流式细胞仪进一步分选D亚群中的肿瘤干细胞相关亚群(即SP细胞)备用。
实施例二本实施例按以下步骤分离乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的肿瘤干细胞相关亚群1)将乳腺癌细胞系或原代乳腺癌组织消化成胰酶-EDTA单细胞悬液。
2)在DMEM/F12无血清培养液中添加EGF、bFGF、胰岛素等生长因子，制备成无血清培养液。
3)将消化后的单细胞悬液置于无血清培养液中，培养3周时间。
4)将无血清培养3周后肿瘤干细胞已富聚的MDA-MB-231，用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液。
5)将上述细胞悬液分为实验管和对照管，每管细胞数106个/ml，实验管中加入CD44-FITC、CD24-PE，对照管中不加，室温下避光保存20min，PBS洗2遍后用含1％多聚甲醛的PBS液400ul重悬固定细胞，流式细胞仪检测肿瘤干细胞相关亚群(即CD44+CD24-/low细胞)含量已达近30％(参见图2)。
6)流式细胞仪进一步分选上述已富聚的肿瘤干细胞相关亚群(CD44+CD24-/low)。
以上实施例的方法综合了现有分离方法的优点，切实可行，可以保证分选后肿瘤干细胞(SP细胞或CD44+CD24-/low细胞)纯度达到99％以上。
权利要求
1.一种乳腺癌干细胞分离方法，包括以下步骤1)将乳腺癌细胞系或原代乳腺癌组织消化成单细胞悬液；2)按预定密度和层数配置不同密度Percoll分离液，按密度高低依次叠加，制成Percoll不连续密度梯度分离液；3)将消化后的单细胞悬液叠加到Percoll不连续密度梯度分离液顶端，离心分离；4)吸出离心后Percoll分离液中分层的各亚群细胞，PBS洗；5)将分离出的各亚群细胞中每个亚群各设实验管和对照管，实验管和对照管分别加入Hoechst 33342以及Hoechst 33342、Verapamil至预定终浓度，水浴并PBS洗后，用流式细胞仪检测出肿瘤干细胞比例最高的亚群；6)如该肿瘤干细胞比例最高的亚群达到预定的富聚度，则用流式细胞仪分选备用；7)如该肿瘤干细胞比例最高的亚群未达到预定的富聚度，则调整Percoll分离液的密度，重复以上相关步骤，直至筛选出肿瘤干细胞达到预定富聚度的Percoll分离液密度，再用流式细胞仪分选已富聚亚群中的肿瘤干细胞备用。
2.根据权利要求1所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述消化采用胰酶-EDTA实现。
3.根据权利要求1或2所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述步骤2)配置四至八个不同密度Percoll分离液，各邻近分离液密度差控制在分别为0.002g/ml-0.015g/ml。
4.根据权利要求1或2所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述步骤2)配置六个不同密度Percoll分离液，密度分别为1.035g/ml、1.040g/ml、1.050g/ml、1.060g/ml、1.070g/ml、1.080g/ml，每个密度层2ml，按密度高低依次叠加，制成Percoll不连续密度梯度分离液。
5.根据权利要求4所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述步骤5)中每管细胞数105个/ml，实验管加入Hoechst 33342至终浓度为5μg/ml，对照管同时再加入Verapamil至终浓度为50μg/ml，37℃水浴90min，PBS洗2遍后用流式细胞仪检测各亚群中SP细胞比例。
6.一种乳腺癌干细胞分离方法，包括以下步骤1)将乳腺癌细胞系或原代乳腺癌组织消化成单细胞悬液；2)在无血清培养液中添加生长因子，制备成无血清培养液；3)将消化后的单细胞悬液置于无血清培养液中，培养预定时间；4)将经培养富聚的肿瘤干细胞消化成单细胞悬液；5)将步骤4)的单细胞悬液分为实验管和对照管，实验管中加入CD44-FITC、CD24-PE，对照管中不加，PBS洗后用含多聚甲醛的PBS液重悬固定细胞，用流式细胞仪检测经无血清培养富聚后肿瘤干细胞的比例；6)如以上无血清培养后肿瘤干细胞含量达到预定富聚度，则用流式细胞仪分选备用；7)如以上无血清培养后肿瘤干细胞含量仍未达到预定富聚度，则调整无血清培养的时间，重复以上相关步骤，直至达到预定富聚度，用流式细胞仪分选处已富聚的肿瘤干细胞备用。
7.根据权利要求6所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述消化采用胰酶-EDTA实现。
8.根据权利要求6或7所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述步骤2)在DMEM/F12无血清培养液中添加EGF、bFGF、胰岛素生长因子，制备成无血清培养液。
9.根据权利要求8所述乳腺癌干细胞分离方法，其特征在于所述步骤5)中每管细胞数106个/ml，实验管中加入CD44-FITC、CD24-PE后，室温下避光保存20min，PBS洗2遍后用含1％多聚甲醛的PBS液400ul重悬固定细胞，再用流式细胞仪检测分选肿瘤干细胞相关亚群。
全文摘要
本发明涉及一种乳腺癌干细胞分离方法，属于肿瘤研究技术领域。该方法包括将癌细胞消化成单细胞悬液；配成Percoll不连续密度梯度分离液；叠加单细胞悬液；离心分离各亚群细胞；用实验管和对照管对比检测；调整Percoll分离液的密度，直至筛选出肿瘤干细胞相关亚群含量达到预定富聚度，再用流式细胞仪进一步精分选。本发明结合了现有分离方法的优点，通过Percoll分选或无血清培养，使乳腺癌中的肿瘤干细胞富聚，再通过流式细胞仪精分选，从而保证了分选的效率。初步富聚后肿瘤干细胞比例可达25％以上，再进一步用流式细胞仪分选后纯度可达到99％以上，从而为进一步研究乳腺癌干细胞的各种生物学特性提供条件。
文档编号C12N5/095GK101050452SQ200710021078
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月27日 优先权日2007年3月27日
发明者王水, 刘晓安, 许健, 凌立君 申请人:江苏省人民医院