专利名称：：分离hiv-1蛋白酶抑制剂的体系和药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明至少涉及细胞生物学、分子生物学和医学领域，特别涉及治疗HIV/AIDS的药物组合物。
背景技术：
：HIV/AIDS依然是不可治愈的疾病，威胁全球数百万人的生命。鸡尾酒疗法，一般也称HAART或ART,是目前可以使患者的HIV-1降低到能够检测出的水平之下的最为成功的抗逆转录病毒疗法。典型的ART疗法需要联合使用一个HIV-1蛋白酶抑制剂(HIV-1PI)和两个HIV-1逆转录酶抑制剂。在两类抗-HIV治疗药物中，HIV-1PI是最有效的病毒抑制剂，其单独使用也能使病毒减少2-3个数量级。HIV蛋白酶是产生病毒感染力的根本，它能将病毒多聚前体蛋白切割成活性病毒酶(逆转录酶、蛋白酶和整合酶)和结构蛋白。因此，HIV-1蛋白酶被用来生产病毒的结构蛋白和酶，并且对于感染性病毒粒子的成熟也是必须的。目前，获得美国FDA批准的PI—共有8个，所有的这些PI都属于与蛋白酶的活性位点结合的竞争性抑制剂，事实上，这其中的许多PI都是设计成能够与蛋白酶的活性位点结构的匹配。PI与蛋白酶的活性位点的结合阻止蛋白酶切割病毒前体聚合多肽，因而阻断了随后的病毒成熟。ART疗法面临的主要问题之一是病毒会快速对药物产生抗性，病毒的PI抗性一般是由于蛋白酶基因内逐步累积的突变而出现，并且这种抗性增长迅速。ART治疗失败经常是多抗药性导致，即蛋白酶变得对使用的多数或全部PI有抗性，这瞀示我们HIV多抗药性最终有可能超过目前我们所能获得的PI数量。因而，目前急切需要开发其他能够对有抗药性的蛋白酶具有药效的PI。
发明内容本发明主要涉及一种与HIV治疗药物的筛选和使用有关的体系、方法和药物组合物。特别是，发明人在本领域取得了一定的进步，使得筛选HIV-1蛋白酶抑制剂的标准方法得以发展和利用，当然这个方法也可以替换成HIV-2蛋白酶抑制剂的筛选方法。在本申请文件给出的第一个实施方案中，裂殖酵母因其内的蛋白酶基因高水平表达而致死，这一发现为鉴别蛋白酶抑制剂提供了基础，当蛋白酶基因表达时，可以通过蛋白酶抑制剂具有的使细胞存活生长的能力而将其分离出来。在本发明的一些具体的实施方案中，提供了基于细胞的标准筛选方法，该方法可以鉴别出能同时抑制野生型和具有抗性的蛋白酶的化合物。这些新的抑制剂在某些情况下可能不会与活性位点结合，因此为我们揭示了抑制蛋白酶活性的新途径，即通过耙向蛋白酶的其他区域和功能区。具体地，本发明可以在用于筛选HIV-1蛋白酶的广谱抑制剂的全自动髙通量分子筛选(HTS)方法中采用一些基于裂殖酵母细胞的测试。更具体地，这些测试可以使用96孔板模式和比较小型化的模式。更具体地，蛋白酶活性的检测可以采用吸光率检测细胞密度，或者也可以采用荧光检测细胞活性，如可以将荧光检测作为进一步的确证实验。在其他的或替代的实施方案中，采用对GFP-底物-Vpr融合蛋白进行绿色荧光重定位来作为检测蛋白酶活性的反向筛选试验。更具体地，这三种检测方法可以被应用到HTS模式中和/或利用一些潜在的抑制剂文库，例如Sigma的LOPAC1280化合物文库。本发明的某些内容中，还提供了在几个水平上来筛选鉴定蛋白酶抑制剂的方法。例如，当蛋白酶基因表达时，将细胞活性作为筛选指标来筛选鉴别一些能够使细胞继续存活生长的蛋白酶抑制剂。基于另一水平的筛选方法，使用体外酶法测定蛋白酶活性的方法来筛选蛋白酶抑制剂，这一方法可以与细胞活性测定方法联合使用，也可以替代细胞活性测定方法，例如酶解蛋白酶底物。虽然在一般的实施方案中酶切位点可以是任何HIV-1能够酶切的合适位点，但在特定的实施方案中，酶切位点序列可以优选SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列。7在另一个实施方案中，采用体外测定蛋白酶活性的方法，蛋白酶活性通过绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中定位来测定。这测定方法提供了一个半定量测定细胞内蛋白酶总活性的方法，能够用于对蛋白酶的底物特异性进行定性。就本发明的不少实施方案来说，例如，分离抑制剂一方面可以去掉因同源重组而缺失表达基因的细胞的背景。例如，将对抗生素(如G418)具有抗性的多聚核苷酸与蛋白酶多聚核苷酸连接，这些失去蛋白酶基因的细胞能很容易地被鉴别出来且在蛋白酶抑制剂筛选中被去除。这一手段将基因缺失导致的背景降到非常低的水平，以至于它不再能明显干扰蛋白酶抑制剂的筛选。发明人将本发明的一个标准筛选方法，即将具有低背景和成功应用过的程序，应用到筛选裂殖酵母基因组文库的方法中，鉴别出了hhp2基因为裂殖酵母的一个蛋白酶抑制剂。现有技术中，没有任何关于hhp2和HIV-l蛋白酶基因之间关系或者抑制机制可以被定性的报道。因此，hhp2多聚核苷酸是一个新的标准抑制机制，这个发现也为研究抑制HIV-1蛋白酶提供了新的策略。在本发明的一个实施方案中，提供了一种鉴别HIV蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤首先提供一种酵母细胞，所述的酵母细胞内包含有由编码HIV蛋白酶的基因序列组成的多聚核苷酸；然后将所述的多聚核苷酸置入候选试剂中；再评估以下的其中一项或两项指标1)所述的酵母细胞的细胞活性和/或生长情况；其中，与缺少候选试剂的情况下的细胞进行对比，在所述的候选试剂存在的情况下细胞能够存活的，所述的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂；2)HIV蛋白酶底物的酶切效果，其中能够阻止底物被酶切的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂。更具体地，HIV蛋白酶为HIV-1蛋白酶或HIV-2蛋白酶。在本发明的另一个特定实施方案中，HIV蛋白酶的表达受到过表达调控序列的调节。更进一步地，这些抑制剂可以是多肽、多聚核苷酸、小分子、抗体，或者以上多种物质的混合物或组合物。酵母细胞优选裂殖酵母，例如粟酒裂殖酵母。在本发明的特定实施方案中，多聚核苷酸被整合到酵母基因组中。过表达调控序列可以选择nmll过表达调控序列、adhl调控序列、fbpl调控序列、invl调控序列，或者在某些情形下也可以是ctr4调控序列。多聚核苷酸可以进一步优选包含至少一个能够在细胞活性测试中减少背景生长信号的片段。在特定的实施方式中，减少背景的组分可以为标记物，例如可以为对抗生素具有抗性的标记物、对G418或潮霉素具有抗性的标记物、营养标记物、也可以选自adel、ade6、arg3、CAN1、his3、his7、leul、leu2、sup3-5、ura3和ura3。在某些具体实施方式中，HIV蛋白酶为人HIV蛋白酶，HIV蛋白酶底物为人HIV蛋白酶底物。更具体地，评估HIV蛋白酶底物的酶切效果可以为评估由第一多肽片段和第二多肽片段组成多肽的酶切效果，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于所述的第一多肽片段和第二多肽片段之间。一方面，第一多肽片段中可以为可探测的标记，另一方面，第二多肽片段可以为HIV蛋白酶的底物，例如HIV-1Vpr多肽。具体地，酶切位点为DSQNYPIVQ(参见SEQIDNO:3)、DSFNSTQIT(参见SEQIDNO:4)、VSQNYPIVQN(参见SEQIDNO:8)、KARVLAEAMS(参见SEQIDNO:9)、SATIMMQRGN(参见SEQIDNO:10)、RPGNFLQSRP(参见SEQIDNO:ll)、VSPNFPQITL(参见SEQIDNO:12)、CTLNFPISPI(参见SEQIDNO:13)、GAETFYVDG(参见SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(参见SEQIDNO:15)。优选地，可探测的标记可以是绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白。优选地，该方法还可以进一步包括将治疗有效剂量的所述抑制剂输送到感染HIV病毒或者患有AIDS的个体的步骤。另外优选地，该方法也还进一步包括将有效剂量的所述抑制剂输送到可能感染HIV病毒或可能患上AIDS的个体来作为预防的步骤。在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗感染HIV病毒或患AIDS的个体，该方法包括将治疗有效剂量的包含有hhp2的药物组合物输送到患者体内的步骤。具体地，hhp2是一种多聚核苷酸，优选编码hhp2多肽的多聚核苷酸。序列表中如SEQIDNO:16所示(GenBankAccessionNo.U10864)提供了粟酒裂殖酵母的hhp2多聚核苷酸的标准序列。粟酒裂殖酵母hhp2多肽的标准序列参见序列表中SEQIDNO:17(GenBankAccessionNo.AAA21545)所示。从蛋白序列和结构来看，裂殖酵母hhp2与人类酪蛋白激酶1(CKl)同源；CKl多聚核苷酸的标准序列参见序列表SEQIDNO:18(GenBankAccseeionNo.X80693),CKl多肽的标准序列参见序列表SEQIDNO:19(GenBankAccessionNo.CAA56710)。本发明的药物组合物，如用于治疗HIV或AIDS的药剂具有HIV-1和/或HIV-2蛋白酶抑制剂功能，例如其序列可能为序列表SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或者SEQIDNO:19所示，或者这些药物组合物中包含有与序列表SEQIDNO:169或SEQIDNO:17所示序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的相似性的分子。在本发明的一个特定实施方式中，提供了一种包含有编码HIV蛋白酶的多聚核苷酸的酵母细胞。具体地，HIV蛋白酶可以优选HIV-1蛋白酶或者HIV-2蛋白酶。具体地，可以优选其表达受到过表达调控序列的控制的多聚核苷酸。再进一步地，多聚核苷酸可以为标记物，例如对抗生素具有抗性的标记物，进一步优选营养标记物。另一方面，酵母细胞内也可以进一步包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。更进一步地，第一多肽片段中包含有可检测的标记，例如绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白；第二多肽片段也可以优选HIV-1的Vpr多肽。另外，酵母细胞可以是酵母细胞培养物或者酵母细胞克隆。在本发明的一个补充实施方案中，提供了治疗和/或预防感染HIV和/或患上AIDS的药物组合物试剂盒，该试剂盒中包含有装在合适的容器中的编码hhp2的多聚核苷酸或hhp2多肽。具体地，该试剂盒还可以进一步包含药学上可以接受的赋型剂。本发明的另一个具体的补充实施方案中，提供了用于筛选一个或多个HIV蛋白酶抑制剂的试剂盒，该试剂盒中包含有本发明的酵母细胞。更具体地，本发明的酵母细胞还可以进一步包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。上述内容已经列出了本发明的足够多的技术特征以及技术进步，能够帮助理解下面的本发明详细说明。本发明的其他的技术特征以及技术进步将会在下文中介绍，这些也成为本发明权利要求书中的要求保护的主题。凡根据本发明申请文件中提供的发明构思和具体实施方式所作的等效变化或修饰，都是本领域技术人员能够想到的；同样的，凡是属于本发明的精神实质和权利要求书所确定的范围的等同发明也是本领域技术人员能够想到的，都应涵盖在本发明的保护范围内。为了让本领域技术人员能够更好地理解本发明的发明点、本发明的组成和实施方法、以及进一步改进的技术方案和技术进步，下面将结合具体实施方式和附图对本发明进行详细的说明。然而，提供的具体实施方式和附图内容只为解释和说明本发明，并不能视为对本发明保护范围的限制。为了更好的理解本发明，下面列出作为参考。图1示出了在髙背景下筛选抑制剂时，通过同源重组去除整合酶基因；图2表明蛋白酶附近的卡那霉素抗性基因，用于鉴别同源重组导致的缺失。图3示出了通过同源重组整合进入iimtl位置的质粒；图4示出了分离的两株G418抗性菌株，当蛋白酶表达时它们的生长被强烈抑制；图5阐明诱导平板上未形成克隆的细胞；图6，蛋白酶表达被抑制后失去活性；图7,使用GFP-Vpr融合蛋白重定位监测蛋白酶活性；图8，HIV-1蛋白酶不影响GFP的定位；图9,蛋白酶没有使GFP-Vpr重新定位到细胞质；图10，蛋白酶使GFP-SLMa-Vpr中的GFP再次定位到细胞质；图11,蛋白酶使GFP-SLp6-Vpr中的GFP再次定位到细胞质；图12,蛋白酶没有使GFP-SLA-Vpr中的GFP再次定位到细胞质；图13，与PrliitB菌株相比，PrliitBG418抗性菌株生长受到抑制；图14,尽管nmtl启动子不同，两典型菌株都有单个质粒整合进入iimtl位点；图15,以GFP百分比(GFP%)的方式反映蛋白酶活性；图16，印地那韦(indinavir)蛋白酶对生长的作用；图17,印地那韦(indinavir)阻止GFP-SLp6-Vpr中的GFP重新定位于细胞质图18,随着印地那韦(indinavir)浓度的增加，GFP减少；图19,印地那韦(indinavir)促进克隆斑形成；图20，1000个细胞中只有1个可以在诱导平板上形成克隆；图21，诱导平板上的大多数克隆缺少卡那霉素抗性；图22,对G418复制子来源的克隆重新测试，表明大多数有蛋白酶基因；图23,使用PrIndA菌株进行蛋白酶抑制剂的低背景筛选；图24，背景举例，包括G418抗性和在T平板上的猛烈生长；图25,T培养基上的快速生长与质粒无关；图26,诱导平板上生长的背景菌株和正常菌株均的蛋白酶基因均有移码突变；图27,弱抑制剂质粒的分离；图28，依赖于质粒的弱抑制；图29,在大肠杆菌复活后，一个典型质粒(pPS3-3)并没有像其他的一样进行重测；图30，ll个复活质粒中的IO个重新检测，为生长的弱抑制剂；图31，ll个复活质粒中的IO个重新检测为增加细胞活性的弱抑制剂；图32，10个典型的抑制剂质粒都含有hhp2基因。发明详细说明I.定义为了与长期以来一直存在的专利法惯例保持一致，本发明说明书和权利要求书中使用的英文词汇"a"和"an"表示"一个或多个"。本发明的一些实施方式中可能包含或本来就包含了一个或多个组分、步骤和/或方法。本申请文件中所提供的任何方法或组合物也可以替换成本领域技术人员所能够想到的其他方法或组合物。II.本发明的具体实施说明HIV/AIDS是全球最具威胁性的疾病之一，2005年大约有4000万人感染或携带HIV，每年约有400万新感染者。在美国，HIV是25到44岁成年人的第二大杀手。HIV-1蛋白酶是最清楚的最成功的治疗HIV感染的药物靶标。蛋白酶产生于一个非活性的Gag-Pol前体聚合蛋白，在翻译过程中移码阅读产生。蛋白酶在聚合蛋白的9处切割蛋白，释放出感染性病毒组装所必需的包括完全活性蛋白酶在内的各种蛋白。既然蛋白酶作用过程是产生病毒粒子的重要步骤，蛋白酶成了抗HIV药物的主要耙点，蛋白酶抑制剂(PI)是抗HIV治疗的主要策略。单独使用PI能够使病毒数量降低2-3个数量级，联合其他抗病毒药物使用能够将病毒水平降低到检测不到的水平。目前使用PI的一个问题是诸如髙脂血症等副作用。另一个严重的问题是，长时间使用PI因其病毒多抗药性。这些抗性突变的一些事PI特异性的，但是PI治疗过程中病人蛋白12酶多个突变聚集导致多数甚至所有PI抗药性(Palmer,Shafer和Merigan，1999;Vickrey等，2003)。交叉抗性产生频率比预期更髙，致使任何可获得的PI治疗失败(Palmer,Shafer和Merigan,1999)。例如，MDR769蛋白酶是从一个治疗失败的病人中分离的，除了对印地那韦有14倍的抗性外，对所有已获批准的PI均有40倍的抗性(Logsdon等，2004)。这些治疗过程中蛋白酶多耐药性的产生是PI对HIV感染最终失去治疗效果的主要原因，产生了HIV多抗药性增长速度超过目前所能获得的PI数量。因此，亟需针对抗药性蛋白酶开发新的活性PI。因此，新的副作用小的PI能够治疗HIV-1感染，并作用于对已有PI具有抗性的蛋白酶。利用裂殖酵母进行新的PI筛选的细胞筛选系统具有两个优点。首先，细胞系统具有明显优势，毒性化合物不能穿过细胞膜而被排除在外，而细胞内的活性化合物检测呈阳性。其次，筛选的化合物抑制蛋白酶活性而与它们是否与酶的活性位点结合无关。2005年FDA批准的所有PI均与蛋白酶的活性位点结合，它们的开发依赖于活性位点结构细节信息。这样一种筛选程序有可能发现针对蛋白酶其它区域和结构域的抑制剂。例如，一个抑制蛋白酶活性的新的机制是针对26S蛋白酶体降解，这只有通过细胞筛选系统才能够检测到。作为新合成的非正确折叠蛋白质或活性蛋白降解产物的未折叠蛋白，经常通过26S蛋白酶体酶解(Wolf和Hilt，2004)。一个短时阻止新合成蛋白酶折叠的化合物可以被26S蛋白酶体降解，但是这样的化合物无法通过无细胞的筛选系统检测，因为它不存在新合成的蛋白酶和蛋白酶体。在这个例子中，需要重点指出的是，在裂殖酵母和人体细胞中有大量的类似26S蛋白酶的降解途径(Parodi,1999),这一类似性含有许多其它的基本细胞过程(Zhao和Elder,2000;Zhao和Lieberman,1995)。因而，化合物需要细胞活性过程，裂殖酵母细胞是一个很好的开发细胞为基础的化合物筛选系统，筛选出的化合物可用于人类。在此，发明人开发了一个裂殖酵母系统，通过诱导HIV-1蛋白酶基因表达使细胞死亡。除了影响细胞生长和活性，该发明提供了一项测定酵母细胞内蛋白酶活性的测试，该测试能够利用GFP的绿色荧光进行从细胞核到整个细胞范围的重定位来表明蛋白酶活性。PI印地那韦在细胞内抑制蛋白酶，这可以通过其对细胞生长的效应和GFP的重定位试验反映。裂殖酵母系统的三项显示读数可以用于开发髙通量筛选(HTS)系统。此外，利用突变，蛋白酶抗13性基因用于HTS系统使筛选的化合物有针对野生性和突变的蛋白酶的广谱活性。这样筛选鉴定的化合物能够开发为目前治疗方案失败的病人中发现的抗性蛋白酶。至少本发明的某些方面考虑到了抗蛋白酶的抑制剂包括，例如针对HIV-1蛋白酶或者HIV-2蛋白酶，或者同时针对两者。另外，裂殖酵母系统允许在细胞内快速高通量筛选抗蛋白酶试剂。由于这一新建立的细胞系统与传统的结构设计有内在不同，使用这一新的系统筛选抗PR药物，至少提供了一种抗HIV治疗的方案。IE.HIV-1蛋白酶蛋白酶是将蛋白质切成组分多肽的一种酶。当"多聚体蛋白"被剪切后产生成熟病毒的活性蛋白成分，这些蛋白构成人类免疫缺陷病毒(HIV)。HIV-1蛋白酶是一个剪切病毒复制过程中新生多聚蛋白的天冬氨酸蛋白酶。HIV-1蛋白酶(PR)水解病毒多聚蛋白形成对病毒装配和活性具重要作用的功能性蛋白质产物，可以促进病毒从宿主细胞出芽形成病毒粒子的成熟过程。PR是同源二聚体，每个单体由99个氨基酸构成，构象也一样，N末端为脯氨酸Pro，C末端为苯丙氨酸Phe。活性蛋白酶的每个单体位置呈中心对称排列，其二级结构包含一个《-螺旋和两个反向平行的P片层。除了依靠非共价相互作用稳定二聚体外，侧链的疏水相互作用以及每个单体疏水核心的催化残基、脂肪族氨基酸残基都起到了重要作用。每一单体包含两个半胱氨酸残基，但并不参与形成二硫键。在二聚体界面处形成活性位点，通过作为四个来回的P折叠一部分的两个结构域之间产生的裂缝形成，其位置处于接近分子的中心处。活性位点被一个扩展的转角、一个P发卡环和一个卩片层覆盖。这一片状结构从46位的苯丙氨酸(Met)—直到55位的赖氨酸(Lys),具有类似铰链运动似的灵活性，通过开关进入疏水区域的末端促进底物达到活性部位，以此发挥PR活性的核心作用。PR呈椭圆形并相对扁平，在中空的裂缝中有几个潜在的结合区域。蛋白酶催化的蛋白链的剪切是活性位点25位并列的两个天门冬氨酸(Asp-25)介导的，这两个天门冬氨酸形成一个"催化二聚体"。两个羧基其中一个pKa值低于寻常为3.3,另一个为常规的5.3。这一催化二聚体经常与酰氨基相互作用并被剪切成多肽底物。本发明的一些具体情形下，HIV-1蛋白酶是指人类HIV-1蛋白酶，而进一步的HIV-1蛋白酶多聚核苷酸序列是指SEQIDNO:l序列，多肽序列是指SEQIDNO:2序列。同样，本发明的一些具体情形下，HIV-2蛋白酶是指人类HIV-2蛋白酶，HIV-2蛋白酶多肽序列是指SEQIDNO:5(GenBankAccessionNo.2MIPC,gi:443404)序列，HIV-2蛋白酶多聚核苷酸序列是指SEQIDNO:6序列。其他情形下，国家生物技术信息中心数据库GenBank中AccessionNo.S42993,gi:354697;SEQIDNO:7的HIV-1病毒感染因子(vif)也被应用。在替代方案中，从此处提供的各自序列来看，HIV-1蛋白酶或HIV-2蛋白酶有一个或多个序列的变化，只要蛋白酶在酵母细胞过量表达，细胞将会死亡。本发明中所用的序列与此处提供的序列至少有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的一致性。目前的HIV-1蛋白酶抑制剂包括，例如Invirase(甲磺酸沙奎那韦，saquinavirmesylate;其化学名为N-叔丁基-D氢化-2-[2(R)-羟基-4-苯甲基-3(S)-[[N-(2-喹啉基甲酰基)墨D-天门冬酰胺I氨基丁基]-(4AS，8AS)-异喹啉-3(S)-C甲酰氨甲磺酸；N-tert-butyl-decahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-quinolylcarbonyl)-D画asparaginyl]amino]butyl]國(4aS，8aS)-isoquinoline誦3(S)-carboxamide),分子式为C38H5()N605,CH403S，分子量为766.96，其中自由基的分子量670.86;这些抑制剂在美国专利No.6,043,357中有叙述；法定的发明注册号为H1649;还包括诸如利托那韦(Ritonavir,Norvir),安普那韦(Amprenavir),阿扎那韦(Atazanavir,ATV)，福沙普利那韦(Fosamprenavir),印地那韦(Indinavir),洛匹那韦(Lopinavir),替拉那韦(Tipranavir)，萘非那韦(Nelfinavir,Viracept)等。本发明鉴别的蛋白酶抑制剂可用于代替一个或者多个目前已知的HIV-1蛋白酶抑制剂，或者作为已有蛋白酶抑制剂的补充。IV.HIV-1蛋白酶抑制剂候选药物在本发明的某些方面，使用的鉴定一个HIV-1蛋白酶抑制剂的筛选方法是直接鉴别HIV-1蛋白酶抑制因子的。只要是能够抑制过量表达HIV-1蛋白酶酵母细胞的死亡，这些抑制剂可以是任何类型的。在一些替代方法中，可以鉴别较弱的抑制剂，例如通过至少一次的选择生长较慢的菌落。在特定情形下，HIV-1蛋白酶抑制剂可以是一个或多个蛋白、多肽、肽段、抗体、DNA和/或RNA寡聚核苷酸、小分子、合成化合物、天然化合物等。抑制剂也可以从其他类似分子文库中筛选，例如，可以利用候选药物调节器文库，包括多种有机体，如粟酒裂殖酵母和酿酒酵母，人类，小鼠，老鼠，真菌，果蝇，线虫，拟南芥，红鳍东方豚等。当然，有时候也用小分子文库替代。一个例子是从一株或多株植物收集分子，文库中所用的典型植物也包括中国的药草。文库也包括干扰RNA，例如包括RNAi,siRNA和shRNA。在某些方面，小分子文基于已知的蛋白酶抑制剂结构选择，包括抑制的HIV-1和/或HIV-2抑制剂。V.酵母酵母是单细胞真菌，细胞调控机制与人类细胞非常类似，其精确分类是一门依赖于细胞、孢子和菌落形态特征的领域，也包括生理学特征。另一个更显著的特征是将糖发酵产生乙醇的能力。芽殖酵母属于子囊菌门半子囊菌纲，真核酵母分为两个主要的酵母菌目。酵母杂自然界分布广泛，经常在植物叶和花、土壤和盐水中发现，也存作为一种共生或寄生方式在于恒温动物的皮肤表面和内脏。酵母单细胞繁殖的方式包括出芽(例如酵母目)或者直接分裂(裂殖，例如裂殖酵母菌)，或者它们简单的以不规则的丝状(菌丝体)生长。大多数形成子囊的酵母有性生殖方式中，至少包含八个以上的单个孢子，这些孢子可以与核融合并通过营养分裂倍增，或者有些酵母可与其它孢子融合。本项发明使用的酵母细胞，不仅限于酵母目(例如酿酒酵母；啤酒酵母)、裂殖酵母(如粟酒裂殖酵母)、毕赤氏酵母(如巴斯德毕赤酵母)、汉森酵母(如甲基营养酵母)、克鲁维酵母(如乳酸克鲁维酵母)和耶氏酵母(如解脂耶氏酵母)。本发明的某些特定方面使用的是粟酒裂殖酵母。酵母遗传学的发展壮大部分归因于粟酒裂殖酵母基因组表型产生基因区域的快速绘图能力。粟酒裂殖酵母已经成为许多分子遗传学研究的模式系统。A.酵母细胞培养一些酵母种类复制速度和细菌一样快，基因组大小只有不到哺乳动物的1%。它们可以被进行快速的分子遗传学操作，其基因可以被删除、替换或者16改变。它们也拥有非常规的单倍体增殖方式，细胞内每个基因只有单一拷贝，这使得分离和研究某个基因的失活突变变得容易，也避免了细胞内忧另一基因拷贝的复杂性。酵母菌的培养包括单个酵母细胞的分离、酵母培养和酵母的繁殖，直到获得足够数量的培养物。纯的酵母培养物来源很多，例如可以购买商业化产品或者通过培养收集。收集纯培养物有各种流程，包括从单个菌落、单个细胞或分离细胞和菌落的混合物开始培养。繁殖的目标是在尽量短的时间内获得大量的性能明确的酵母，一种方法是成批量的繁殖系统，即利用几毫升的培养逐步放大直到获得所需量的酵母，放大过程中加入活性强的生长细胞提供新鲜的营养，使酵母在最佳的生理状态下拷贝复制。B.酵母启动子在某些方面，一个调控区域指的是一个启动子，用于促进HIV蛋白酶的表达而使细胞死亡。启动子可能位于与蛋白酶多聚核苷酸操作有关的质粒(或其他载体)上，也可能位于酵母基因组内。启动子可以是过量表达的，可诱导的或者组成性表达的。因此，包含HIV-1蛋白酶的表达结构含有一个调控序列，调节HIV-1蛋白酶的表达到促使细胞死亡的水平。例如，调控序列可能促使HIV-1蛋白酶过量表达而杀死酵母细胞。其他情形下，调控序列可以被诱导，例如通过直接诱导HIV-1蛋白酶表达并暴露于特定的培养基中。Gal1和Gal10便是这类启动子，可以通过半乳糖诱导。通过这样的基因的开或关来改变表达经常是值得的，因为这使得研究人员可以根据时间来调节表达。一些情形下，酵母细胞是裂殖酵母细胞，裂殖酵母的典型启动子包括adhl+(组成性高表达)，fbpl+(碳源诱导反应)，基于CaMV启动子的四环素抑制系统和目前最经常使用的iuntl+(在硫胺中无信号)启动子。nmtl+启动子有三个版本全力启动子和两个在抑制和诱导条件下都弱化的版本。在nmt载体的REP/RIP系列中游击个不同的聚合接头，可以通过调节硫胺的浓度来部分激活。充分诱导无硫胺。充分抑制20pM的硫胺(5fig/ml)。部分诱导(如参考文献所述)0.05fiM硫胺(0.016fig/ml)。iimtl启动子不会完全关闭，构建一个"切断"质粒的能力极大依赖于被表17达的蛋白质和细胞对特定蛋白剂量的灵敏度。许多nmtl控制表达的基因即使在硫胺存在的情况下也可以通过最弱的启动子得到补充，但也有许多基因被成功关闭得到无义表型的例子。因此，必须根据每个基因具体情况经验性的确定如何利用这类启动子进行质粒关闭实验。其它对条件性表达有用的启动子包括直接促进表达的nmtl、fbpl+、hiVl+和ctr4+，以可以认为这些启动子对粟酒裂殖酵母十分有用。其他的启动子，对酿酒酵母非常有用，例如包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油激酶、诸如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶等的I型糖分解酶和其他酶类，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶负责麦芽糖和半乳糖的利用。其它的较强的酵母启动子是乙醉脱氢酶、乳糖酶和I型磷酸丙糖异构酶启动子。Gall基因和GallO基因相邻，从同一启动子区域以相反的方向转录。含UAS序列的调控区域可以在DedlSau3A片段处被切断，上游放置任何一个其它基因可以促进半乳糖诱导表达和抑制乳糖表达。PGK、GPD和ADH1启动子时组成性髙表达启动子(PGK-磷酸甘油激酶，GPD-甘油醛3磷酸脱氢酶，ADHh乙醇脱氢酶)。ADH2启动子是一个葡萄糖抑制启动子，在非发酵型碳源(与GAL1或10类似)中强烈转录并不受半乳糖诱导。CUP1启动子金属硫蛋白启动子，通过加入铜或银元素到培养基中活化，也是酵母细胞基因组中拷贝数多于一的几个基因中的一个。根据菌株的不同，这一基因可髙达八个拷贝。PH05启动子是编码酸性磷酸酶的分泌型基因，在低浓度或无磷酸的培养基中被诱导，磷酸酶的分泌可以促使一些磷酸从周围环境中释放出来。有磷酸的情况下，PH05无信号；无磷酸时，它强烈呈现。C.酵母转化流程有诸多手段可以转化酵母细胞，包括电转、醋酸锂和原生质体。一种情形下，一个分子可以通过简单的将酵母菌置于含该分子的培养基中进入酵母细胞。本发明的某些情形中，通过电转化将分子运送至一个细胞器、细胞、组织或机体内。电转时，将细胞和DNA的悬浮液置于高压电场中。该方法的修改方案，使用像果胶酶这样的细胞壁降解酶处理，使处理的靶细胞比未处理细胞对电转化更加敏感(美国专利U.S.PatentNo.5,384,253，见参考文献部分)。消解酶至少可以用在粟酒裂殖酵母上。机械损伤可以使感受态对转化更敏感。原生质融合已经用于克服阻止遗传无关联菌株交配的性别障碍(Svoboda，1976)，这有利于遗传成分整体或部分的交换(Provost等，1978;Wilson等，1982;Perez等，1984;Spencer等，1985;Pina等，1986;Skala等，1988;Janderova等，1990;Gupthar,1992;Moluar和Sipiczki，1993)。这一过程依赖于细胞壁的消化，以及随后的诸如聚乙二醇融合(Kao和Michayluk,1974)和已经用于酵母融合试验的原生质吸附启动子，Ca2+(vanSolingen和VanderPlaa"1997;Svoboda,198;Wison等，1982;Pina等，1986)。其他工作人员使用电融合技术替代聚乙二醇，报告了"一种增强的原生质融合率"(Weber等，1981;Halfrnann等，1982)。聚乙二醇的作用并不明确，它催化同种或异种原生质的凝集。融合过程总结如下(1)原生质随机融合成各种大小的凝块；(2)通过膜的解体和原生质内容物的并入，将凝块转变为合胞体("嵌合原生质融合产物")(Ahkong等，1975a;Gumper"1980;Svoboda,1981;Klinner和Bo"cher,1984);(3)膜的构造(Ahkong等，1975a;Gumpert，1980)和异核体内核的融合(Sarachek和Rhoads，1981;Klinner和Bottcher,1984)。另一种方法是利用电穿孔。首先用基本培养基(在到达早稳定期(OD595=1.5)之前转化频率不受生长的影响)使细胞生长至约lxl07/ml(OD595=0.5)。收集细胞，20'C,3000rpm离心5分钟，使用冰处理的水洗涤一次后接着利用冰浴好的1M的山梨醇洗涤。已有报道称这些细胞在25mM的DTT(二硫苏糖醇)孵育15分钟可增强电穿孔能力。最终将细胞重悬浮于冰浴的1M的山梨醇中，密度为l-5xl09/ml。40jil细胞I的悬浮液加入到含转化的DNA(100ng)的预冷的管子中冰浴5分钟，电穿孔使用参数设置如下(a)1.5kV,200ohms，25jiF(Biorad);(b)1.5kV，132ohms,40(iF(Gensen/Flowgen)。细胞和DNA转移到一预冷的玻璃管后脉冲处理0.9ml预冷的1M山梨醇立即加入玻璃管；在其它电穿孔进行的同时将细胞悬液返回管中冰浴。尽可能快的将细胞铺在选择平板上，32X:培养4-6天后转化子将开始出现。下面的醋酸锂草案来自Okazaki等(1990)、髙频转化方法和通过粟酒裂殖酵母反向互补的哺乳动物cDNA克隆的文库转导载体。细胞生长于150ml基本培养基到密度为0.5-1x107个细胞/ml(OD595-0.2-0.5)。细胞在含低浓度葡萄糖的培养基或者MB培养基(参考Okazaki等)中生长并不很好，但是可以提髙转化效率。收集细胞室温下3000rpm离心5分钟后，用40ml无菌水洗后再同前次一样离心沉淀。以lxl09个细胞/ml的浓度重悬浮于0.1M醋酸锂溶液中(醋酸调节pH至4.9),并分成多个100ul加入Eppendorf管，30"(ts突变体为25"C)孵育60-120分钟。每管加入溶于15ulTE(pH7.5)的1fig质粒DNA，并轻微混合，使孵育过程中沉积的细胞重悬浮。在此期间必须保持管子的温度不下降。290ul50%的PEG4000(w/v)预热到30匸(ts突变体为25C)后加入管内，接着轻微混合后30X:(ts突变体为25T:)孵育60分钟。这些管子43T热激15分钟后冷却10分钟至室温，使用Eppendorf离心机5000rpm离心2分钟，小心吸出上清液。利用移液管piletmanP1000反复吸入吸出，将细胞重悬浮于1/2YE肉汤培养基，然后转移到一个50ml烧瓶内，加入9ml的1/2YE稀释。细胞在(ts突变体为25'C)震荡培养60分钟或更长时间，取等量的小于0.3ml铺于基本培养平板上。如果需要，将这时期的细胞离心后重悬浮于1ml培养基并铺展更多细胞到平板上。D.酵母的密码子偏好性为了获得酵母细胞最佳表达的肽酶，编码肽酶的核苷酸将依据酵母密码子偏好性设计合成。下表提供了诸如粟酒裂殖酵母等的酵母偏好的密码子。表l:粟酒裂殖酵母的密码子偏好性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>CGTGinCAAHisCATProCCTE.酵母标志物在本发明的某些方面，利用标志物监测特殊寡聚核苷酸的存在。标志物可以是营养标志物或者抗生素抗性标志物，可以使用一个或多个标志物。虽然检测标记的寡聚核苷酸存在的任何营养标志物都可以利用，但是本发明中主要使用的营养标志物包括adel,ade6，arg3，CAN1,his3,his7，leul,leu2,sup3誦5，ura3和ura3。同时，虽然任何检测标记的寡聚核苷酸存在的抗生物标志物都可以使用，但是本发明主要使用的抗性标志主要包括卡那霉素，G418和潮霉素。F.酵母表达载体在某些情形下，表达载体包含已有发明中的一个或多个成分。虽然任何适宜的载体都可使用，但是在具体试验中，使用了一个或多个裂殖酵母载体，如表2所示，也可以通过南加州大学SusanForsberg的全球互联网站搜寻其中一部分。表2:典型的通用裂殖酵母载体质粒名称基础质粒酵母标志物酵母来源其它特征和注释pAL19pUCLEU2arsl蓝白斑paR3arg3+arslpBGlpUChis3+arsl蓝白斑pDBletbluescriptura4+2x两个ars增加稳ars3002定性pDB248XpBRLEU22micronpEA500pSP2his7十arslpFL20pBR322URA3arslstbpIRT2pUCLEU2wslpIRT2Uura4+pIRT2-CANlpUCLEU2CAN1用于1-1菌CAN1株反相选择pJK148bluescriptleul十—蓝白斑插入pJK210ura4十21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表3:裂殖酵母表达载体<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>pSMl/2LEU22micronSV40启动子pTLM2/pA17(pAU5)pSV40-无hCMV启动子；通过滴加G418增加拷贝数p2MGpARTl/N795URA3IAJE22micron通过adh-糖皮质激素受体(pART)调节GRE元件]VI.试验检测如上所述，本发明中的酵母细胞系统设计成鉴别挽救由于过表达HIV-l蛋白酶引起的细胞死亡的抑制剂和/或鉴别阻止蛋白酶活性的抑制剂，例如切断蛋白酶底物。测试开发的某一具体情形，优化和验证一个或多个裂殖酵母试验，用于典型的96孔板测定，特别是包括以下几点1)将在RE294裂殖酵母菌株中测定HIV-1蛋白酶诱导生长抑制活性的琼脂糖平板为基础的测定转化为吸光度测定。2)调节酵母存活/死亡的荧光读数，确定蛋白酶诱导的细胞死亡。3)将GFP荧光细胞重定位测试转化为监测HIV蛋白酶活性的高密度荧光测定，将这一测试用作技术筛选检测。在HTS类型测试中，对开发的测试方法进行二期优化，进一步来构建HTS，可以1)将所有的HIV-1蛋白酶测试修改为HTS形式，如果可能的话尽量小型化；2)将SAMINT软件应用到以HTS系统为核心的实验室全自动系统中，以控制包括液体操作和孵育在内的所有测试操作；3)根据质量控制参数建立所有的反应标准，包括测定重复性、变异系数(CV值)、信噪比和Z因子分析；4)使用药代动力学活性LOPAC1280化合物库(Sigma-RBI)运行检测。在进行了建议的调整和确认之后，这些裂殖酵母细胞测试将用于新的HIV-1蛋白酶抑制剂的HTS筛选，这些抑制剂参与到分子文库筛选中心的网络中。HIV-1蛋白酶的剪切活性可以用任何适宜的方式测定。虽然在特定实验中，这是通过检测特定HIV-1蛋白酶剪切位点测定的。任何HIV蛋白酶位点23都可以使用，但本发明主要包含以下位点DSQNYPIVQ(SEQIDNO:3);DSFNFPOIT(SEQIDNO:4);VSQNYPIVQN(SEQIDNO:8);KARVLAEAMS(SEQIDNO:9);SATIMMQRGN(SWQIDNO:IO);RPGNFLQSRP(SEQIDNO:ll);VSPNFPQITL(SEQIDNO:12);CTLNFPISPI(SEQIDNO:13);GAETFYVDG(SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(SEQIDNO:15)(参考Wlodawer和Gustchina,2000)。表达异质性HIV-1蛋白酶引起的宿主细胞死亡，但在有利于蛋白酶表达的条件下加入一种抑制剂，会阻断蛋白酶引起的细胞死亡并促使酵母细胞繁殖。可以通过将生物多肽、蛋白、小分子或细胞内重组抗体引入含异质蛋白酶的酵母细胞，直接快速地进行选择/鉴别允许酵母细胞在蛋白酶条件下生长和/或阻止蛋白酶底物剪切的抑制剂。A.遗传选择在遗传选择中，编码潜在的多肽抑制剂的DNA文库被髙频(每毫克质粒DNA超过10个转化子)转化到酵母细胞中。转化子在琼脂糖平板上培养，该培养基含有蛋白酶基因表达抑制剂的诱导子和去除一个氨基酸的质粒标记。大多数转化子由于蛋白酶的表达而无法生长，有些转化的细胞由于缺少质粒而不能生长。然而，酵母转化子中含有质粒性抑制剂的将可以正常形成菌落。可以根据标准的DNA纯化程序回收质粒DNA，抑制子DNA序列可以通过DNA测序确定。候选抑制剂的来源可以包括核苷酸文库，含基因组或cDNA文库，蛋白文库，多肽文库，RNA文库，抗体库，小的有机分子库。基因可以是任何形式，只要它们可以转化进入酵母细胞。基因组文库可以来源于酵母(包括粟酒裂殖酵母和酿酒酵母)、人类、小鼠、老鼠、藻类、真菌、果蝇、拟南芥和红鳍河豚鱼。B.髙通量筛选(HTS)可以通过本发明中的方法鉴别小分子肽和化学抑制剂。将酵母细胞稀释并平均分配到含酵母省长培养基的孔内，加入化合物，显微镜观察或多孔板阅读仪检测酵母细胞生长情况。抑制剂的存在会促使细胞生长，孔内浊度增加。这一HTS测试是一套标准的操作，已经成功用于鉴别小分子抑制剂，并与本发24明有实质性差异(Hughes,2002)。为了克服细胞渗透性等潜在的限制因素，可以使用特异性化合物如多粘菌素(Boguslaski,1985)增强细胞渗透性，或者使用细胞壁发生突变的酵母株(Brendel，1976)，也包含预期的受多重药物主动外排引起损害的细胞。VO.联合治疗本发明的HIV-1蛋白酶抑制剂均是针对个体治疗的需要，例如感染HIV的个体，患AIDS的个体，或者易感染HIV或易患AIDS的敏感个体。虽然本发明中的抑制剂没有与其他药物联合治疗HIV或AIDS，但为了增加抑制剂的治疗效果，将这些成分与其它试剂联合起来治疗HIV/AIDS是必要的。更有可能的是这些组分通过联合能更有效杀死HIV病毒和/或细胞成分。在一些特定方案中，发明中的组分与鸡尾酒治疗试剂联合，包括将其与各种不同的HIV治疗试剂合用。例如，将一个或多个蛋白酶抑制剂与一个或多个逆转录酶抑制剂合用。这一过程也包括将个体细胞与发明的组分和额外的试剂或多个因子同时联系起来。这可以是细胞与单一成分或包括两种试剂的药代动力学剂型联合，或将细胞与两个或以上的独特性成分或剂型联合。同时，一个细胞包含发明的成分，而另一个细胞包含第二种试剂，这种联合可以在两种治疗上产生累积或协同效应。本发明中的治疗可以在其它试剂治疗之前或之后进行，时间间隔可以从几分钟到数周。在其它试剂和发明的成分分开使用的情形下，须确保有效的时间周期不会短于两次给药的间隔，这样试剂和发明组分能持续发挥对细胞的联合效应。在这种情况下，必须考虑两种情形，两次给药相隔12-24小时，更有可能是6-12小时。在一些情形下，可以显著延长治疗时间周期，然而，两次给药也可能间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。如果发明成分为A,其它试剂为B,各种联合方式可以为A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A本发明的抑制剂成分治疗给药遵循常规的流程，这些流程用于其它的HIV/AIDS治疗。大家都期望可以按需要重复治疗周期，也可考虑将各种标准治疗与描述过的抑制剂治疗联合应用。与本发明联合使用的其它的HIV/AIDS治疗试剂可以是如下一些非核苷酸逆转录酶抑制剂，如地拉韦啶、依法韦仑、奈韦拉平；核苷酸类逆转录酶抑制剂，如阿巴卡韦、拉米夫定、齐多夫定、司他夫定、替诺福韦、扎西他滨；蛋白酶抑制剂，如安普那韦、阿扎那韦、氟沙普利那韦、茚地那韦、洛匹那韦、利托那韦、奈非那韦、沙奎那韦；和/或融合抑制剂，如恩夫韦地。豐.药剂学制备本发明的药剂学组成包括一个或多个发明中筛选鉴定的HIV-1和/或HIV-2蛋白酶抑制剂，也可以加入额外的试剂，溶解或分散于药剂学可接受的载体内。例如本发明的一项具体案例中，药剂学组分包含hhp2多聚核苷酸或多肽。短语"药剂学或药代动力学可接受的"是指在动物给药时，分子实体和组分不会诱发副作用、过敏和不适反应，这样对人体才是适用的。药剂学成分包含至少一个HIV-1蛋白酶抑制剂或加上活性中间体，其制备需要当前业内一经披露的一些技能，如Remington的制药科学(第18版，Mack出版公司，1990),这些在参考文献中有引用。此外，对动物(例如人类)给药，其制备需要符合FDA生物学标准要求的无菌、热源、常规安全和纯度要求，这很容易理解。从此处的使用来看，"药剂学上可接受的运载体"包括任何物质和所有溶剂，如分散介质，糖衣，表面活性剂，防腐剂(例如抗细菌剂和抗真菌剂)，同位素制剂，吸收延滞剂，盐，药物，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋型剂，分解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，诸如类似的材料和化合物。这是业内熟知的一种常规技能(Remington的制药科学1289-1329页；第18版，Mack出版公司，1990，参考文献引用)。目前，除了不适宜药物中间体外，任何传统载体用于药剂组分都是一件值得考虑的事情。HIV-1蛋白酶抑制剂所含不同的运载体类型依赖于药物剂型是固体、液体还是气体，也与如注射等给药途径是否需要无菌有关。本发明中的药剂可以静脉、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、叶鞘内、直肠、局部、肌内、皮下、粘膜、口服、本地、吸入(如气体吸入)、注射、灌输、连续输液、局部浸泡靶细胞灌注给药，通过导管、灌肠、乳剂，在液体组分内(如脂质体)，或通过其他方法或业内人和正在进行的常规方法。HIV-1蛋白酶抑制剂可以自由的赋予中性或盐溶液的形式，药剂学上可接受的的盐包括酸性盐类，例如那些蛋白组分的自由氨基，或者有机酸类，盐酸盐或磷酸盐类，或者如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有机酸。自由羧基形成的盐可来源于钠、钾、铵、钙或氧化铁等非有机元素，或异丙胺、三甲胺、组胺或普鲁卡因等有机成分。对于剂型来说，溶液形式给药方式应该与剂量相应，保证有效治疗所需的量。该剂型极易给药，包括一系列方式，如溶液注射类的非肠道给药，气体吸入至肺部，或者如释放胶囊类似物的消化道给药。为了进一步与本发明一致，本发明的药物成分装在药剂学可接受的运载体内，包含或者不包含惰性溶液。运载体应该是可吸收的，包括液体，半固体如软膏，固体。除了迄今为止的传统载体，试剂溶液或用作赋型剂以提髙疗效的载体外，将它们用于本发明中成分的给药也是合适的。载体或溶液包括脂肪，油，盐溶液，脂类，脂质体，油脂，粘合剂，填充剂及类似物，或者它们的联合。组分中也可以含有各种延缓氧化的抗氧化剂。此外，防止微生物活动可用防腐剂，如利用抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于灭菌剂(如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞及它们的联合。为了与本发明一致，组分与载体结合成任何方便实用的方式，如溶液、悬浮液、乳化剂、掺和剂、胶囊、吸收剂及类似物，这些都是业内司空见惯的。本发明的具体案例中，组分是与半固体或固体载体彻底混合的，混合过程可以使用任何便利的方式，如研磨。为了保护组分不散失治疗活性，混合过程也加入稳定剂，如胃部变性。组分中使用的稳定剂包括缓冲液，氨基酸如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖和甘露醇。在进一步的方案中，本发明将考虑利用药剂学脂质载体成分，包括HIV-1蛋白酶抑制剂，一个或多个脂类和一种水性溶液。此处所用的"脂类"定义为包括任何广泛的不容于水而可被有机溶液萃取的物质，这些物质对于业内人员是非常熟悉的，而此处所说的"脂类"也不限于任何特殊的结构。例如包括含长链脂肪烃及它们的衍生物。脂类可以自发产生或合成(如人工设计生产)。然而，脂类通常是生物学底物，生物学脂类广为人知，包括中性脂肪、磷脂、磷酸甘油、甾体、萜烯、溶源性脂类、鞘糖脂、糖脂、硫脂、含醚基和酯的脂肪酸以及聚合脂类，或者它们之间的联合。当然，除了那些具体讲述过的广为人知的化合物外，本发明也包含了其它脂类构成及方法。27该领域内的一项常规技能包括熟悉那些将组分分散到脂类载体的技术。例如，HIV-1蛋白酶抑制剂分散进入脂类溶液、溶于脂类、脂类乳化、与脂类混合、与脂类结合、共价连接到脂类、形成脂类悬浮液、装入胶囊或脂质体内，或与脂类或脂类结构通过任何已知方式结合。这种分布或许导致形成脂质体。药物组分的实际给药剂量根据患病动物的物理和生理因素确定，如体重、严重程度、疾病类型、原有治疗和共同治疗的情况、病人突发病情况和给药路线。根据剂量和给药路径的不同，优先剂量和/或有效剂量的给药途径数量由主体的反应决定。在任何情形下，实际操作者对给药负责，确定个体的药物中间体的浓度和合适的剂量。在某些情形下，药物组分可能包含一个活性化合物的0.1%,其他情形下，活性化合物重量比可在2%-75%之间，或在25%-60%之间，或任何其它的范围。自然的，每一治疗有效组分的活性化合物数量可以依据如下原则制备通过任何给定单位的化合物获得适合的剂量。在制备制药剂型的过程中应考虑溶解性、生物利用度、生物学半衰期、给药路线、产品保质期和其它的药物动力学因素。同时，不同的剂量和治疗方案也应该考虑。在其它非限制性实例中，剂量可以为1微克/千克/体重(fig/kg/bodyweight)、5fig/kg/bodyweigh"10(ig/kg/bodyweight、50fig/kg/bodyweight、100fig/kg/bodyweigh"200fig/kg/bodyweight、350fig/kg/bodyweight、500fig/kg/bodyweigh"1毫克/千克/体重(mg/kg/bodyweight)、5mg/kg/bodyweight、10mg/kg/bodyweight、50mg/kg/bodyweight、100mg/kg/bodyweight、200mg/kg/bodyweight、350mg/kg/bodyweigh"500mg/kg/bodyweight至!l1000mg/kg/bodyweight或者更多，甚至可以为任何剂量。从这些列出的数量衍生出来的范围为5mg/kg/bodyweight至U500mg/kg/bodyweight的给药剂量。C.消化道药物成分和剂型本发明的优先方案中，HIV-1蛋白酶抑制剂通过消化道给药，此处披露的药物组分所有可能的给药途径与消化道直接相关。具体说来，此处所讲药物组分可以口服、口腔、直肠或舍下给药。因此，这些组分可以通过惰性溶液或可食用吸收载体赋型，或者压成片剂，或者直接放入食品中。某些情形活性化合物整合入赋型剂成为可消化片剂、口腔片剂、药片、胶28囊、甘香酒剂、悬液、糖浆、水溶液和类似物(Mathiowitz等，1997;Hwang等，1998;美国专利U.S.Pat.Nos.5,641，515;5,580,579和5,792,451。每个均通过参考文献引用)。片剂、药片、药丸、胶囊剂类似物可以包含以下物质粘合剂，如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或者它们之间的联合；赋型剂，如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或它们之间的联合；分解剂，如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸钠或它们之间的联合；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖、糖精或硬脂酸镁；调味剂，如薄荷糖、冬青油、櫻桃调味剂、橘子调味剂等。当剂量单位为胶囊时，除了上述物质，还包含液体载体。各种其它物质可以包被或者修饰剂量单位的物理形式，例如片剂、药丸或者胶囊可以使用片胶、糖或者两者合用包裹。胶囊剂除了上述物质外，还包括液体载体。明胶胶囊、片剂或者药丸可以加上肠道糖衣。肠道糖衣阻止胃部和肠道上部酸性环境引起的药物变性，参考美国专利U.S.Pat.No.5,629,001。到大小肠后，内部pH值促使包衣解离释放出药物成分，并被特定细胞吸收，如肠道内皮细胞和肠道淋巴集合淋巴结细胞(Peyer，spatchcells)。糖浆可以包含蔗糖作为甲基化试剂，加入对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，也包含染料和调味剂，如樱桃和橘子调味剂。当然，任何用作药物剂型的物质均应满足制药学纯度，同时还不具有实质的毒性。此外，活性化合物可以融入持续释放的剂型中。本法明组分的口服给药可以选择性整合入一种或多种赋型剂，如漱口水、牙膏、口腔给药、片剂、口服喷雾剂或舌下口服给药剂型。例如，漱口水可以将所需量的活性中间体放入合适的溶剂中，如硼酸钠溶液。或者活性中间体可以置于口服液中，如硼酸钠、甘油和硼酸钾，或分散于牙膏中，或加入有效剂量到含有水粘合剂、研磨剂、调味剂、浸泡剂和湿润剂的组分中。或者将组分装入片剂或置于舌下给药的溶液，或者溶于口中。其它适用于肠道给药的剂型包括栓赛剂。栓赛剂是固体制剂，有各种形状和重量，通常是插入直肠给药。插入后，栓赛剂变软，融化/溶解释放出活性液体。通常，栓赛剂可以包含0.5%-10%,更多的是1%-20%的活性中间体药物。D.非肠道药物成分和剂型更进一步，HIV-1蛋白酶抑制剂可以是非肠道给药形式。此处，"非肠道"29包括肠道旁路给药进入。具体说来，此处所指药剂组分可以通过但不仅仅限于以下方式静脉、皮内、肌内、动脉、鞘内、皮下、腹膜内，美国专利U.S.Pat.No*6，7537，514;6，613，308;5，466，468;5，543，158;5,641,515和5,399,363(每个具体案例通过参考文献完全引用)。自由基或药剂学可接受盐类活性化合物溶液可以通过在水中加入如羟丙基纤维素等表面活性剂制备。分散剂也可以在甘油、液体聚乙二醉(PEG)或两者的混合液和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制备过程包含防腐剂以阻止微生物生长。适于注射的药剂形式包括灭菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末(美国专利U.S.Pat.No.5，466，468;通过参考文献完全引用)。在所有的情形中，剂型必须是无菌且为易于注射的液体形式，在制备和储存条件下必须稳定，必须防止细菌和真菌等微生物污染。载体应可溶于或分散于含水、乙醇、醇类聚合物(如PEG，液体PEG及类似物等)以及合适的混合物，和/或植物油。保持适度的流动性，例如，利用包衣、卵磷脂，在分散过程中通过表面活性剂保持颗粒大小。加入各种抗细菌剂和抗真菌剂阻止微生物的活动，如羟基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞及类似物。许多情形下，也倾向于包括同位素制剂，如糖类或氯化汞。通过试剂组分延缓吸收，可以延长注射组分的吸收时间，如单硬脂酸铝和明胶。对于水性溶液的非肠道给药，例如，必要情况下溶液必须为合适的缓冲液，使用足量的盐或葡萄糖保持等渗。这些特殊的水溶液十分适合于静脉、肌内、鞘内和腹膜内给药。这种情形下，灭菌水溶液是该领域内经常使用的介质。例如,一份剂量溶于1ml等渗氯化钠(NaCl)溶液，加入1000ml皮下灌输或在建议的融合位点注射给药。根据注射治疗条件，可以改变剂量，对于人体来说，药剂应符合FDA生物学标准要求的无菌、热源、常规安全和纯度。将适量的活性化合物溶于适量溶剂，与上述列举的其它中间体混合，接着过滤除菌，制备无菌注射液。通常将各种无菌活性中间体置于基本分散介质的无菌载体中，并需要前面所列举的其它中间体。用于临时制备注射液的无菌粉末，使用真空干燥和冷冻干燥制备，产生从前述的其它各种药物中间体。粉末组分与液体载体(如水或盐溶液)有关联，可以包含稳定剂，也可以没有稳定剂。E.混杂的药剂学成分和剂型在本发明其它推荐方案中，活性HIV-1蛋白酶抑制剂可以设计成通过各种混杂路线给药，例如局部给药(如透皮)，粘膜给药(鼻内、阴道等)和/或吸入给药。局部给药的组分包括医学可用的活性化合物，如药膏、浆糊、奶油或粉末。药膏包括所有的油剂、吸收剂、乳剂和局部给药的水溶性成份。而奶油或洗剂只包括乳剂。局部给药制剂包含利于活性中间体穿过皮肤吸收的渗透增强剂。合适的增强剂有甘油、乙醇、二甲亚砜、吡咯垸酮和月桂氮酮。局部给药可能的基本成分包括PEG、羊毛脂、冷奶油和凡士林，还有其它合适的吸收剂、乳剂或水溶性油剂。局部制剂也包括乳化剂、凝胶制剂和必要的抗微生物防腐剂，以维持活性中间体，提供同源混合物。本发明中的透皮给药也包括使用"贴片"，例如通过贴片提供一个或多个活性化合物，在固定时间内以预定比例持续给药。在某些情形下，药剂组分可以通过滴眼液、鼻内喷洒、吸入和/或其它气体传送载体给药。组分通过鼻内喷气直接运送至肺部，参考美国专利U.S.Pat.Nos.5,756,353和5,804,212(每个具体案例通过参考文献完全引用)。类似的，使用鼻内微粒脂(Takenaga等，1998)和磷酸甘油酯(美国专利U.S.Pat.No.5,725,871,通过参考文献完全引用)也是业内十分常见的方式。同样，透过粘膜给药以聚四氟乙烯支持基质输送药物也已经在美国专利U.S.Pat.No.5,780,045种描述过。气体形式指的是可以很好的将固体颗粒分散进入液体或压縮气体中的胶质系统。本发明中典型的吸入气体制剂由液体推进剂或液体推进剂混合液和合适的溶剂。合适的推进剂有碳水化合物和碳水化合物醚类。容器根据推进剂压力要求有所不同，气体制剂给药依据主体的年龄、体重、严重程度和反应特征而不同。K.发明中的代表性试剂盒此处所描述的任何一种组分均可以组成一个试剂盒。在非限制性例子中，一种试剂盒可以包括本发明中筛选方法鉴别的HIV-1蛋白酶抑制剂和额外的试剂。试剂盒在适当的容器内，由HIV-1蛋白酶抑制剂和其它随意一个试剂组成。31试剂盒包含适当的液体HIV-1蛋白酶抑制剂，可以是液体水介质或冻干状态。容器通常至少包括药瓶、试管、长颈瓶、玻璃瓶、注射器或其它容器，组分可以置于容器内部，最好是液体形式。试剂盒多于一种组分时，通常使用第二、第三或更多的容器分开装多余组分。然而，不同组分的联合也可以置于同一药瓶内。本发明试剂盒也包括将HIV-1蛋白酶抑制剂与其它试剂包装盒绑定销售的方式，这些包装容器包括注射器或吹融塑料容器，可以保持内部成分的活性。当试剂盒组分为一种或多种溶液时，溶液可以是水性溶液，最好是无菌水溶液。HIV-1蛋白酶抑制剂组分也可以是注射用组分。这种情形下，包装容器本身可以是注射器、移液器和/或其它类似装置，使剂型可以用于机体敏感区域，注射动物，和/或甚至可与试剂盒其它成分混合使用。然而，试剂盒组分可能是干粉形式。当试剂和/或组分为干粉时，通过加入适当溶剂可以使干粉重构。将溶剂置于另一容器内同时提供的方式也是很常见的。不管容器数量和/或类型如何，本发明试剂盒也可以包含和/或包装入一种装置中，该装置用于帮助将HIV-1蛋白酶抑制剂组分注射给药和/或将组分置于动物体内。这类装置可以是注射器、移液器、钳状骨针和/或任何这类医疗许可的传递工具。具体实施例下面列出的具体实施例是为了说明本发明的优选的实施方案，但并不限于这些实施例。本领域技术人员根据具体实施例中所列举的技术内容，即发明人在现有技术的基础上做出的改进的技术内容，能够很好地实现本发明，因此，这些技术内容组成了实施本发明的优选的方式。然而，本领域的技术人员根据本发明申请文件的内容，可以在所列举的具体实施例的基础上做出一些变化，并且可以在不脱离本发明的发明精神实质和保护范围的基础上得到一些相似或等同的变形方案。实施例1本发明的标准实施方式从质粒nmtl启动子中得到的HIV-1蛋白酶基因表达后能杀死裂殖酵母，是我们在这里讨论的内容。这种杀死裂殖酵母的能力是基于对蛋白酶抑制因子的筛选，也是该项发明的一个特殊的领域。尽管通过质粒中蛋白酶基因的表达来杀死酵母的方法是首次被证实，因为相对于将一个基因整合到染色体中，转染质粒更容易操作，当然在某些方面，通过质粒的自我复制进行抑制物筛选并不是最佳的选择。与染色体相比，裂殖酵母中的质粒极不稳定，将基因整合到染色体中具有内在稳定性的优势。基因整合可以引起较多的均一表达，因为质粒复制倍数从0-30倍不等，导致质粒中基因表达水平变化幅度较大。不同于质粒基因，利用整合基因作为抑制因子筛选的明显优势是能均一水平地表达，以及潜在增强稳定性的能力。然而，整合基因进入染色体的标准操作方法事实上是引起不稳定的原因之一(Keeney和Boeke，1994)。运用标准操作方法，将同源重组基因整合到染色体时，通常是在ura4位置，整合基因两侧的nra4区域基因会进行复制(图1)。在同源重组基因复制时，很容易出现整合基因缺失的现象。因此，运用标准操作方法，从整合基因中筛选蛋白酶抑制因子时，有时会出现很髙的蛋白酶因子缺失细胞形成的菌落本底值。能髙水平表达蛋白酶基因的典型nmtl启动子会增加基因缺失的机率。nmtl启动子受维生素Bl的调控，但并不反应维生素Bl的情况。当介质中存在高浓度的维生素B时能抑制启动子的表达。相反当细胞中缺少维生素B时则启动子就进行表达。细胞从周围介质中吸收储存维生素B后，将它置于无维生素B介质中不会马上引起反应。只有通过细胞分裂使细胞内部维生素B浓度有效稀释后，才能引起nmtl启动子的髙水平表达，且至少通过四次细胞分裂(Tommasino和Maundrell，1991)。在诱导介质中nmtl启动子起作用前，要求细胞进行分裂繁殖，意味着单个细胞能长成一个微型集落。在进行抑制因子筛选时，如果集落中的一个细胞失去基因，这些细胞就会长成本底集落。在实际操作中，培养与诱导介质中的细胞基因丢失的比例有时可以髙达2%，最终导致整个菌落基因的丢失。这种髙浓度的本底菌落能干扰抑制因子的识别。为了能有效的识别抑制因子，我们研究出了一个很典型的方法，它可以快速简便地检测到基因缺失菌落。在这个方法中，我们将kan基因整合到染色体中使之与蛋白酶基因相连(图2),kan基因能使裂殖酵母在富含YE的介质中抵制G418抗生素继续生长。将设计好的kan基因整合进入nmtl基因位置33附近，选择在YE介质中能抵抗G418抗生素的转化株(图3),其余表达蛋白酶基因的菌株在诱导介质中全部凋亡。相比通常使用的ura4+和leul+基因(Keeney和Boeke,1994),使用kan基因的一优点是，在培养含整合蛋白酶基因的菌株时ura4+和leiil+两个基因标记仍然可以选择使用。大部分实验室里，实验人员在构建裂殖酵母载体时一般都使用ura4+或leul+两个标记基因来选择转化株，这两种因子都能被转染到菌株后进行筛选。然而，利用kaii基因筛选菌株的最大优势是同源重组后丢失蛋白酶基因的同时也会失去kan基因，因而对G418抗生素产生敏感(图3)。在下面将要描述的利用G418进行抗性筛选的过程里，诱导介质中蛋白酶基因缺失的本底菌落可以减少到1/105以下。成功筛选出抑制因子的频率很低，因此将本底菌落减少到低水平是一个至关重要的步骤。例证2具有整合蛋白酶基因菌落的特性描述我们对整合有蛋白酶基因的两个抗G418转化株进行了分离鉴定。蛋白酶基因髙表达的毒性作用可以从三个方面来解释。首先，将它们培养于nmtl启动子抑制性(+T)或诱导性(-T)的液体介质中时，生长率在抑制性介质中表现正常，而在诱导性介质中，两种菌株的生长都受到抑制(图4)。其次，将在抑制性介质中培养生长的细胞重新置于抑制性或诱导性介质中进行培养，发现在抑制性介质中形成正常大小的菌落，而诱导性介质中几乎不形成或形成极小的菌落(图5)。第三，将抑制性介质中生长的细胞重新置于诱导性或抑制性培养基进行培养，与不同时间点测定细胞集落形成能力。在抑制性介质培养基中，每次测量都有大于95%的细胞形成了菌落，而在诱导性介质中细胞形成集落的能力迅速下降，在切换到诱导性基质的24小时内，集落形成能力下降到小于1%。因为nmtl启动子大约在细胞培养至14-16小时时出现最强的诱导效果(Maimdrell,1993),蛋白酶基因表达出现最大效应的几个小时后，细胞就失去了生存能力。将绿色荧光蛋白(GFP)与HIV-1Vpr蛋白结合后进行的在体试验对了酵母菌落的蛋白酶活性进行了验证(图7)。绿色荧光蛋白本身能到达裂殖酵母细胞的各个部位。将GFP与Vpr蛋白熔融后，该融合物到达细胞的部位则根据Vpr蛋白的信号，结果发现大部分熔融物都以环状带或点的方式聚集在细34胞中心的核膜附近，其他部位几乎没有绿色的荧光物质出现(图9(Chen，Elder等，1999))。酶活性试验的关键步骤是在GFP与Vpr蛋白之间的蛋白酶切割位点导入一个多肽衔接物(图7)。如果该蛋白酶没有活性，那么由GFP，多肽衔接物和Vpr组成的蛋白混合物会根据Vpr的信号到达核膜附近。相反，如果该蛋白酶具有活性，那么多肽衔接物就会被剪切掉，GFP不能与Vpr有效链接后会分布在细胞的各个部位。这种特殊衔接物被酶解的在体试验表明了带有整合基因的两种菌落都具有蛋白酶活性。两个对照实验给出了预期的结果。第一个试验是GFP不受蛋白酶存在与否的影响可以定位于细胞的任何一个部位(图8)。第二个试验是当GFP与Vpr蛋白之间没有衔接物时，蛋白酶不影响GFP-Vpr熔融物到达细胞核膜位置，这样蛋白酶就无法剪切而释放出GFP(图9)。然而，当GFP与Vpr蛋白之间存在一个像细胞间质蛋白与HIV-1衣壳蛋白结合点处的经典酶切位点时，则该蛋白酶的存在会使GFP的定位出现很大的变化(图10)。如不存在该蛋白酶，那么GFP-SLMA-Vpr到达核膜位置，当该蛋白酶基因表达后，被剪切而释放出的GFP就会到达细胞的各个部位，此时大部分的细胞核都会失去标记。同样，当GFP与Vpr蛋白之间若存在p6与HIV-1(Diiiiii，Goodenow等，2002)蛋白酶的酶切位点时，该蛋白酶的表达会使GFP的核膜定位转变为整个细胞的定位(图11)。这个对比实验表明GFP与Vpr蛋白之间的衔接物必须存在一个酶切位点才能发生重新定位。如果衔接物中不存在已知的HIV-1蛋白酶切位点，而存在一个炭疽致死因子(Cummings，Salowe等，2002)的酶切位点，贝ljGFP-SLA-Vpr结合蛋白在蛋白酶表达前后都定位在核膜位置(图12)。GFP定位可以用于酶活性的半定量实验，也可以用于带有整合蛋白酶基因的两种菌落之间的对比试验。对整合有蛋白酶基因的两种菌落的生长特征进行比较时发现，第一种菌落(命名为PrliitA或RE294)的生长抑制现象比第二种菌落(命名PrlntB或RE295)更明显。当nmtl启动子被抑制(+T)后两种菌落生长都表现正常时，PrliitA菌落在诱导性介质中(-T)基本上停止了生长，而PrliitB菌落在同样介质中生长速率减缓。生长率出现明显变化的效应表明了PrlntA菌落表达了高水平的蛋白酶，同时两种菌落之间整合基因进入染色体的不同方式也从另一个角度解释了PrlntA菌落中酶基因的高表达现象。将单拷贝的蛋白酶基因整合到nmtl位点，交叉点的不同导致两种菌落35中nmtl启动子的小片段序列出现差异(图14)。转染iimtl表达载体后，nmtl启动子上的Ndel限制位点被切除并插入cDNA(Maundrell,1993)。这种没有Ndel限制位点的iuntl启动子突变体可以用于整合蛋白酶基因，发生重组同源基因整合的染色体具有与Ndel限制位相似的原生型序列。同源重组基因插入的具体位点决定了nmtl启动子表达的蛋白酶为原生序列或突变体序列。研究发现PrIntA菌落中nmtl启动子表达的蛋白酶基因为Ndel限制位点原生序列，而PrlntB菌落中表达的是突变序列(图14)。nmtl启动子的调节序列包括了Ndel限制位点序列(Zurlinden和Schweingruber,1997),可能PrIntA菌落中就是这种原生型序列导致了蛋白酶的髙水平表达以及强烈的生长抑制现象。GFP-SLMA-Vpr中GFP重新定位的程度也表明了PrIntA菌落中蛋白酶的活性高于PrlntB菌落。当细胞中出现GFP-SLMA-Vpr时，通过测定荧光可以反应GFP的分布状况，或者分布于整个细胞中，或根据Vpr信号分布于细胞核膜表面。在测定中细胞分别被计数为GFP型和Vpr型。也有一些介于中间的细胞，它们在核膜及整个细胞都检测到绿色荧光，这些细胞就被计数为Vpr型。根据这个规则，当细胞没有蛋白酶活性时，几乎所有的GFP都聚集在核膜表面，即GFP分布型细胞为0%。PrIntA菌落中整合基因表达时，大约84%的细胞为GFP分布型(图10-15)。而PrlntB菌落只有47%的细胞为GFP型。这样在诱导性介质中的生长率和GFP型细胞的比例同时表明了PrlntB中的酶活性低于PrIntA菌落。蛋白拮抗剂药物印地那韦阐述了一个蛋白酶活性抑制剂如何影响PrIntA菌落，它同时可以用于酶抑制物的筛选。蛋白酶抑制剂是治疗HIV感染的最有效的一类药物，印地那韦是其中一个药物。这些药物竞争性地与酶活性中心结合(Randolph和DeGoey,2004)。用印地那韦治疗PrIntA,则诱导产生蛋白酶基因的效应降低。在-T介质中诱导产生蛋白酶基因后，12.5jig/ml浓度的印地那韦能增加生长速率，切换到-T介质中后大约25小时生长速度达到最大值，接近于不能诱导产生蛋白酶基因的+T介质中的繁殖速度(图16)。GFP-SLMA-Vpr结合物中绿色荧光分布现象中也可以反应抑制剂的酶活性抑制现象。大多数没有经过处理的细胞具有GFP型分布，随着印地那韦浓度的增加，Vpr型细胞频繁地出现(图17)。统计细胞的分布类型，随着印地那韦浓度的增加，GFP型细胞的数目逐渐减少(图18),当浓度达到最髙的200jig/ml36时，已仅有极少部分的细胞为GFP型。印地那韦的实验直接表明了PrlntA菌落可以用于酶抑制剂的筛选。筛选过程的基本思路如下抑制因子能够使PrIntA在诱导型培养基中形成菌落，而正常表达的蛋白酶毒性作用能影响生成正常大小的集落。分别将500个细胞培养与诱导型和抑制型介质中，5天后，抑制型介质中大部分的细胞长成了集落，而诱导型介质中几乎没有或只形成了很小的聚落(图19)。(玻片19中由于蛋白酶基因缺失导致的两个较大的集落将在以下内容中介绍)。将印地那韦加入到诱导型介质中即形成了集落，加入髙浓度的印地那韦后形成的集落大小与抑制型介质培养基中形成的集落大小相似。例证3通过降低本底值进行抑制物筛选试验之前已经阐述PrlntA菌落可以用于抑制物的筛选，为使筛选过程中本底降低到最小值进行了本试验。诱导型介质中一些本底细胞因为同源基因重组后丢失了蛋白酶基因而长成了集落，而最近研究出来的一个三步法程序可以消除失去蛋白酶基因的本底细胞。这种三步法操作是一个很经典的抑制物筛选过程，试验也证明了它可以消除本底的影响，该操作包括1)将细胞与诱导型介质中进行培养；2)复制后进行G418抗性筛选试验；3)在诱导介质条件下检査抗G418细胞所形成集落的生长状况。应用这个三步骤操作法对RE294进行了研究后发现抑制蛋白酶基因的本底细胞形成集落的能力小于1/106。首先，将在抑制型介质中培养长成的载体携带的PrlntA细胞切换到诱导型介质中(-T)进行培养。由于蛋白酶基因的表达，大部分的细胞死亡，大约1/1000的细胞长成了集落(图20)。看上去似乎大部分甚至所有的集落都是由同源重组基因与启动子重复交叉引起的蛋白酶基因缺失细胞所形成的，通过这种方式失去蛋白酶基因还回导致kaii基因的缺失(图3)。含Kaii基因的裂殖酵母细胞能抵抗G418抗生素，将诱导型基质复制到含G418基质培养基进行培养即可鉴定是否存在kan基因。同时也将诱导型基质转移到不含G418抗生素的YE介质中作为对照实验。在该对照实验中，与初始介质中相似，所有的集落都长成同一类型细胞的集落。相反，从诱导型基质转移到G418培养板上的集落，大部分都停止了生长(FIG.21)，表明大多数的细胞都失去了kan基因，而这些集落在诱导介质中的生长主要由蛋白酶基因的缺失引起。然而，G418复制板上大约只有1%的集落在生长(其中两个在图21中可见)。进一步研究发现，这些集落事实上不是因为酶的抑制作用，由于在诱导介质中各种不同的混合细胞形成集落而停止了生长。对这些抗G418集落在诱导培养板中进行重新试验后，它们全部停止了生长，而在对照实验中，这些菌落中似乎保留有蛋白酶基因且对该基因的表达仍然具有敏感性(图22)。从G418抗生素筛选的细胞长成的两种对比菌落在丢失蛋白酶基因后生长较好(图22上)，PrlntA细菌在G418培养的初始阶段，只有一小部分失去蛋白酶基因的细胞长成了少数几个比较大的集落(图23周边)，大部分的细胞停止生长。将从G418抗生素筛选的生长型集落培养与诱导介质中进行再次检测时，大部分的细胞与PrlntA细菌在G418中的初始行为一致，即没有长成正常大小的集落(图22的其余六个部分)。G418r蛋白与G418s蛋白细胞的混合物同时存在，是形成这种在初始诱导介质中生长集落加入G418进行抗性筛选后，细胞即停止生长的对立现象的主要原因。细胞在原始诱导基质中长成集落时，失去蛋白酶基因和kanr基因的细胞很快就长成无G418蛋白细胞的集落。但集落中的一部分细胞会仍然含有G418r蛋白。将该基质复制到富含维生素B的G418培养板上，因为维生素能够抑制蛋白酶基因的表达，少数的G418r蛋白细胞就长成了集落，无G418蛋白的细胞则被抗生素杀死。在图22中可以看出G418复制板上的集落细胞培养与诱导介质中即停止了生长。在从PrlntA载体筛选抑制物的实验中，将大于106个细胞培养与诱导介质中，将这些介质复制到含G418培养基中，然后在诱导介质中对集落细胞再次进行抗生素筛选。在完成了这三个步骤的筛选后，对G418抗生素产生抗性的集落即被分离出来(图23)。这个结果表明在三个步骤的筛选过程中，在本底达到最小时，仍然可以对极少数的蛋白抑制物进行分离。例证4裂殖酵母染色体库的筛选实验在这个经典的筛选质粒库的过程中，有一些本底集落透过了这三个步骤(图20),但是这些微量的集落对质粒抑制物的分离和筛选不会产生多大的影响。另外，对筛选过程中质粒的丢失增加一个实验步骤可以提髙实验的可靠性，但前提需要有效区地分本底菌落与带有靶标抑制质粒的菌落。实验中用到的裂秩酵母染色体组由带有ura4基因的pUR18载体携带(Barbet，Muriel等，1992)。在对pUR18载体质粒进行蛋白酶抑制物筛选的过程中，每个细胞有5-10个质粒发生过表达现象；在-T基质中能生长的抗G418细胞是抑制质粒筛选的目标细胞，在一些特殊的情况下，检测在-T介质中的生长情况可以有效地排出少数一些质粒丢失的细胞的影响。质粒中的基因整合到细胞基因库中后，平均每个细胞可以复制到5-10倍以上。PrlntA被转染到基因库中，在一个抑制板上选择大约40000ura4+基因来抑制蛋白酶基因的表达。被转染后的细胞被重新培养与诱导介质中进行第三个步骤的筛选。在对转染体的筛选过程中我们分离了两种能强烈抑制蛋白酶的菌落，但进一步分析后发现，这两种菌落都含有该蛋白酶的突变基因。这两种菌落在含G418的介质中生长良好，而在诱导介质中恰好与pUR18载体质粒转染的PrIntA菌落形成了对比，带有转染质粒的PrlntA菌落在G418基质中生长也较好，而在诱导介质中则大部分的细胞停止生长。这两种菌落似乎是很好的pUR18载体酶抑制质粒的携带者，一旦该质粒丢失后，在诱导介质中这两种菌落还会持续生长(图25)。pUR18基因库中得到的质粒在裂殖酵母中稳定性较差，在不能对质粒进行筛选的富含尿嘧啶介质中生长后，一些细胞就会丢失质粒后停止生长，并且只有在添加尿嘧啶的条件下才能继续生长。图25中最上面的培养板中对无选择性培养基中生长的单个集落进行了检测，在不添加尿嘧啶的条件下通过观察该菌落能不能生长来确定是否含有质粒(带有ura4基因的pUR18载体质粒)。上面两部分的菌落停止了生长表明该菌落丢失了质粒，相反，其余保持生长的四个部分表明质粒没有丢失。将同样的单个菌落置于添加了尿嘧啶的抑制性介质中进行检测时(图25左下部分)，所有六个菌落生长状况与预期一致，而在诱导介质中生长也同样的好(图25的右下部分)。这些实验表明了这些菌落中的质粒不携带抑制物。在这个筛选过程中我们还发现了具有相同性质的第二种菌落。我们对这两种不含有抑制物质粒菌落中的蛋白酶基因进行了PCR扩增测序。两个菌落中的蛋白酶基因都存在第18个密码子后的氨基酸转位突变现象(图26),这种突变可以引起酶的失活。两个转位突变都发生在原始密码子16-17区域的6G部位，一个多了一个鸟嘌呤，另一个则少了一个鸟嘌呤。同区域的两种转位突变同时发生表明了6G是发生突变频率较髙的区域。另外，酶基因发生自然突变的频率就是最小的本底值，在筛选过程中可以检测到，对两种自然突变物进行分离后，整个筛选过程就达到了最小本底值。将在筛选过39程丢失的质粒混合后，本底达到最小以至于在整个基因库筛选过程中仅发现一个假阳性(在以下内容中介绍)。在筛选抑制性质粒过程中涉及到的本底值如下在筛选3X105个细胞时，只发现两个抗G418菌落在-T中有很强的生长能力，这种强的生长能力不需要质粒，且蛋白酶基因中都存在密码移位突变，仅有的一个假阳性菌落在-T介质中生长能力较弱，在酵母中检测发现从该假阳性菌落中分离得到的质粒不具有抑制能力。例证五典型的质粒抑制因子携带有HHP2基因在完成通过质粒筛选抑制物后，我们分离了11种具有抑制作用的菌落，图27显示了对其中6个弱抑制剂从G418复制到诱导介质中的复筛选过程(分别标记为PS3，PS4，PS5，PS6和PS7)。这六个抑制菌落在G418(顶部培养皿)和抑制性培养皿(左边底部培养皿)中生长较好，而在诱导型培养皿(右边底部)生长较缓慢，不同于一般的3-4天，在培养六天后才长到中等大小的集落。图28中PS4的质粒丢失表明了这些弱蛋白酶抑制剂的抑制能力主要取决于其中的质粒。PS4在无选择性培养基中生长后形成的四个单集落被分别标记为PS4-1,PS4-2，PS4-3和PS4-4，在选择性基质中对这四个单集落的质粒进行了分析(顶部培养皿)，其中PS4-1和PS4-2失去了质粒，其余两个仍保留着质粒。这四个集落都生长在抑制性培养皿的左边底部位置，其中带有质粒的PS4-3和PS4-4在诱导介质中长成了许多集落，而大部分不带质粒的PS4-1和PS4-2细胞停止了生长。为了确认这11种菌落的质粒中存在抑制因子，利用这些菌落制备DNA用于E.coli的转染，氨苄青霉素抗性筛选后回收质粒。质粒上携带的抑制因子经最后确认后，将回收的质粒重新转染到PrliitA,然后重新测定其抑制能力。在E.coli中回收PS2和PS3两种酵母抑制菌株中pPS3-2和pPS4-10质粒，检测两种PrlntA转染体。pPS3-2质粒不是蛋白酶抑制因子，因为两个转染体的生长现象与pUR18载体一致(图29)。pPS3是通过所有筛选步骤的唯一一个带有质粒的菌落，但是将其中的质粒回收并重新转染到PrliitA后，检测后不具抑制活性。对于pPS4-10质粒，两个转染体在诱导介质中生长状况都比pUR18载体及pPS3-2质粒转染体好(图29)。表明pPS4-10质粒带有较弱活性的抑制因子。从弱抑制性酵母菌落中回收的其他九个质粒在诱导介质中也有40一定的生长现象(图30)。将pPS3-2质粒与pUR18载体导入后24小时时测定其平板效率只有0.4%左右，而其他十个回收的质粒转染体的平板效率达能达到7%(图31)。对这十个抑制性质粒中插入基因末端的600个核苷酸进行了测序，发现它们只携带有hhp2基因(图32)。十个质粒都有完整的hhp2开放读码框(ORF),而邻近部位的基因都没有ORF。从基因库中筛选的40000个转染体中得到的这十个hhp2质粒，我们分离了六个不同的质粒，他们都来自于不同的转染体。多次分离到同一个质粒的三种情况都是因为来源于同一个转染池或对同一个转染体进行了重复分离。所有的弱抑制性质粒都包含hhp2基因十个弱抑制菌落通过了质粒丢失筛选的所有步骤，将这些菌落中分离得到的质粒重新转染到裂殖酵母后检测发现都有较弱的抑制活性，它们只带有hhp2基因；这十个质粒包含了六个不同的hhp2质粒。因为hhp2是从六个不同的转染池中分离得到的，而且也没有检测到其他的基因，推测hhp2基因是pUR18基因库中唯一一个能抑制蛋白酶活性的在筛选目的基因。在酶抑制因子筛选过程中我们没有发现hhpl基因。hhpl和hhp2基因序列非常相似(74%相一致)，且具有部分重叠功能(Dhillon和Hoekstra,1994、对hhp2基因的鉴定排除了具有抑制活性的可能性。酶的高水平表达会对酵母产生毒性，因为酵母中的一个必需蛋白被这种酶分解消化低至一定浓度后，细胞就会失去生存能力。在这个模型中，如果细胞能够合成足够多的必需蛋白，就能降低毒副作用。但是这个模型并不是用于hhp2,因为hhp2基因缺失的菌落仍然具有很好的生存能力(Dhillon和Hoekstra,1994)。不能将其它抑制基因进行分离的原因可能是该蛋白酶同时作用于多个必须蛋白，或在交替的过程中存在其它的毒性机制。hhp2抑制蛋白酶的具体机制还要进一步进行研究。hhp2激酶属于CK1族激酶(Dhilloii和Hoekstra1994),目前对于这类激酶与HIV-1蛋白酶之间的相互作用机制没有相关的报道。我们在本专利中介绍了该类hhp2激活酶抑制蛋白酶表达的机制。第一种是hhp2通过磷酸化途径抑制蛋白酶的表达。在另一种具体的过程中，该激酶没有将蛋白酶磷酸化，而hhp2作为一种竞争性的拮抗剂被蛋白酶分解。在该项发明专利中我们确认了hhp2是否通过一种新的途径来抑制HIV-1蛋白酶。41对于hhp2的证实直接表明了我们所发明的筛选过程是一个非常有效的筛选抑制因子的过程。Hhp2是裂殖酵母5000个基因中的其中一个基因(Wood,Gwilliam等，2002),而我们的筛选过程能够从六个不同的质粒中找到这个基因。表明这种经典的筛选过程可以用于表达更多蛋白质和肽化合物的基因库里蛋白酶抑制因子的筛选。参考文献下面所列出的所有专利、专利申请以及公开发表过的文献资料表明了本发明领域的相关技术人员所具有的知识和技能水平。这些专利、专利申请以及公开发表过的文献资料在此引入本文作为参考。专利和专利申请美国专利申请号5,384,253美国专利申请号5,399,363美国专利申请号5,466,468美国专利申请号5,543,158美国专利申请号5,580,579美国专利申请号5,629,001美国专利申请号5,641,515美国专利申请号5,725,871美国专利申请号5,756,353美国专利申请号5,780,045美国专利申请号5,804,212美国专利申请号5,792,451美国专利申请号6,043,357美国专利申请号6,613,308依法注册的发明Hl，649公开发表的文献资料Barbet，N.，W.J.Muriel,etal.(1992》"VersatileshuttlevectorsandgenomiclibrariesforusewithSchizosaccharomycespombe."Gene114(1):59-66-Chen，M.，R.T.Elder,etal(1999)."MutationalanalysisofVpr-inducedG2arrest,nuclearlocalization,andcelldeathinfissionyease."JVirol73(4):3236-45，Cummings,R.T.，S.P.Salowe,etal.(2002)."Apeptide-basedfluorescenceresonanceresonanceenergytransferassayforBacillusanthracislethalfactorprotease."ProcNatlAcadSciUSA99(10):6603-6.Dhillon,N.andM.F.Hoekstra(1994)."CharacterizationoftwoproteinkinasesfromSchizosaccharomycespombeinvolvedintheregulationofDNArepair."EmboJ13(12):2777-88.Dunn,B.M.，M.M.Goodenow，etal.(2002)."Retroviralproteases."GenomeBiol3(4):REVIEWS3006.Keeney，J.B.andJ.D.Boeke(1994)."EfficienttargetedintegrationatIeul-32andura4-294inSchizosaccharomycespombe."Genetics136(3):849-56.Maundrell,K.(1993)."曙Thiamine-repressibleexpressionvectorspREPandpRIPforfissionyeast."Gene123(l):127-30.Randolph,J.T.andD.A.DeGoey(2004)."PeptidomimeticinhibitorsofHIVprotease."CurrTopMedChem4(10):1079-95.Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.MackPrintingCompany,1990.Tommasino，M.andK.Maundrell(1991)."UptakeofthiaminebySchizosaccharomycespombeanditseffectasatranscriptionalregulatorofthiamine-sensitivegenes."CurrGenet20(l-2):63-6.Wlodawer，A.andA.Gustchina(2000)."Structuralandbiochemicalstudiesofretroviralproteasesl"BiochimBiophysActa1477(l):16-34.Wood,V.，R.Gwilliam，etal.(2002)."ThegenomesequenceofSchizosaccharomycespombe."Nature415(6874):871-80.Zurlinden,A.andM.E.Schweingruber(1997)."IdentificationofaDNAelementinthefissionyeastSchizosaccharomycespombenmtl(thi3)promoterinvolvedinthiamine-regulatedgeneexpression."JBacteriol179(18"5956-8-43虽然上文中已经详细描述本发明的技术方案以及技术进步，本领域技术人员可以在不脱离本发明的发明精神实质和本发明权利要求书所确定的保护范围的基础上做出一些改变、替换、变更。此外，所给出的实施范围不限于说明书中所列出的过程、设备、结构、物质组成、方法、步骤的具体实施方式。从本发明申请文件公开的内容、现有技术中已经存在的和随后将发展的技术如过程、设备、结构、物质组成、方法、步骤，任何一个本领域技术人员可以完全实现与本发明相应的实施方案相同的功能或者达到完全相同的技术效果。因此，权利要求书的作用在于确定要保护的过程、设备、结构、物质组成、方法、步骤的保护范围。权利要求1、一种鉴别HIV蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤首先提供一种酵母细胞，所述的酵母细胞内包含有由编码HIV蛋白酶的基因序列组成的多聚核苷酸；然后将所述的多聚核苷酸置入候选试剂中；再评估以下的其中一项或两项指标1)所述的酵母细胞的细胞活性和/或生长情况；其中，与缺少候选试剂的情况下的细胞进行对比，在所述的候选试剂存在的情况下细胞能够存活的，所述的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂；2)HIV蛋白酶底物的酶切效果，其中能够阻止底物被酶切的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶是HIV—1蛋白酶。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶是HIV—2蛋白酶。4、根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶的表达受到过表达调控序列的调节。5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制剂为多肽、多聚核苷酸、小分子、抗体，或者以上多种物质的混合物或组合物。6、根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的酵母为裂殖酵母。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的裂殖酵母为粟酒裂殖酵母。8、根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的多聚核苷酸被整合到酵母基因组中。9、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的过表达调控序列为nrnll过表达调控序列、adhl调控序列、fbpl调控序列、invl调控序列或ctr4调控序列。10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的多聚核苷酸中包含有至少一个能够在细胞活性测试中减少背景生长信号的片段。11、根据权利要求IO所述的方法，其特征在于所述的能够减少背景生长信号的片段为标记物。12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的标记物为对抗生素具有抗性的标记物。13、根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的标记物为对G418或潮霉素具有抗性的标记物。14、根据权利要求ll所述的方法，其特征在于所述的标记物为营养标记物。15、根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的标记物选自adel、ade6、arg3、CAN1、his3、his7、leul、leu2、sup3-5、ura3和ura3。16、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶为人HIV蛋白酶。17、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶底物为人HIV蛋白酶底物。18、根据权利要求1所述的方法，其特征在于评估HIV蛋白酶底物的酶切效果可以为评估由第一多肽片段和第二多肽片段组成多肽的酶切效果，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于所述的第一多肽片段和第二多肽片段之间。19、根据权利要求18所述的方法，其特征在于第一多肽片段中为可探测的标记。20、根据权利要求18所述的方法，其特征在于第二多肽片段为HIV蛋白酶的底物。21、根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶的底物为HIV-1Vpr多肽。22、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶底物的酶切位点可以为DSQNYPIVQ(SEQIDNO:3)、DSFNSTQIT(SEQIDNO:4)、VSQNYPIVQN(SEQIDNO:8)、KARVLAEAMS(SEQIDNO:9)、SATIMMQRGN(SEQIDNO:10)、RPGNFLQSRP(SEQIDNO:ll)、VSPNFPQITL(SEQIDNO:12)、CTLNFPISPI(SEQIDNO:13)、GAETFYVDG(SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(SEQIDNO:15)。23、根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述的可探测的标记为绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白。24、根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法还进一步包括将治疗有效剂量的所述抑制剂输送到感染HIV病毒或者患有AIDS的个体的步骤。25、根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法还进一步包括将有效剂量的所述抑制剂输送到可能感染HIV病毒或可能患上AIDS的个体来作为预防的步骤。26、治疗感染了HIV病毒或者患有AIDS的个体的方法，该方法包括将治疗有效剂量的包含有hhp2的药物组合物输送到所述的个体的步骤。27、根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述的hhp2为多肽。28、根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述的hhp2为编码hhp2多肽的多聚核苷酸。29、一种酵母细胞，其特征在于该酵母细胞内包含有由编码HIV蛋白酶的基因序列组成的多聚核苷酸。30、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的HIV蛋白酶为HIV-1蛋白酶。31、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的HIV蛋白酶为HIV-2蛋白酶。32、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的多聚核苷酸的表达受到过表达调控序列的调节。33、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的多聚核苷酸优选标记物。34、根据权利要求33所述的酵母细胞，其特征在于所述的标记物优选对抗生素具有抗性的标记物。35、根据权利要求33所述的酵母细胞，其特征在于所述的标记物优选营养标记物。36、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的酵母细胞内包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。37、根据权利要求36所述的酵母细胞，其特征在于所述的第一多肽片段为可探测的标记。38、根据权利要求37所述的酵母细胞，其特征在于所述的可探测的标记为绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白。39、根据权利要求36所述的酵母细胞，其特征在于所述的第二多肽片段为HIV-1Vpr多肽。40、根据权利要求29所述的酵母细胞，其特征在于所述的酵母细胞可以为酵母细胞培养物或者酵母细胞集落。41、一种治疗和/或预防感染HIV和/或患上AIDS的药物组合物试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有装在合适的容器中的编码hhp2的多聚核苷酸或hhp2多肽。42、根据权利要求41所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含有药学上可以接受的赋型剂。43、一种用于筛选一个或多个HIV蛋白酶抑制剂的试剂盒，该试剂盒包含有权利要求29中所述的酵母细胞。44、根据权利要求43所述的试剂盒，其特征在于所述的酵母细胞内还包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。全文摘要本发明涉及一种鉴别蛋白酶抑制剂的酵母筛选方法，特别涉及HIV-1蛋白酶和/或HIV-2蛋白酶抑制剂的酵母筛选方法。例如，若在粟酒裂殖酵母中，HIV-1蛋白酶过量表达会导致细胞死亡，但是当存在具有蛋白酶抑制活性的候选抑制剂时，细胞能够存活，这一发现为发明鉴别蛋白酶抑制剂的方法提供了基础。更具体地，本发明提供了体内蛋白酶活性检测方法，如利用HIV-1蛋白酶特异性酶切位点，这一方法可以与细胞活性测定方法联合使用、也可以替代细胞活性测定方法单独使用来鉴别蛋白酶抑制剂。更进一步地，还可以利用筛选出来的抑制剂来治疗感染HIV病毒或者患有AIDS的病人。文档编号C12Q1/37GK101501210SQ200780029436公开日2009年8月5日申请日期2007年6月8日优先权日2006年6月9日发明者罗伯特·T·艾德,赵玉琪申请人:苏州圣诺生物医药技术有限公司