一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术与生命科学技术领域，涉及一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]在肿瘤的研究与临床治疗中，人们逐渐发现了肿瘤组织的异质性，即在实体肿瘤中，每个肿瘤细胞在功能与形态上均具有差异，而有极少一部分细胞具有干细胞活性，具有自我更新与增殖分化的潜能，是肿瘤生长的源动力，同时是现阶段肿瘤治疗后复发转移的原因，因此鉴别肿瘤干细胞，靶向杀伤肿瘤干细胞是治疗肿瘤的新方法与策略。
[0003]现阶段乳腺癌干细胞的筛选方法主要采用⑶44+⑶24—、ALDH+和其他一些相关表面标志物进行筛选，然而研究证实这些鉴定方法筛选出来的乳腺癌肿瘤干细胞只具有极少的交集，因此目前对于乳腺癌干细胞的筛选并没有金标准，此外这些表面标志物的筛选方法，通常需要将细胞固定处理，细胞死亡后检测这些细胞其他基因的表达情况，无法进行后续的培养与相关研究。
[0004]本发明采用干细胞的重要转录因子S0X2做为鉴定乳腺癌干细胞的指标，筛选方法不是通过固定细胞后对S0X2进行免疫荧光标记进行，而是使用间接反映S0X2表达情况的S0X2启动子荧光报告载体实现的，即转染了报告载体的细胞，高表达S0X2的细胞同时高表达Tomato荧光蛋白，荧光信号强度反映每个细胞S0X2分子表达水平。采用流式细胞分选技术能够从乳腺癌细胞中分选出具有干细胞活性的乳腺癌肿瘤干细胞，细胞保持良好的活性，并能够进行后续的研究工作。
[0005]目前尚无分选乳腺癌肿瘤干细胞的标准分子与方法，且各种方法所筛选出的肿瘤干细胞之间几乎没有交集，同时现阶段各方法筛选后的细胞已经被固定死亡，无法进行后续的研究。因此急需一种更为广泛应用的筛选分子与方法，能够筛选活的肿瘤干细胞并进行下一步的研究。
【发明内容】
[0006]基于目前乳腺癌干细胞的筛选方法存在的局限性和缺陷，本发明提出一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法，该方法旨在采用能够反映S0X2表达水平的荧光蛋白报告系统来筛选乳腺癌干细胞，筛选出来的细胞可以继续生存并供下游的研究工作。
[0007 ]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
[0008]1、Sp-Tomato荧光报告载体的构建
[0009]I)从人类基因组中调取S0X2启动子区域:
[0010]针对S0X2启动子的序列设计调取扩增弓I物
[0011]Fff:5'-GGTACCGGCCAAAGAGCTGAGTTGGA-3’，
[0012]RV:5’-AAGCTTGAGGCAAACTGGAATCAGGATC-3’，
[0013]以人乳腺癌细胞系MCF-7的基因组DNA为模板，采用保真酶进行PCR扩增，得到S0X2启动子区域，连接到T载体经测序后确定无误；
[0014]2)将S0X2启动子区域插入pGL-3basic中，并检测虫荧光素酶活性:
[0015]将S0X2启动子区域从T载体酶切后连入pGL-3basic虫荧光素酶活性报告载体，并转入乳腺癌细胞系中检测其活性，虫荧光素酶活性直接反应S0X2启动子活性；
[0016]3)将虫荧光素酶的开放阅读框替换为Tomato荧光蛋白的开放阅读框:
[0017]将pGL_3basic中的虫焚光素酶阅读框(Lucif erase)替换为焚光蛋白Tomato的阅读框，Tomato荧光蛋白的荧光信号强度直接反应S0X2启动子的活性；
[0018]2、Sp-Tomato荧光报告载体导入乳腺癌细胞系(MCF-7，MDA-MB-231，T47D)
[0019]采用细胞电转的方法将Sp-Tomato荧光报告载体导入到不同的乳腺癌细胞系中；
[0020]3、荧光信号的检测(荧光显微镜，流式细胞仪)
[0021]电转24小时以后，可以在荧光显微镜下观察到不同细胞具有不同的信号强度，通过流式细胞仪分析可以得出细胞群体中的信号分布情况，阳性细胞的含量百分比等信息；
[0022]4、乳腺癌肿瘤干细胞的筛选
[0023]根据荧光信号的分析结果，对比阴性组，在流式细胞仪中设置Tomato荧光蛋白信号的筛选门，从S0X2高表达细胞株MCF-7中分选出S0X2启动子活性强的乳腺癌细胞；
[0024]5、筛选细胞的干细胞活性鉴定
[0025]经过体外成球实验鉴定，筛选出来的S0X2启动子活性高的乳腺癌细胞在具有更强的成球能力，具有干细胞特征。
[0026]通过本方法鉴定出来的乳腺癌细胞具有干细胞活性，鉴于目前尚无很好的筛选活肿瘤干细胞的方法，本方法是乳腺癌和其他肿瘤筛选肿瘤干细胞的好方法。另本方法采用流式细胞仪，通过荧光信号进行筛选，具有良好的精度，筛选后的细胞掺入阴性细胞的可能性小，如果掺入还可经过二次筛选等方法进行纯化，为筛选乳腺癌干细胞，进行下游的干细胞生物学特征研究提供了有力的工具。
【附图说明】
[0027]图1是本发明的S0X2启动子报告载体的构建流程；
[0028]图2是本发明的Sp-Tomato荧光报告载体导入乳腺癌细胞系后的荧光信号检测与筛选过程；
[0029]图3是本发明的Sp-Tomato荧光阳性细胞的克隆与二次分选后的干细胞活性鉴定过程。
【具体实施方式】
[0030]下面结合图1、图2和图3及实施例对本发明做进一步说明。
[0031]图1所示为S0X2在人类基因组中的结构，以及将S0X2启动子区域插入pGL3_Basicvector，得到S0X2启动子虫荧光素酶报告载体，并以该结构为基础，将虫荧光素酶阅读框Lucif erase替换为荧光蛋白Tomato，得到S的过程。0X2启动子荧光蛋白报告载体(SP-Tomato).
[0032]图2所示为将S0X2启动子荧光蛋白报告载体(SP-Tomato)转染至乳腺癌细胞系后，利用流式细胞仪进行荧光信号分析的情况;在荧光显微镜下观察S0X2启动子高活性的乳腺癌细胞系MCF-7中的荧光信号情况;分析后利用流式细胞仪筛选S0X2启动子阳性细胞的示意图。
[0033]图3中所示为将S0X2启动子高活性细胞筛选种板形成克隆后，进行S0X2启动子活性的二次筛选，并进行检测干细胞活性的成球能力实验，结果显示S0X2启动子活性高的细胞具有更强的成球能力，能够形成更大和更多的球体，提示具有强干细胞活性。
[0034]应用SP-Tomato从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选具有干细胞活性的乳腺癌细胞:
[0035]1、Sp-Tomat