专利名称：抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及制备抗体的方法和用该方法制备的抗体。
背景技术：
抗体是一类应用于许多不同领域的治疗性分子，应用领域包括移 植、心血管疾病、感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病。杂交瘤技术
的发展可将单克隆抗体(亦称为MAb)分离，用作候选的治疗性分子。 现在，单克隆抗体构成了快速增长的一类治疗方法，部分原因是由于 其可预见的药物代谢动力学特性，其在临床上成功率高，以及其拮抗 大蛋白质-蛋白质之间相互作用的能力。
趋化因子(chemoattractant)受体是一类促进细胞迁移的G蛋白偶 联受体(Gerard & Gerard (1994a和b) ; Murphy (1994))。这些受体 引起众多制药公司的兴趣，是因为它们通常能够被有机小分子抑制， 阻断这些受体或其配体能改善各种炎症状态，至少在动物模型中是这 样(Mackay (2001) ; von Andrian & Mackay (2000);以及Luster等人 (2005))。在许多炎症条件下发挥关键作用的一个受体是C5a受体 (C5aR) (Gerard & Gerard (1994b) ; Guo & Ward (2005) ; Riedemann 等人(2003) ; Ji等人(2002))。对于C5aR拮抗剂的开发付出相当大 的努力，包括有机小分子和肽类拮抗剂(Sumichika (2004) ;Allegretti 等人(2005))。尽管如此，开发C5aR和其他趋化因子受体的适合的小 分子拮抗剂尚存疑问。
最近，已证明单克隆抗体(mAb)可用作有用试剂以拮抗趋化因 子受体，以及鉴定趋化因子(chemokine) /配体结合或HIV-1结合的 重要区域(Heath等人(1997))。然而，过去己经证明很难产生趋化因 子受体的高亲和力的拮抗性单克隆抗体。因此，有必要改进抗多肽如G 蛋白偶联受体和趋化因子受体的高亲和力抗体的制备方法。发明概要
本发明人现在已经发现，通过将源自转基因小鼠的细胞为野生型 小鼠进行免疫接种，表达人类多肽的转基因小鼠能用于开发抗人多肽 的高亲和力拮抗性单克隆抗体。
因此，本发明提供了制备针对第一物种多肽的方法，该方法包括
用第二物种哺乳动物的转基因细胞为第二物种哺乳动物进行免疫 接种，其中第一物种多肽通过源自转基因哺乳动物的细胞表达。
在优选具体实施方式
中，第一物种多肽在源自转基因哺乳动物的 细胞表面表达。
在更优选具体实施方式
中，该方法包括从免疫的哺乳动物的细胞， 优选脾细胞中制备杂交瘤细胞的额外的步骤。优选地，该方法进一步 包括筛选杂交瘤细胞以得到与第一物种多肽结合的抗体。
在本发明的优选具体实施方式
中，抗体是单克隆抗体。本发明还 包括源自本发明制备的抗体的重组或人源化抗体。
在本发明的优选具体实施方式
中，第一物种是驯化动物、家畜或 人。更优选地，第一物种是人。
在进一步优选的具体实施方式
中，第二物种选自牛、猪、山羊、 绵羊、骆驼、马、猫、狗、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、仓鼠和小鼠。 啮齿动物，如大鼠、小鼠和仓鼠是优选的的第二物种哺乳动物。更优 选地，第二物种是小鼠。
应该意识到，第一物种多肽可以是任何治疗或诊断的靶标。例如， 多肽可以是G蛋白偶联受体。在优选具体实施方式
中，G蛋白偶联受 体是趋化因子受体。趋化因子受体优选是C5aR。
在另一具体实施方式
中，已经将编码多肽的核酸分子进行遗传修 饰以使转基因哺乳动物细胞的多肽表达增强。
在进一步优选的具体实施方式
中，源自转基因哺乳动物的细胞是 那些高水平表达第一物种多肽的细胞。因此优选的细胞类型取决于多 肽的性质。例如，如果多肽在肝脏中天然高表达，源自转基因哺乳动 物的细胞优选是肝细胞。另外，如果多肽影响免疫调节或炎症应答， 则细胞类型优选是免疫系统的细胞，如抗原呈递细胞。合适的抗原呈 递细胞的例子包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、
5嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、肥大细胞、T细胞和B 细胞。
在另一个进一步优选的具体实施方式
中，源自转基因哺乳动物的 细胞是那些已进行遗传修饰以高水平表达第 一物种多肽的细胞。 本发明还提供了通过本发明的方法制备的抗体。
在整个说明书中，"包含(comprise)"，或其变体形式如"包含 (comprises)"或"包含(comprising)"，应被理解为含有指明的要素、 整体或步骤，或成组的要素、整体或步骤，但不排除任何其他要素、 整体或步骤，或成组的要素、整体或步骤。
图l.以L1.2/hC5aR免疫小鼠而产生的抗人C5aR单克隆抗体在不 同程度上抑制125I-C5a与人中性粒细胞的结合。误差条表示SD。
图2.野生型小鼠的C5aR的基因座位图和用于构建hC5aR基因敲 入小鼠的靶载体。在靶载体上小鼠C5aR基因外显子3 CDS用人C5aR 基因外显子3 CDS精确置换。小鼠C5aR基因两翼序列允许同源重组。 将选择标记PGKneo (两翼有loxP位点)用Cre从首次基因敲入小鼠 中去除。用3，和5'探针证实靶载体已正确重组进入小鼠C5aR基因座 位。X,XbaI酶；V,EcoRV酶。
图3.杂合hC5aR基因敲入小鼠(/7C5i /+A)之间杂交小鼠鼠尾基 因组DNA的Southern杂交印迹图(以EcoRV消化)。用能够分辨小鼠 C5aR等位基因(10.0kb)和hC5aR敲入等位基因(8.1 kb)的3'探针 来探测杂交印迹图。
图4. /2C5i ,+、/;C5i ,-和野生型小鼠中性粒细胞上C5aR的表达。 中性粒细胞用FITC偶联的抗人C5aR单克隆抗体(7F3)或抗小鼠C5aR 单克隆抗体20/70染色处理。
图5.由/705"7 +/+小鼠中性粒细胞产生的抗体显示出广谱的1251 -C5a结合抑制作用，从完全抑制到部分抑制或几乎无抑制作用不等， 这取决于单克隆抗体克隆。结果是每种抗体至少两个独立性实验的代 表；误差条表示s.e.m.。
图6.抗C5aR单克隆抗体具有亚纳摩尔IC5o值。用/7C5i 7"小鼠中性粒细胞(3C5、 7H3和8G7)产生的抗体显示比用L1.2/hC5aR转 染子(7F3)产生的最好的单克隆抗体的ICso低5-10倍。ICso值用3或 4个独立的竞争性125I-C5a配体结合实验确定。
图7.人白细胞C5aR的表达。直方图分析证明的C5aR的表达(深 灰色)与对照染色(浅灰色)的对比。用单克隆抗体7F3 (深灰色)， 同种对照(浅灰色)和FITC偶联的山羊抗小鼠IgG进行间接免疫荧光 染色。
图8.抗hC5aR单克隆抗体的治疗效果比较。于炎症形成5天后为 /2C5i ,+小鼠一次性腹腔内注射7F3、 3C5或8G7 (溶于PBS中，注射 剂量1 mg/kg或3 mg/kg)。对照组注射PBS。图形显示从0天起爪(踝) 大小的变化。组间平均值(每组n-5 7)。
图9.抗hC5aR单克隆抗体的治疗效果比较。于炎症形成5天后为 /2C5i^+A小鼠一次性腹腔内注射7F3、 3C5或8G7 (溶于PBS中，注射 剂量lmg/kg或3mg/kg)。对照组注射PBS。图形显示临床评分。组 间平均值(每组!1=5 7)。
发明内容
一般技术
除非另有明确规定，应认为此处所用的所有技术和科学术语具有 的含义与本领域普通技术人员(例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、 免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)所普遍理解的含义相同。
除非另外指明，本发明中所用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学 技术是本领域技术人员所熟知的标准流程。这些技术在诸如J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) , J. Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press ( 1989) ， T.A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press
(1991 )， D.M. Glover和B.D. Hames(editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995禾fl 1996),和F.M. Ausubel等人
(editors ) , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Intersdence ( 1988, including all updates until
7present) , Ed Harlow禾口 David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),禾口 J.E. Coligan等人 (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including
all updates until present)的许多文献来源中都有描述和解释，这里引入
作为参考。
产生抗体的方法
技术领域：
本发明人现在己经发现，通过用基因敲入小鼠来源的细胞免疫接 种野生型小鼠，表达人多肽的基因敲入小鼠能用于开发抗人多肽的高 亲合力拮抗性单克隆抗体。
因此，本发明提供了制备抗第一物种多肽的抗体的方法，该方法
包括
用第二物种哺乳动物的转基因细胞为第二物种哺乳动物进行免疫 接种，其中第一物种多肽通过源自转基因哺乳动物的细胞表达。
在优选具体实施方式
中，第一物种多肽在源自转基因哺乳动物的 细胞表面表达。
应理解本发明的方法能够用于产生抗一系列不同多肽的抗体。优 选地，多肽是治疗或诊断目的的多肽。例如，多肽可以是G-蛋白偶联
受体。在优选具体实施方式
中，G-蛋白偶联受体是趋化因子受体。优 选趋化因子受体是C5aR。
多肽源自可以是任意感兴趣物种的第一物种。优选地，第一物种 是选作治疗性或预防性治疗的物种。例如，第一物种可以是驯养的动 物、家畜或人。在优选的具体实施方式
中，第一物种是人。
优选地，转基因哺乳动物是非人的哺乳动物，如牛、猪、山羊、 绵羊、骆鸵、马、猫、犬、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、仓鼠和小鼠。 啮齿类如大鼠、仓鼠和小鼠是优选的转基因哺乳动物。
源自转基因哺乳动物的任意细胞能够用于免疫接种。然而，从转 基因哺乳动物获得的细胞在其表面以相对高的密度表达该多肽是优选 的。优选是每个细胞大于100,000或200,000多肽分子的表达水平。
应该理解，因此优选的细胞类型取决于多肽的性质。例如，如果 多肽在肝脏是天然高表达的，优选的转基因哺乳动物来源的细胞可以 是肝脏细胞。另外，如果多肽影响免疫调节和炎症应答，优选的细胞类型可以是免疫系统细胞，如抗原呈递细胞。合适的抗原呈递细胞的 例子包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞。
接受免疫接种的哺乳动物与(用来获取用于免疫接种的细胞的) 转基因哺乳动物是同一物种。免疫接种哺乳动物能是任何适合产生抗 体的哺乳动物。而且，啮齿动物，如大鼠，小鼠和仓鼠是免疫接种的 优选的哺乳动物。
免疫接种技术为本领域技术人员所熟知。在一个具体实施方式
中， 例如，哺乳动物以源自取自转基因哺乳动物的细胞每两周间隔进行多 次免疫接种。
在优选具体实施方式
中，这种方法还包括末次免疫接种之后从免 疫接种过的哺乳动物获得的脾细胞制备杂交瘤细胞。优选地，该方法 还包括筛选杂交瘤细胞以得到与第一物种多肽结合的抗体。
然后通过这个方法制备的抗体能用于制备重组抗体或人源化抗 体，下文将详细描述。例如，可将通过本发明的方法制备的抗体的重 链和/或轻链的CDR区移植到源自不同的人抗体的骨架区之上以制备 与通过本发明的方法制备的抗体具有相似结合特性的人源化抗体。本 发明还包括以这种方式制备的人源化抗体或重组抗体。 第一物种多肽
本发明涉及产生抗第一物种多肽的抗体的方法。在优选具体实施 方式中，产生的抗多肽的抗体适于用作治疗或诊断剂以治疗或诊断第 一物种的个体。
技术人员应理解，本发明的方法能用于制备抗多种生物活性多肽 的抗体。合适的多肽的例子包括那些已经成为制备治疗性或诊断性抗 体的靶标的多肽。
在一个优选具体实施方式
中，多肽影响免疫调节或诱导针对损伤、
移植排斥反应或感染的急性期炎症反应。例如，多肽可以是G蛋白偶 联受体。在优选具体实施方式
中，是G蛋白偶联受体是趋化因子受体。 优选地，趋化因子受体是C5aR。另夕卜，多肽可以是C5a、 CD18、 CD147、 CD40L、 CD25、 CD3、 TNF-a、 CD4和IgGl或CD64 (FcR)。
本发明所用的更多多肽的非限制的例子包括IL-8、 gpl20、 VLA-4、DClla、 VEGF、 ICAM-1、 CD2、 EGFR、 E-选择素、VIII因子、卩2-整合素和EpCAM。
"第一物种多肽"是指具有与源自第一物种个体的天然序列的全部 或部分序列同源或优选相同序列的多肽。具有与天然序列的全部或部 分序列同源的序列的多肽是指，与全长的天然序列的多肽、缺乏信号 肽的天然序列的多肽、多肽的细胞外结构域或全长的天然序列多肽的 任何其他片段的多肽具有优选至少约80%序列同一性，更优选至少约 95%氨基酸序列同一性，更优选至少约96%的氨基酸序列同一性，更 优选至少约97%的氨基酸序列同一性，更优选至少约98%的氨基酸序 列同一性，最优选至少约99%的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。
在本发明上下文中，第一物种多肽由转基因哺乳动物表达。转基 因哺乳动物可通过将第一物种基因的天然编码区引入到转基因哺乳动 物的基因组中而制备。但是，没有必要将完整的天然编码区引入到转 基因哺乳动物的基因组中。相反，有可能以第一物种多肽的相应结构 域置换转基因哺乳动物多肽(或其实质部分)的至少一个结构域的编 码区。例如，如果第一物种多肽是人C5aR，转基因哺乳动物可通过以 相应的人C5aR细胞外结构域置换内源性C5aR的至少一个细胞外结构 域来制备。转基因哺乳动物表达的人类C5aR可能因此仅包括人C5aR 的一个细胞外结构域。在另一个实施例中，转基因哺乳动物表达的人 类C5aR可能包括内源性C5aR的细胞内结构域和人C5aR的细胞外结 构域。
可对编码多肽的核酸分子进行修饰，以增强多肽的表达或提高其 稳定性。例如，可使用以下一个或多个策略优化核酸特性以提高表达 产量1)置换不完善的Kozak序列，2)降低5'GC含量和减少RNA 的二级结构，3)优化密码子使用，4)使用替代的引导序列，5)包括 嵌合内含子，或6)在message的C-末端加上优化的poly-A尾。也可
使用以下一个或多个策略优化多肽性能以提高表达产量1)优化信号 序列，2)优化蛋白水解处理位点，3)置换一个或多个半胱氨酸残基， 以最大限度地减少不适当的二硫键的形成，4)提高蛋白质折叠的比率 或效率，或5)增加蛋白质的稳定性，尤其是蛋白质水解的稳定性。 此外，可对启动子序列进行修饰以提高多肽的表达水平。在一个具体实施方式
中，天然启动子序列被启动子序列置换，该启动子序列 在用于免疫接种第二物种哺乳动物的转基因动物的细胞中表达该多 肽。
也可对多肽进行修饰以将表达的多肽靶向递送至转基因细胞的表 面。几乎所有的细胞表面和分泌蛋白以其前体形式表达，该前体含有 氨基端延伸区，称为信号肽，长5至30个氨基酸残基不等。认为启动 分泌过程所需的信息存在于短信号肽延伸区内。信号肽在蛋白质跨膜 转运后从该蛋白上被剪切掉。此外，蛋白质内的其他疏水区域，称为 跨膜(TM)结构域，将细胞表面蛋白锚定到细胞膜上。
许多信号肽的氨基酸序列是已知的。虽然信号肽之间很少有直接 同源的氨基酸序列，信号肽的总体结构高度保守。负责真核细胞信号 肽诱导的分泌途径的细胞内因素已明确界定并促进蛋白质跨越内质网
(ER)膜的转运。
与此相反，某些蛋白质有不被剪切的信号序列，"信号锚定序列"，
该序列是跨膜区段。信号锚定i型蛋白的c-末端位于细胞质中，这一
点类似于I型膜蛋白，而信号锚定II型蛋白的N-端位于细胞质中。
因此，可通过制备融合蛋白(其含有目的多肽和天然分布于细胞 表面的另一种蛋白质的跨膜结构域)而使转基因细胞表达的多肽分布 于细胞表面。另外，可对通常负责多肽分泌的信号肽进行修饰，以使 其不再包含蛋白质水解位点。对信号序列的修饰将导致多肽在细胞表
面表达而不是被分泌。 转基因动物
制备"敲入"的转基因动物的技术为本领域所熟知。关于该技术的
可用的一般孝l禾斗书是Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)—可用于制备鱼类、小鼠和牛的转基 因动物技术的内容广泛的综述。本发明的上下文的特别目的是转基因 的非人哺乳动物如牛、猪、山羊、马等，特别是啮齿动物如大鼠、小 鼠、仓鼠等。转基因动物优选是小鼠。
胚胎显微操作技术的进步现在允许将外源DNA引入到细胞中，例 如，引入哺乳动物受精卵中。例如，全能和多能性干细胞可通过显微 注射、磷酸钙共沉淀，脂质体融合、逆转录病毒感染或其他手段而转
li化，然后将转化了的细胞引入胚胎中，胚胎然后发展成转基因动物。 在优选方法中，发育中的胚胎通过电穿孔法转染目的DNA，而后从感 染的胚胎制备转基因动物。在另一个优选方法中，然而，优选在单细
胞阶段时将适量的DNA片段注射到胚胎原核或细胞质中，胚胎可以发 育成成熟的转基因动物。这些技术是熟知的。参见将外源DNA片段显 微注射到哺乳动物受精卵中的标准实验室程序的综述，包括Hogan等 人,Manipulating the Mouse Embryo, Krimpenfort等人,Bio/Technology 9:844(1991); Palmiter等人，Cell, 41: 343 (1985); Kraemer等人，Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985) ; Hammer等人,Nature, 315: 680 (1985) ; U.S. Pat. No. 5,175,385; U.S. Pat. No. 5,175,384。这些内容在此引入作为参考。
另一种制备转基因动物的方法包括根据标准方法将核酸显微注射 到前核阶段的卵中。然后将经注射的卵培育直到将其转移入假孕受体 的输卵管中。
也可通过核转移技术制备转基因动物，如Schnieke等人，1997, Science, 278: 2130和Cibelli等人，998, Science, 280: 1256所描述。用 这种方法，可将含有编码感兴趣的结合结构域或结合半体序列的质粒 在调控条件下稳定转染入来自供体动物的成纤维细胞中。然后就将稳 定的转染子融合至去核的卵母细胞，培育并转移至雌性受体。
通常通过下列标准方法进行PCR或Southern杂交对可含有转基因 序列的动物进行分析。
作为转基因哺乳动物构建的特定实施例子，如牛，可使用例如美 国专利号No. 4,873,191中记述的技术将包含编码与GFP融合的结合结 构域序列的核苷酸构建体显微注射到从哺乳细胞体内新鲜摘取的卵巢 的卵母细胞内。卵母细胞从滤泡上吸取下来，并使其在与解冻的冰冻 精子受精之前安置下来，所述精子以肝素受精并通过Percoll梯度预分 离以得到游动组分。
将受精的卵母细胞离心，例如，以15,000 g离心8分钟以看到用 于注射的原核，然后在输卵管组织条件培养液中将其从受精卵培养至 桑椹胚或胚泡期。这个培养液使用从输卵管上刮下的腔内组织用培养 液稀释而制成。必须将受精卵在显微注射后两个小时内放入培养液中。然后通过使用粪醇使目的受体哺乳动物如牛同步发情。两天之内 发生发情，在发情后5-7天将胚胎转移到受体动物体内。可通过其后代
的Southern杂交来评价转移的成功与否。
另外，还可将目的构建体导入胚胎干细胞(ES细胞)并培养细胞 以确保转基因的修饰。然后将修饰细胞注入到囊胚期的细胞中并将该 囊胚置入假孕的宿主内。所得后代是ES和宿主细胞的嵌合体，并且通 过传统的杂交育种能得到完全只包含ES后代的非嵌合株。该技术记述 在，如WO91/10741中。
转基因动物包含外源核酸序列，其以染色体外因子或稳定整合在 全部或部分细胞内(尤其是生殖细胞)内的形式存在。优选地，转基 因动物包含种系序列的稳定变化。通常将DNA导入细胞基因组中来获 得稳定转化。用于稳定整合的载体包括质粒、逆转录病毒和其它动物 病毒，YAC等。在动物构建的起始，产生的是"嵌合体"或"嵌合动物"， 这个阶段中只有一部分细胞的基因组发生了改变。嵌合体主要用于育 种以产生目的转基因动物。具有杂合改变的动物由嵌合体育种而产生。 雄性或雌性杂合体可典型地繁殖产生纯合动物。因此，在优选的具体 实施方式中，转基因动物是敲入基因的纯合体。
在更优选的具体实施方式
中，本发明的转基因的非人动物通过将 人的转基因导入非人动物的种系中而产生。胚胎干细胞(ES)是用于 将人的转基因导入非人动物以获得纯合重组体的主要类型的靶细胞。 ES细胞可从体外培养的预植入的胚胎获得和胚胎融合而获得(Evans 等人(1981) Nature 292, 154-156; Bradley等人(1984) Nature 309, 255-258; Gossler等人(1986) Pro" Natl. Acad. Sci U.S.A. 83， 9065-9069; 和Robertson等人(1986) Nature 322, 445-448)。通过DNA转染或逆 转录病毒介导的转导可将转基因有效地导入ES细胞内。因此这种转化 的ES细胞能可与来自非人动物的胚泡融合。因此ES细胞移植入胚胎 中并对所得嵌合动物的种系发生作用。见综述Jaenisch (1988) Science 240, 1468-1474。转染的胚胎细胞可在体外培养不同时间或再植入代理 宿主动物体内，或两者皆可。
可通过任何合适的方法筛选代理动物的转基因后代以确定转基因 的存在和/或表达。通常可使用与转基因的至少一部分互补的探针通过Southern杂交或Northern杂交进行。可使用抗转基因编码的蛋白质的 抗体的Western杂交分析用做筛选转基因产物的替代性或附加的方法。 通常，在转基因小鼠中，DNA从鼠尾组织提取并用Southern杂交或PCR 分析转基因。此外，可使用Southern杂交或PCR来测定认为是以最高 水平表达转基因的组织或细胞中转基因的存在和表达，尽管任何组织 或细胞类型可用于进行此类分析。转基因动物的子代可通过使转基因 动物与合适的伴侣交配而获得，或通过从转基因动物获得的卵和/或精 子体外受精而获得。
Hanks等人记述了通过内源基因和转基因构建体之间的同源重组 制备转基因小鼠的方法(Science 269: 679-682， 1995)，本文特别引入作 为参考。应该认识到，这可通过例如将编码人多肽的多核苷酸构建体 通过定向整合入哺乳动物的基因组而导入哺乳动物的基因组中。
尽管对于本发明的操作而言无必要，本文记述的转基因动物可包 括上述基因变体以外内源基因的变体。相应地，宿主动物既可以是编 码目的多肽基因的"敲除"动物也可以是上述基因的"敲入"动物。 敲除使目的内源基因的单或双等位基因功能全部或部分丧失。例如， 如果目的多肽是C5aR，那么宿主动物的内源C5aR可被"敲除"，并且 源自不同物种的C5aR"敲入"。在该例中，编码人C5aR全长或片段的 多核酸构建体可被整合入内源C5aR序列中，这样整合之后，内源C5aR 位点包含编码人C5aR的多核苷酸。
关于"敲除"，优选地，靶基因表达是无法检测或无关紧要的。例 如，C5aR基因的敲除意味着内源C5aR基因的功能实质性下降以致于 检测不到表达或仅存在无关紧要的水平的表达。这可通过各种机制达 到，包括导入打乱的编码序列，例如一个或多个终止密码子的插入， DNA片段等的插入，编码序列的删除，编码序列终止密码子的取代等。 也可通过导入阻断原生基因表达的反义构建体达到功能性的"敲除" (例如见Li和Cohen (1996) Cell 85:319-329)。"敲除"还包括条件性 敲除，例如在动物接触促进靶基因改变的物质后耙基因发生改变，在 靶基因位点导入促进重组的酶(如Cre-lox系统的Cre位点)或其它指 导靶基因出生后改变的方法。 抗体本发明包含上述方法制备的抗体。示例性抗体包括多克隆、单克 隆、人源化、双特异的和异源结合抗体。
本发明所用的术语"抗体"包括完整分子及其能够与抗原决定簇结
合的片段，如Fab、 F (ab') 2和Fv。这些抗体片段保持能够与其抗原
或受体选择性结合的能力，并如以下定义
(1) Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过木 瓜蛋白酶消化整个抗体而产生完整轻链和一条重链的部分而制备。
(2) Fab'，可通过胃蛋白酶处理整个抗体，接着进行还原以产生 完整轻链和重链的一部分而获得的抗体分子片段；每个抗体分子可产 生两条Fab'片段；
(3) (Fab') 2，可通过以胃蛋白酶处理整个抗体，不进行后续还 原而获得的抗体分子片段；F (ab) 2是两条Fab'片段通过两个二硫键 结合的二聚体；
(4) Fv，定义为包含以两条链表达的遗传工程化片段，其包括轻 链可变区和重链可变区；
(5) 单链抗体("SCA")，定义为遗传融合单链分子，其包含轻链 可变区和重链可变区并以合适的多肽连接子连接；和
(6) 单域抗体，通常是缺乏轻链的重链可变结构域。 叙麟,
根据本发明的方法制备的抗体可以是多克隆抗体。制备多克隆抗 体的方法对于本领域技术人员是已知的。多克隆抗体能在哺乳动物体 内产生，例如，通过一次或多次注射表达源自转基因哺乳动物的、表 达第一物种多肽的细胞和佐剂(如果需要)。通常，通过多次皮下或腹 腔内注射将细胞和/或佐剂注射到哺乳动物体内。用到的佐剂的例子包 括Freimd's完全佐剂或MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻 糖二霉菌酸脂(trehalose dicorynomycolate))。免疫接种程序可由本领 域技术人员无需过度实验即可选择。
根据本发明的方法制备的抗体也可以是单克隆抗体。单克隆抗体 可通过杂交瘤方法制备，如Kohler和Milstein, Nature, 256:495 (1975 ) 所述。在杂交瘤方法中，通常，将小鼠、仓鼠或其它适合的宿主动物用源自转基因哺乳动物的、表达第一物种多肽的细胞进行免疫以引发 产生淋巴细胞，该淋巴细胞能够产生与第一物种多肽特异性结合的抗 体。
一般来讲，如果期望得到人源化细胞，就用外周血淋巴细胞(PBL)， 或者如果期望得到非人哺乳动物细胞源就用脾细胞或淋巴结细胞。然 后用适当的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生细胞系融合形成杂交
瘤细胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103)。永生细胞系通常是转化的哺乳动 物细胞，特别是啮齿目动物、牛和人源化的骨髓瘤细胞。通常使用大 鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可将杂交瘤细胞在合适的优选包含一种或 多种抑制未融合的永生细胞生长或存活的物质的培养液中培养。例如， 如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或 HPRT)，那么杂交瘤细胞的培养液中通常将包括抑制HGPRT-缺失细胞 生长的次黄嘌呤、氨喋呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷
(thymidine ) (HAT培养液)。
优选的永生细胞系是那些有效融合的、支持通过选择的抗体产生 细胞而稳定高水平表达抗体，并对培养液例如HAT培养液敏感的细胞 系。更优选的永生细胞系是小鼠的骨髓瘤细胞系，该细胞系能从例如 从Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.和美国丰示7隹培 养物中心Manassas, Va.获得。也描述了用于制备人单克隆抗体的人骨 髓瘤和鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987 ) pp. 51 -63 )。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养液以确定直接抗第一物种多 肽的单克隆抗体的存在与否。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体 的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，例如放射免疫分析
(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。这些技术和方法为本领 域技术人员所知。单克隆抗体的结合能力可通过例如Scatdiard分析
(Mu謂n禾口 Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))来测定。
鉴定出所需要的杂交瘤细胞之后，可将该克隆通过有限稀释法亚 克隆，并通过标准方法培养。为了这个目的的合适的培养液包括，例
16如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium和RPMI-1640培养液。或者，
杂交瘤细胞可在哺乳动物体内作为腹水进行培养。
亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养液或腹水中通过常规免疫球蛋 白纯化流程分离或纯化，例如通过蛋白质-A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石 层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析分离或纯化。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备，如美国专利 No.4,816,567所述。本发明的编码单克隆抗体的DNA可用常规方法轻 易地分离和测序(如，通过使用可与编码小鼠抗体的重链和轻链的基 因特异性结合的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞作为这种DNA 的优选来源。 一经分离，可将DNA置于表达载体内，随后将该载体转 染进入宿主细胞内，如猴COS细胞、中国仓鼠细胞卵巢细胞(CHO) 或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞以使单克隆抗体在重组的宿主 细胞内合成。也可将DNA修饰，例如，通过以同源的小鼠序列取代人 重链和轻链恒定区的编码序列(美国专利No.4,816,567)或通过共价结 合到免疫球蛋白编码序列，非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列 上。这种非免疫球蛋白多肽能被本发明抗体的恒定区取代，或能被本 发明抗体的抗原结合位点的可变区取代以产生嵌合的二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法被本领域人员所熟知。 例如， 一种方法包含免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。重链 通常可在Fc区任何位点截短以阻止重链的交联。可选地，以另一个氨 基酸残基取代相关的半胱氨酸残基，或将半胱氨酸残基删除以防止交 联。
体外方法也适合制备单价抗体。抗体经消化产生抗体片段，特别 是Fab片段，能用本领域技术人员所知的常规技术做到。 义拔沐*义象众贫,
本发明的抗体可以是人源化抗体或人抗体。非人(如小鼠)抗体 的人源化形式是包含最小的源自非人免疫球蛋白的嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白链或其片段(如Fv, Fab, Fab', F (ab') 2或抗体的其它抗原 结合序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，在人免疫球 蛋白上，受体的互补决定区(CDR)残基被非人物种(供体抗体)的 CDR残基取代，这些非人物种(如小鼠、大鼠或家兔)的CDR残基具
17有期望的特异性、亲和力和结合容量。 一些例子中，人免疫球蛋白的 Fv骨架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体也可包含既未在受体 抗体也未在导入CDR或骨架序列中发现的残基。 一般而言，人源化抗 体实质上包含全部的至少一个， 一般两个可变区，在该可变区中，全
部或实质上全部的CDR区对应于那些非人免疫球蛋白的CDR区并且 全部或实质上全部的FR区是那些人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体 最佳也可包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)， 一般是人免疫球蛋白 的免疫球蛋白恒定区(Jones等人，Nature, 321:522-525 ( 1986); Riechmann等人，Nature, 332:323-329 (1988);禾卩Presta, Curr. Op. Struct Biol.， 2:593-596 (1992))。
人源化非人抗体的方法为本领域技术人员所熟知。 一般来讲，人 源化抗体有一个或多个从非人来源导入其中的氨基酸残基。这些非人 的氨基酸残基经常被称作"导入"残基，这些导入残基一般取自"导入" 可变区。人源化过程实质上可根据下列Winter及其合作者的方法进行
(Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature, 332:323-327 (1988) ; Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988))， 通过将啮齿目动物CDR或CDR序列用相应的人抗体序列取代。因此， 这种"人源化的"抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4,816,567)，其中实质 上少于完整的人可变区被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化 的抗体一般是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来 自啮齿目动物抗体的同源位点的残基取代。
人抗体也可用本领域已知技术制备，包括噬菌体展示文库
(Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol" 227:381 (1991 ) ; Marks等人，J. Mol.Biol., 222:581 (1991))。 Cole等人和Boemer等人的技术也可用于 制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boemer等人,J. Immunol" 147
(1) :86-95 (1991)。同样地，可通过将人免疫球蛋白基因座位导入转 基因动物(例如小鼠)体内而制备，其中内源性免疫球蛋白基因全部 或部分失活。经免疫激发，能观察到人抗体的产生，与在人身上看到 的抗体的全部方面非常相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法 见于例如在美国专利No.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126;
185,633,425; 5,661,016和下列科学出版物中Marks等人，Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994) ; Fishwild等人，Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826( 1996); Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)。
抗体可用本领域所知的选择和/或突变方法使其亲和力成熟。优选 亲和力成熟的抗体其亲和力比源自制备成熟抗体的起始抗体(一般是 鼠、人源化或人抗体)高5倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍。 及錄雜縱
双特异性抗体是能与至少两种不同抗原特异性结合的单克隆，优 选为人或人源化抗体。例如，其中之一是与C5aR特异性结合，另一个 特异性结合的抗原可以是任何其它抗原，并优选细胞表面蛋白质或受 体或受体亚单位。
双特异性抗体的方法为本领域所知。按照惯例，双特异性抗体的 重组产物基于两对免疫球蛋白的重链/轻链共表达，其中两条重链特异 性不同(Milstein和Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫球 蛋白重链和轻链分类的随意性，杂交瘤(quadromas)产生10种不同 抗体分子生物潜在混合物，其中仅有一个分子具有正确的双特异性结 构。通常通过亲和层析步骤使正确分子纯化。相似的流程见于公布于 1993年5月13日的专利申请WO 93/08829和Traunecker等人的论文 EMBO J" 10:3655-3659 (1991)。
具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区能与 免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选与包含至少部分绞链区、CH2 和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选在至少一个融合子上存 在第一重链恒定区(CHI)(其包含对于轻链的结合来说必要的位点)。 将编码免疫球蛋白重链融合子和，如期望，免疫球蛋白轻链的DNA插 入分别的表达载体中，并且将其共转染进入合适的宿主生物体内。制 备双特异性抗体的详细内容见，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
根据WO 96/27011所述的另一方法，将一对抗体分子之间的界面 设计成可使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定区的CH3区。在该方法中，第一抗 体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链用大的侧链(如酪氨酸或色氨 酸)被取代。通过用较小的氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代大 的氨基酸侧链而在第二抗体分子界面制造出与大的氨基酸侧链相同或 相似大小的互补的"洞"。这样就产生了可使异源二聚体与其它不必要 的终产物如同源二聚体相比产量增加的机制。
能将双特异性抗体制成全长抗体或抗体片段(如F (ab') 2双特异
性抗体)。文献已经记述了从抗体片段制备双特异性抗体的技术。例如，
能用化学连接法制备双特异性抗体。Brennan等人，Science 229:81 (1985)记述了完整抗体被蛋白水解作用剪切产生F (ab') 2片段的流 程。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠(其稳定临近二硫醇和预防分 子间二硫键形成)存在时被还原。产生的Fab'片段然后转化成为硫代 硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后Fab'-TNB衍生物之一通过巯乙胺 还原再转化为Fab'-硫醇并与另一种Fab'-TNB衍生物等摩尔数混合形 成双特异性抗体。产生的双特异性抗体能用作酶的选择性固定化试剂。 Fab'片段可直接从大肠杆菌中回收并化学配对形成双特异性抗体。 Shalaby等人，J.Exp.Med. 175:217-225 (1992)记述了完全人源化的双 特异性抗体F (ab') .sub.2分子的制备。每个Fab'片段分别从大肠杆菌 分泌并在体外直接进行化学偶合形成双特异性抗体。因此这样形成的 双特异性抗体能结合到过表达ErbB2受体的细胞上和正常人T细胞上， 并启动人细胞毒性淋巴细胞的抗人胸部肿瘤耙细胞的溶解活性。
各种直接从重组的细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的 技术也己记述。例如，用亮氨酸拉链制备双特异性抗体(Kostelny等人, J. Immunol. 148 (5) :1547-1553 (1992))。将来自Fos和Jim蛋白质的 亮氨酸拉链肽段通过基因融合连接到两个不同的抗体分子的Fab'部分。 抗体的同源二聚体在绞链区被还原以形成单体，随后再氧化形成异源 二聚体抗体。这个方法也可用于产生同源二聚体抗体。Hollinger等人 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993))记述的"微型双功能 抗体diabody)技术"(提供了制备双特异性抗体片段的另一种机制。 片段包含通过太短而不能使同一链上两个区之间配对的接头连接到轻 链可变区(Vl)上的重链可变区(VH)。因此， 一个片段的Vh和Vl区被迫与另一个片段上互补的Vl和Vh区配対，因此形成两个抗原结 合位点。通过使用单链Fv (sFv) 二聚体制备双特异性抗体片段的另一 个策略也已报道，见Gruber等人，J. Immunol. 152:5368 (1994)。
考虑了具有两种以上效价的抗体，例如能制备三特异性抗体，见 于Tutt等人，J. Immunol. 147:60 (1991 )。 ^,錄凝叛谬
异源结合抗体也在本发明的范围内。异源结合抗体由两个共价连 接的抗体组成。提议将这种抗体，例如用于将免疫系统细胞靶向不必 要的细胞(U.S. Pat. No. 4,676,980)，并用于HIV感染的治疗(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)。考虑到抗体可用人工蛋白质化学 的已知方法体外制备，包括那些包含交联试剂的方法。例如，可用二 硫化物互换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于此目的的合适 的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基butyrimidate (methyl-4-mercaptobutyrimidate)和那些例如在No. 4,676,980的美国 专利中公开的例子。 舰好劝虔游工微
可对本发明的抗体的有关效应分子功能进行有目的的修饰，以致 使例如抗体治疗癌症的有效性增强。例如，可将半胱氨酸残基导入Fc 区，因此使得在该区内得以形成链间二硫键。这样产生的同源二聚体 抗体可具有改善的细胞内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤作 用和抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)。见Caron等人，J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)禾卩Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)。抗 肿瘤活性增强的同源二聚体抗体也可用Wolff等人(Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))所述的异源双功能交联试剂制备。可选择地，可将 抗体设计成具有双Fc区并可因此具有增强的补体水解和ADCC能力， 见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)。
本发明还涉及包含偶联到细胞毒性试剂如化疗试剂、毒素(如细 菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素 (即放射偶联物)上的抗体的免疫偶联物。
上文已记述了用于制备这种免疫偶联剂化疗试剂。能用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段、外毒 素A链(来自假单胞菌属)、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲 根毒素A链、Ct-八叠球菌毒素、油桐属福地明蛋白、石竹素蛋白、美
洲商陆蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜甾抑制剂、泻果素、巴豆 毒素、石碱草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、 依诺霉素和tricothecene类。有多种可用于制备放射偶联抗体产物的放 射性核素。其例子包括.sup.212Bi、 .sup.1311、 .sup.l31In、 .sup.90Y 和.sup.l86Re。抗体和细胞毒性试剂的偶联物的制备可使用多种双功能 蛋白偶联试剂，如N-琥珀酰亚胺基-3- (2-吡啶基双硫醇)丙酸酯 (SPDP)、亚氨基硫醇盐(iminothiolane) (IT)、亚氨酸酯的双功能衍 生物(如二甲基己二酰亚胺酯HCL)、活性酯类(如双琥珀酰亚胺辛二 酸酯)、醛(如glutarddehyde)、 二叠氮基化合物(如二- (p-叠氮基苯 甲酰)己二酸酯)、二-重氮基衍生物(如二- (p-二重氮基苯甲酰)-氨 茶碱)、二异氰酸盐(如甲代亚苯基(tolyene) 2,6-二异氰酸盐)和生 物活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，能制备篦麻毒素 免疫毒素的方法见于Vitetta等人，Science, 238: 1098 (1987)。碳-14-标 记的l-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是将 放射性核酸偶联到抗体上的示例性的螯合剂。见于WO94/11026。
在另一个实施例中，可将抗体偶联到"受体"(如抗生物素蛋白链 菌素)用于肿瘤靶向前治疗，其中可将抗体-受体偶联物为个体给药， 然后通过使用清除试剂从循环中移除未结合的偶联物，然后将偶联到 细胞毒性试剂(如放射性核酸)上的"配体"(如抗生物素蛋白)给药。 贫鄉
在某些情况下，在诊断和治疗的有效性上， 一种抗体型的单克隆 抗体可比另一种抗体型的更优选。例如，在来自抗体介导的细胞溶解 作用的研究中，已知Y-2a和Y-3型的未修饰的小鼠单克隆抗体的溶解 靶细胞的作用一般比Y-l型更有效。有效性的差别被认为是由于？2a 和？3型能够更加活跃地参与到靶细胞的溶解性毁坏中。可通过使用 sib选择技术分离类别转换变体而从分泌不同抗体型的单克隆抗体的亲 代杂交瘤细胞中进行特殊抗体型单克隆抗体的二级制备(Steplewski, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:8653, 1985; Spira,等人，J. Immunol.Methods, 74:307, 1984)。
实施例
实验细节
乂 C5"i 基麟 嵐游虔條
采用基因敲除/敲入策略构建在小鼠C5aR基因启动子调控下表达人C5aR基因而不是小鼠C5aR基因的转基因小鼠。靶载体包含小鼠C5aR基因外显子3上游的小鼠C57BL/6基因组DNA的3.5 kb区、人C5aR基因外显子3编码序列、小鼠C5aR基因3，非翻译区、磷酸葡糖激酶启动子和侧翼是loxP位点的新霉素抗性基因以及pLOz载体(Ozgene, Perth, Australia )上小鼠C5aR基因下游的小鼠基因组DNA的3 kb区。用PCR扩增制备基因组DNA片段。将载体转染进入C57BL/6胚胎干细胞，并用Southern杂交筛选G418抗性克隆的DNA。使Xba I和EcoR V酶切消化的DNA与5'和3'探针杂交，分别鉴定5'和3'末端发生正确同源重组的克隆。将产生于注射了正确的耙ES克隆的胚泡的嵌合体与雌性C57BL/6小鼠交配。人C5aR基因的种系传递用小鼠鼠尾基因组DNA Southern杂交证实。产生具有人C5aR基因的小鼠纯合子(ZzC5i 广A)，并用PCR、 Southern杂交和FACS染色证实不存在mC5aR基因。W做潘蕭分,
用如前所述(Haslett等人，(1985))的修正方法从健康志愿者外周静脉血中分离人中性粒细胞。简言之，将用EDTA包被的真空采血管采集的血液样品于400 x g离心15分钟，然后将血浆和棕黄色上层去除。接着用1%右旋糖酐沉降30分钟，于300 x g离心5分钟将白细胞沉淀并用PBS洗涤。然后将在65% percoll液(密度为1.093 g/ml,Amersham Bioscience)的细胞于500 x g离心30分钟。离心后，中性粒细胞用PBS重新悬浮。从两条后腿股部将含有10%胎牛血清的5 mlDMEM (GIBCO)培养液用注射器注入骨中以分离小鼠中性粒细胞。中性粒细胞用Ficoll-Paque (Amersham Bioscience)密度离心分离。红细胞用低渗缓冲液(155 mMNH4Cl、 10 mM KHC03、 1 mM EDTA)裂解。细胞存活性用台盼蓝排除法测定，中性粒细胞沉淀用PBS重悬。賴蘑微游产4
用表达高水平hC5aR的L1.2转染子(Campbell等人(1996))( 2 x107)免疫接种C57BL/6小鼠，腹腔内注射每两周一次共5次，然后 静脉内注射一次。静脉内注射免疫接种后4天，摘除脾脏，并用标准 流程使细胞与SP2/0细胞系融合。用~1 x 107分离自/zC5i 广'+小鼠腿骨 的中性粒细胞以相似的方式免疫接种C57BL/6小鼠静脉内注射两次、 腹腔内注射一次，最后是静脉内注射免疫接种。杂交瘤细胞生长在含 有10% Fetalclone禾n HAT补充物(SIGMA)的DMEM (GIBCO)培 养液中，吸取培养上清液用于初歩筛选。选定抗体的制备按比例扩大， 并将单克隆抗体用蛋白A或G层析法纯化、浓缩、转换缓冲液和去除 内毒素。单克隆抗体浓度用小鼠IgGELSA试剂盒(Roche)测定。 魔式潘應,
使用间接免疫荧光染色和流式细胞术评价单克隆抗体抗转染细胞 或白细胞的反应性。将细胞用PBS洗涤一次，然后将其在100pl含有 2%人血清和0.1%叠氮钠(染色缓冲液)、纯化抗体或50 ^杂交瘤培养 上清液的PBS中重悬。于4°C放置20分钟后，将细胞用染色缓冲液洗 涤两次，并在50 )il用染色缓冲液稀释的1:200 FITC-偶联的亲和力纯化 的F(ab')2山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 重悬。于4°C温育20分钟后，细胞用染色缓冲液洗涤两次，并在 FACSCalibur (Becton-Dickinson)仪上分析以确定表面表达的水平。用 碘化丙啶染色排除死细胞。 微微
人中性粒细胞用结合缓冲液(50 mM HEPES、 pH7.5、 1 mM CaCl2、 5mMMgCl2、禾n0.5。/。BSA)洗涤，并重悬成1 x 107/ml。对于每种结 合反应(终体积是120(^1)而言，40|11细胞悬浮液(4xl()S个细胞) 与适量的抗hC5aR单克隆抗体，同型配对的对照单克隆抗体或未标记 的人C5a (SIGMA)于室温温育15分钟。将1251-标记的人C5a (Perkin Elmer)以终浓度0.4nM加入，并且将反应体系于室温温育60分钟。 然后将细胞收集起来并用含有150 mM NaCl的结合缓冲液洗涤3遍。 然后将细胞转移至含有MicroScint 20闪烁液的Opti板(Perkin Elmer) 内并在TopCount (Packard)上放射性计数。每个样品分析三次。
24微分桥
按照以前描述过的方法(Ponath等人(1996))将新鲜分离的人中 性粒细胞于37°C装载Fluo-3AM (Molecular Probes)。样品在 FACSCalibur流式细胞仪上运行，测定其因时间的线性荧光强度。 遭众丝分叛
将悬浮于趋化缓冲液(含有50。/c)M199 (SIGMA)和2%胎牛血清 (HyClone)的RPMI 1640培养液)的人或小鼠中性粒细胞(每孔1-2 xl()5个细胞)置于12-孔的transwell板(Coming Costar Co.)的上部的 孔内，并使其能够跨3 pm滤器向含人或小鼠C5a的下部孔迁移30分 钟。在FACSCalibur仪上计数60秒，计数迁移的细胞数。设置紧靠角 落的和边缘散在的细胞以排除细胞碎片或无关细胞。 游表纖谬機A ".2鄉
小鼠L1.2细胞生长于补充了 10%胎牛血清(HyClone)的RPMI 1640 (GIBCO)，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)根据生产商的 指示进行转染。歸類雜关
按照以前描述的方法(Korganow等人(1999))从K/BxN关节炎 小鼠收集血清。将150 ]il血清于当天或第二天通过腹腔内注射注入受 体小鼠体内而诱导受体小鼠发生实验性关节炎，按照以前描述的方法
(Lee等人(2002))监测疾病进程。每日测定踝关节增厚程度和临床 评分。汇总每只小鼠四只爪的评分计算临床评分0-正常，l-轻度发红， 2-红并有些肿胀，3-红并明显肿胀。于第-1天和1天(预防性治疗)或 第5天(疗愈性治疗)腹腔内注射抗hC5aR或同型对照单克隆抗体(l-10 mg/kg溶于PBS)。于第10天时，处死小鼠，将其爪收集进行组织学处 理。爪在固定液(10%磷酸盐缓冲的甲醛溶液)中固定48小时，并用 含10%甲酸的固定液处理5天以脱钙。然后将样品用PBS洗涤并用石 蜡包埋。切成5]um厚切片并用H&E染色。 鋭俯
KxB/N模型的独立对照组和处理组之间差异的统计学显著性用 Kruskal-Wallis检验，随后用Dunn's多重比较检验的post hoc分析来确定。实施例1:用转染的L1.2细胞产生抗C5aR的单克隆抗体(比较性实 施例)
首先通过已知的趋化因子受体(Heath等人(1997) ;Qin等人 (1998) ;Wu等人(1997) ; Qin,等人(1996))产生抗hC5aR的单克 隆抗体。为小鼠免疫接种非常高水平表达hC5aR(每个细胞表达 80，000 个受体分子)的L1.2细胞(小鼠B细胞淋巴瘤细胞系)。进行5次融 合，鉴定出超过40种与hC5aR转染子发生特异性反应而不与表达其它 紧密相关的趋化因子受体，如CXCR1、 CXCR2或另一种C5a结合受 体C5L2 (Gerard等人(2005))的转染子发生特异性反应的不同单克 隆抗体。许多这种单克隆抗体抑制1251-标记的人C5a与hC5aR转染子 的结合。最早鉴定的单克隆抗体，7F3，显示出对C5a结合有力的抑制 作用(图l)，在趋化性分析中抑制人中性粒细胞向C5a的趋化作用并 阻断人中性粒细胞中C5a诱导的钙流动(数据未显示)。 实施例2:使用来自hC5aR基因敲入小鼠的中性粒细胞产生抗C5aR 的单克隆抗体
在制备有力的抗C5aR的单克隆抗体的第二个方法中，通过在小鼠 C5aR基因(C5i 7)上定向同源重组制备人C5aR基因敲入小鼠。通过 用靶向构建体(图2)转染小鼠胚胎干细胞(ES)来删除内源C5aR编 码序列并用hC5aR编码序列置换小鼠内源C5aR编码序列。从672个 中筛选出的两个ES克隆被鉴定出含有正确的定向的hC5aR序列。达 到hC5aR转基因的种系传送，并从这些ES细胞产生5只嵌合体小鼠， 因此建立了 hC5aR基因敲入种系。将侧翼带有loxP位点的PGK-neo 基因用BL/6 Cre deleter株从敲入基因座位中删除。通过Southern杂交 鉴定具有人C5aR转基因的小鼠纯合子(/2C5i^+/+)(图3)。根据用抗 hC5aR的单克隆抗体FACS染色法判断，这些小鼠的中性粒细胞显示 表达非常高水平的hC5aR (图4)。来自野生型小鼠的中性粒细胞没有 用抗人C5aR单克隆抗体7F3染色，但是用抗小鼠C5aR单克隆抗体 20/70 (Soruri等人(2003))进行深度染色(图4)。人和小鼠C5aR仅 有65%的同源性，但是对于hC5aR基因敲入小鼠的发育重要的是，小 鼠和人C5a以相似的亲和力结合到人C5aR上(Gerard等人(1992)) (和我们尚未公开的观察结果)。ZzC5i 广A小鼠中性粒细胞以相似的方
26式迁移至人和小鼠C5a处。
我们从一种融合物中制备多数hC5aR特异性单克隆抗体。配体结 合试验揭示了许多这种抗体显示出对1251 -标记C5a结合到人中性粒细 胞的抑制作用比单克隆抗体7F3更强。自1^5&尺+/+小鼠中性粒细胞产 生的抗体显示出广谱的^I-C5a结合抑制作用，从实质上完全抑制(如 3C5、 8G7、 7H3)到部分抑制或几乎无抑制作用，这取决于单克隆抗 体的克隆(图5)。最有效的抑制剂，单克隆抗体3C5，其ICs。为171 pM， 而与之形成对比的是，单克隆抗体7F3的ICs。为503 pM (图6)。用 /2C^广z+小鼠中性粒细胞免疫接种野生型小鼠而制备的抗C5aR单克隆 抗体完全不同，在于重链可变区的氨基酸序列完全不同，提示它们来 自不同的克隆。多数高品质和高亲和力的抗C5aR单克隆抗体的产生使 我们得以准确评价人白细胞上C5aR的表达。C5aR在中性粒细胞、嗜 酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞上以高水平表达，但在初始、 记忆或效应T细胞的所有亚群以及多数B细胞上不表达(图7)。 实施例3:小鼠类风湿性关节炎模型抗hC5aR单克隆抗体试验
表达人的分子的转基因小鼠的发展是一种方便的方法，其可用于 在动物模型中测定新的为人类使用而设计的治疗方法。C5aR在小鼠炎 症性关节炎的发病机理中发挥首要的作用。例如，C5aR缺失小鼠免于 罹患抗葡萄糖6磷酸同功酶的自身抗体(Ji等人(2002))或II型胶原 单克隆抗体(Grant等人(2002))诱导的关节炎。测定了抗hC5aR单 克隆抗体的保护或逆转/2C5i^+z+小鼠实验性关节炎的进展的能力。将 关节炎K/BxN小鼠的血清输至健康小鼠体内，诱导模拟K/BxN病的关 节特异性炎症反应(Kouskoff等人(1996) ; Korganow等人(1999))。 将/ C5/ 7+A小鼠用抗hC5aR单克隆抗体或同型匹配的对照组单克隆抗 体于第-1和1天预处理，并将K/BxN血清于第0天或2天注射入腹腔 内(腹腔内注射)。输完血清之后，对照抗体处理的小鼠显示出典型的 临床关节炎表现，伴有关节肿胀和炎性浸润，而用抗hC5aR单克隆抗 体处理的小鼠则表现出完全没有关节炎的炎症、临床或组织学表现。 /zC5i 广z+小鼠和对照同胞仔之间在疾病的发展上无可观察到的差异(数 据未显示)，提示人C5aR是完全功能性的，由于KxB/N模型的该病取 决于C5aR (]i等人(2002) ; Grant等人(2002))。更重要的是，当诱
27导出该病5天后给予抗体，我们观察到已形成的炎症反应发生了显著
的逆转。从表达抗hC5aR的小鼠中性粒细胞产生的单克隆抗体(3C5 和8G7)的这些效应的持续时间超过单克隆抗体7F3。少至1 mg/kg 的单克隆抗体3C5能够逆转炎症反应并能持久抑制炎症反应。 讨论
能够获得hC5aR基因敲入小鼠使得我们能够制备非常高的亲和力 的抗hC5aR单克隆抗体。这就大概涉及/;C5i 7+/+小鼠中性粒细胞上 针对高密度表达的人C5aR非常集中的免疫反应。中性粒细胞表达非常 高水平的C5aR，高达每个细胞上表达200,000个受体分子(Gerard & Gerard (1994a))，而L1.2 C5aR转染子表达 80,000受体，并超过中性 粒细胞2-3倍。因此，C5aR在原代小鼠中性粒细胞上的表达可达到高 得多的密度是关键因素。也可以想象在中性粒细胞上表达的抗原因 为中性粒细胞的抗原呈递功能或其细胞-细胞间相互作用或迁移的能力 而引起较好的应答。表达十分有效的人分子的转基因小鼠的开发被证 明是试验新型治疗方法(最终设计用于人)的方便的手段。在我们的 研究中，抗-hC5aR单克隆抗体是安全的，并对于治疗炎症性关节炎令 人惊讶的有力和有效。构建基因敲入小鼠的相对低的成本，和其在安 全性和有效性研究中的潜在应用提示这种小鼠成为临床前开发的标准 工具。本研究的另一个重要的结果是能够完全逆转关节炎炎症进展的 单克隆抗体的开发。的确，我们不知晓任何其它能将这些模型的关节 炎如此完全预防或逆转到我们用抗C5aR单克隆抗体治疗所看到的程 度的治疗方法。此外，抗C5aR单克隆抗体以相对低的剂量(lmg/kg) 显示出该效应，该剂量大大低于抑制小鼠关节炎所用的抗C5抗体的剂 量(每只小鼠40 mg/kg或lmg) (Ji等人(2002) ; Wang等人(1995))。 之所以如此的一个原因可涉及高浓度( 180ug/ml)的C5通常出现在 血细胞上或组织液中。此外，我们的单克隆抗体识别C5aR但不识别与 C5a结合后产生抑制性信号的第二 C5a结合受体C5L2 (Gerard等人 (2005))。这样，抗-C5aR单克隆抗体抑制炎症反应的程度可由于未 打断C5a与C5L2的结合。总之，hC5aR敲入小鼠对于制备与人C5aR 以高亲和力结合的单克隆抗体，对于在开发人类治疗性用途之前确定 这些抗体对小鼠的疾病模型的有效性是非常有效的手段。此处描述的对于C5aR方法一般应可应用于其它重要的治疗耙标。
本领域技术人员可理解，可在不脱离广义描述的本发明的实质或 范围内对本发明作出如在具体实施方式
中所示的许多变化和/或修改。 因此应该认为本发明的具体实施方式
在所有方面是示例性而非限制性 的。
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权利要求
1、一种制备与第一物种多肽结合的抗体的方法，该方法包括用源自第二物种转基因哺乳动物的细胞免疫接种第二物种哺乳动物，其中第一物种多肽在源自转基因哺乳动物的细胞表面表达。
2、 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从免疫接种的哺乳动物得到的脾细胞制备杂交瘤细胞。
3、 根据权利要求2所述的方法，其进一步包括筛选杂交瘤细胞以得到与第一物种多肽结合的抗体。
4、 根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
5、 根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中第一物种是人。
6、 根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中第二物种选自牛、猪、山羊、绵羊、骆驼、马、猫、狗、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、仓鼠或小鼠。
7、 根据权利要求6所述的方法，其中第二物种是小鼠。
8、 根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中第一物种多肽是G蛋白偶联受体。
9、 根据权利要求8所述的方法，其中G蛋白偶联受体是趋化因子受体。
10、 根据权利要求8所述的方法，其中趋化因子受体是C5aR。
11、 根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中源自转基因哺乳动物的细胞是免疫系统细胞。
12、 根据权利要求ll所述的方法，其中源自转基因哺乳动物的细胞是抗原呈递细胞。
13、 根据权利要求12所述的方法，其中抗原呈递细胞是中性粒细胞。
14、 一种根据权利要求1至13任一项所述方法制备的抗体。
全文摘要
本发明涉及制备抗体的方法和由该方法制备的抗体。在一个具体实施方式
中，本发明涉及制备与第一物种多肽结合的抗体的方法，该方法包含用源自第二物种转基因哺乳动物的细胞免疫接种第二物种哺乳动物，其中第一物种多肽在源自转基因哺乳动物的细胞表面表达。
文档编号C12N15/12GK101501073SQ200780029714
公开日2009年8月5日 申请日期2007年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者C·R·麦肯 申请人:G2英弗勒美欣私人有限公司