用于生长因子多相释放的体系和方法
用于生长因子多相释放的体系和方法
【专利摘要】一种用于至少一种生长因子在处理部位的多相递送的体系，包括用于以最初释放模式来释放至少一种生长因子的递送载剂，和用于以持续释放模式来释放至少一种生长因子的载体。最初释放模式在数小时至数天的时间段内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子最初大量释放，剩余物以逐渐降低的量释放。持续释放模式在数天至数周的时间段内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子在该时间段内以通常恒定的量进行释放。本发明的体系特别适合应用于生物植入物。本发明还包括用于至少一种生长因子的多相递送的方法和试剂盒。本发明还包括硫酸钙作为用于在单相和多相体系两者中释放至少一种生长因子的载体，用于在处理部位处递送至少一种生长因子。
【专利说明】用于生长因子多相释放的体系和方法
[0001] 在先申请的夺叉引用
[0002] 本申请是于2012年4月11日提交的PCT/CA2012/050234的部分继续申请，所述 PCT申请根据巴黎公约要求于2011年4月11日提交的美国申请61/474, 049号的优先权， 各申请的全部内容通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及用于释放生物物质的体系和方法。特别地，本发明涉及与生物植入物 相关联的生长因子的释放。更特别地，本发明提供一种用于产生至少一种生长因子的多相 释放模式以改善生物植入物性能的体系和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 生长因子（GF)是通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/ 或分化的肽和蛋白质。生长因子在组织的修复和再生中起着不可或缺的作用，GF的外源性 应用可以用于刺激包括骨、软骨、皮肤和粘膜在内的各种组织和器官的修复，以及用于通过 在修复部位刺激血管再生而增强组织的修复。
[0006] 哺乳动物中所分泌的生长分化因子的转化生长因子β (TGFi3)超家族有超过30 个成员。这些二聚蛋白质的特征在于保守的以七个胱氨酸结为基础的结构。它们调节许多 细胞类型的增殖、分化和迁移，并在形态发生、器官发生、组织维护和创伤愈合方面具有重 要作用。生长因子的TGFii超家族可以细分为几个亚家族，包括转化生长因子β亚家族、 骨形态发生蛋白（BMP)和生长分化因子（GDF)家族（也称作BMP亚家族），以及抑制素和激 活素亚家族。
[0007] TGF β超家族的BMP亚家族包含至少二十种蛋白质，包括BMP-2、BMP-3 (也被称为 成骨素）、BMP-3b (也被称为生长分化因子10,⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也被 称为成骨蛋白-I，0P-1)、BMP-8 (也被称为成骨蛋白-2, 0P-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-11 (也 被称为生长分化因子-8,⑶F-8,或者肌生长抑制蛋白）、BMP-12(也被称为生长分化因子 7,⑶F-7)、BMP-13 (也被称为生长分化因子6,⑶F-6)、BMP-14 (也被称为生长分化因子5， GDF-5)和 BMP_15(关于综述，参见例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs 2001; 10: 1677-1686)。
[0008] BMP已经显示出在成软骨细胞中刺激基质合成；在成骨细胞中刺激碱性磷酸酶活 性和胶原蛋白合成，诱导早期间质祖细胞分化为成骨原细胞（骨诱导），调节单核细胞和间 质细胞的趋化性，以及调节神经细胞的分化（关于综述，参见例如Azari等，Expert Opin Invest Drugs 2001 ; 10 :1677-1686 和 Hoffman 等，Appl. Microbiol. Biotech 2001 ;57: 294-308)。
[0009] BMP蛋白质的许多功能之一是在脊椎动物中诱导软骨、骨和结缔组织的形成。BMP 亚家族最具有骨诱导能力的成员是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (参见例如 Hoffman 等，Appl. Microbiol Biotech 2001 ;57-294_308;Yeh 等，J Cellular Biochem., 2005 ;95-173-188 ;和 Boden，Orthopaedic Nursing 2005,24 :49-52)。已经长期认为 BMP 的这种骨诱导能力对于各种治疗和临床应用非常有前景，所述治疗和临床应用包括骨折修 复；脊柱融合；骨骼疾病的治疗，头骨、下颌骨和骨缺损的再生；以及在口腔和牙科应用中 非常有前景，例如在牙周创伤再生期间的牙齿发生和牙骨质发生、拔牙窝植入、牙槽嵴增高 和上颌窦增高。目前，由美敦力（Medtronic)以INFUSE?^I售的重组人类BMP-2被FDA 批准用于脊柱融合手术，用于骨折不愈合的修复以及用于口腔手术，而由史赛克（Stryker) 以OP- 1?销售的重组人类BMP-7被批准作为顽固的长骨不愈合中自体植入的替代，以及用 于后外侧（横突间）腰椎融合的翻修术，其中自体植入和骨髓收获是不可行的，或者预期不 会促进融合。
[0010] 已经外源地用于增强骨修复的其他重组生长因子包括各种TGFP (参见 Clokie&Bell，J. Craniofacial Surg. 2003,14 :268-77)、成纤维细胞生长因子超家族（FGF) 的成员（参见Kawaguchi 等，（2007) J. Orthopaedic Res. 25(4) :480-487)、血小板衍生生长 因子超家族（PDGF)的成员（参见Hollinger等，2008JBJS90 (si) :48-54)和血管内皮细胞 生长因子（VEGF)(参见 Street 等，2002PNAS99:9656-61)。
[0011] 为了使这些生长因子有效，它们在修复部位存在适当的应答细胞的临界密度时， 必须是活性的并且可获得足够的浓度。GF的短的半衰期、热不稳定性、对蛋白酶敏感和/或 溶解性要求它们与载体组合施用，以满足该要求。
[0012] 已经对用于GF递送的大量载体进行了评价。这些载体包括纤维胶原海绵，明胶 水凝胶，纤维蛋白凝胶，肝素，反相聚合物（例如泊洛沙姆），由聚乳酸（PLA)、聚羟基乙酸 (PGA)或其共聚物（PLGA)构成的载体，肝素缀合的PLGA载体和无机材料例如磷酸钙。例 如，用于牙周再生的生物植入物（GEM-.21S?)使用β-磷酸三钙（β-TCP)作为rhH)GF-BB 的载体（参见 http://www. osteohealth. com/GEM21S. aspx)。
[0013] 然而，这些载体具有有限的效力，这是因为当与载体相关联时生长因子活性的损 失，GF在植入部位无效率的释放，和/或对蛋白质水解和降解差的防护。例如，生物植入物 Infuse?使用I型胶原海绵作为rhBMP-2的载体。rhBMP-2从载体突然释放，BMP在创伤 部位内的半衰期为 1 至 3 天（Winn 等，1998，Adv. Drug Del. Rev. 31 :303 ;Friess 等，1999， Inti. J. Pharm.，187 :91)。到使骨再生的间充质干细胞迁移进入创伤部位的时候，仅所负载 的BMP初始量百分比的一部分存在以刺激这些细胞制造骨。目前用于确保在这些稍后的时 间内保持有效水平的BMP的解决方案是显著地增加最初负载的BMP的量。这些增加的剂量 增加并发症的风险，所述并发症包括远离植入部位的骨形成、自身免疫应答和可能的癌症。 另外,这急剧地增加了植入的成本。
[0014] 因此，本领域中存在对以一定模式释放生长因子的材料和方法的需求，所述模式 最小化实现要求的治疗效果所需要负载的生长因子的量。
[0015] 一种策略是将GF包封在生物可降解的聚合物基体中，所述生物可降解的聚合物 基体以持续释放模式释放GF许多天。例如，BMP已经与聚乳酸（PLA)或乳酸-羟基乙酸共 聚物（PLGA)结合以产生持续释放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP会使BMP变性，从 而降低其活性，并且难以控制释放模式以优化生物植入物的效力。另外，这些载体的降解速 率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。因此，需要将大量GF负载到这些聚合 物中以确保在合适的时间存在充足的GF。
[0016] 另一种策略是将GF以化学方法直接固定到载体的表面上。然而，这可能导致GF 的活性部分或全部损失，并且可能限制GF的活性使得只有直接与载体接触的那些细胞才 能够与 GF 相互作用并应答（参见 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials，2006,27: 4547-56)，由于效果会受限于与载体的直接界面处而不遍及创伤部位，因此这会是不期望 的。
[0017] 载体的组成可以影响GF的递送。已经考虑硫酸钙期望作为骨替代物和GF载体， 这是因为其是骨传导的、生物可降解的、生物相容的和无毒的（Chen等，J. Craniofacial Surg.，2010, 21 :188-197)。然而，还已知硫酸钙原位添加到骨时具有快速的降解速率，并且 几乎没有骨诱导能力，这限制了其在骨植入物中的有效性。
[0018] -种对付硫酸钙原位降解的策略是通过改变晶体结构和向硫酸钙植入物混合物 中添加聚合物（例如壳聚糖）来控制降解速率（Chen等，同上）。已经浸渍有BMP的聚合 物包覆的硫酸钙丸粒可以降低硫酸钙再吸收的速度，并增加混合物的压缩强度和骨诱导 (Chen等，同上）。
[0019] 含有羟磷灰石（HAp，骨的主要矿物质组分）和硫酸钙半水合物（CSH，熟石膏） 的复合材料已经在整形外科植入中使用（例如，Damien, C等，J. Biomed. Mat. Res.，1990， 24 :639-654 ;Damien, C 等，Spine，2002,16S :S50-S58 ;Parsons，J.等，Annals Ν·Υ· Acad. Sci.)。当CSH与无菌生理盐水或水混合时，其立即开始胶化。然而在凝胶状态下，HAp、生 长因子和/或各种基体组分可以与CSH混合到一起以形成植入复合材料，其可以插入或注 入到骨缺损中，在该骨缺损处其原位凝固。在这类方法中，CSH首先作为黏合剂。然而，之 后的硫酸钙再吸收为骨长入留下具有空间的多孔基体，该骨长入可以通过已变硬的复合材 料中的生长因子来刺激。相似地，用于递送成骨蛋白的包含CSH、多孔微粒聚合物混合物和 成骨蛋白的组合物是已知的（美国专利5, 385, 887和美国专利申请公布2008/0233165号， 其中每个都通过引用如同完整地说明般并入本文）。在这些方法的每个中，都需要硫酸钙降 解用于生长因子释放。因此，骨再生取决于硫酸钙降解的速率。
[0020] 含有微粒骨和生物相容的包含CSH和磷酸钙产品的固体组分的骨植入物是已 知的，但是骨植入物不涉及使用CSH或磷酸钙作为生长因子载体（美国专利申请公布 2011/0208305号，通过引用如同完整地说明般并入本文）。
[0021] 实际上，在创伤愈合期间，多种GF在不同的时间以变化的浓度存在于创伤部位和 周围组织中。例如，骨折之后即刻，受伤部位的血小板最初会释放大量的roGF，并且在接下 来的几天里骨折部位内的蛋白质水平急剧下降（参见Tyndall等，Clinical Orthopedics and Related Research，2003,408 :319 - 330)。相反地，BMP-2在骨折愈合过程的所有阶段 均表达（参见Rasubala等，British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2003, 41 :173 - 178)，但是 BMP-2 的量随时间变化（参加 Meyer 等，J Bone Jt. Surg2003,85-A : 1243-1254)。估计这些生长因子的浓度比外源性GF的治疗应用期间所使用的生长因子的 浓度低多个数量级，这是由于浓度与细胞需求的匹配以及多种生长因子的协同效应。产生 允许递送具有多相释放模式的生长因子和释放具有不同的释放模式的多种生长因子的体 系会允许使用具有GF释放模式的生物植入物，所述GF释放模式比目前以突然释放或持续 释放来释放单一生长因子的生物植入物更接近地模拟在自然愈合过程中的GF释放。
[0022] 该背景信息是为了使本 申请人:认为的已知信息能够与本发明相关联而提供的。既 不必意欲承认也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
【发明内容】
[0023] 在一个方面，本发明提供一种用于至少一种生长因子在例如处理部位的多相释放 的体系、方法和试剂盒。为此目的，本发明的体系可以提供为生物植入物等。在一个方面， 本发明的方法以最初释放来递送至少一种生长因子，之后以"持续释放模式"递送至少一种 生长因子。本发明利用用于最初释放的递送体系和用于持续释放的载体。
[0024] 在一个方面，相同的生长因子以最初释放模式和持续释放模式进行释放。在另一 个方面，释放不同的生长因子，其中第一生长因子以最初模式释放，第二生长因子以持续释 放模式释放。如会被本领域技术人员所知的，据信两种不同的生长因子以这样不同的方式 释放更接近地模拟处理部位自然的生长因子释放体系。
[0025] 根据本发明的一个方面，提供一种提供至少一种生长因子的持续释放的载体与提 供至少一种生长因子的最初释放的递送载剂的组合。载体和递送载剂的组合产生生长因子 的多相释放模式。在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释 放，其中递送载剂和载体的量以约0.5:1至4.0:1 (V:V)的比例提供。在优选实施方案中， 所使用的递送载剂的量为〇. 5ml至10. 0ml。在特别优选的实施方案中，0. 75ml至2. 5ml的 递送载剂与Icm3的载体一起使用。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和 0. 5cm3的载体。
[0026] 在优选实施方案中，生长因子（"GF"）是转化生长因子β (TGFP)超家族的成员。 在特别优选的实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白（BMP)。
[0027] 在本发明的一个方面，载体（"CAR"）由分散在产生较大结构的聚合物基体中的尺 寸小于80微米、优选小于45微米的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，该结构还包覆有羟磷灰 石层。
[0028] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合前，至少一种GF以液态施加到钙颗粒， 然后被冻干到颗粒上。在一些实施方案中，100%的冻干GF与颗粒相关联。在其他实施方 案中，小于100%的冻干GF与颗粒相关联，其余部分不与颗粒相关联。包含与GF相关联的 颗粒和不与颗粒相关联的冻干GF的这种组合物可以与递送载剂组合，使得未关联颗粒分 布在递送载剂中，在这种情况下之后可以释放该未关联颗粒。
[0029] 在本发明的另一方面，载体通过将一种或更多种磷酸钙粉末与包含至少一种生长 因子的液体溶液混合以生成磷酸钙骨水泥来形成。在一个方面，该骨水泥之后被研磨成具 有至少100微米直径、优选0· 3mm至3mm直径的颗粒。
[0030] 在本发明的另一方面，载体包含一种或更多种钙盐的直径为至少100微米、优选 0. 3_至3_的颗粒。然后，生长因子冻干到载体颗粒的表面上。
[0031] 在优选实施方案中，递送载剂为反相聚合物。在特别优选的实施方案中，反相聚合 物为泊洛沙姆，更特别是泊洛沙姆407(也称作？1111'〇1^(^?127)，浓度为至少12 (%、优选 20 %至40%。在一些特别优选的实施方案中，改变P407和载体的量以影响从载体和任选地 从递送载剂中释放的GF的量。
[0032] 如上所述，在一个方面，载体和递送载剂释放相同的生长因子，而在另一方面，载 体和递送载剂释放不同的生长因子。在本发明的又一方面，载体和递送载剂分别适合于 释放两种或更多种生长因子的组合，载体和递送载剂中的每个释放的组合是相同的或不同 的。
[0033] 因此，在一个方面，本发明提供一种用于生长因子在处理部位的多相释放的体系， 所述体系包括：
[0034] -包含至少一种第一生长因子的递送载剂；和
[0035] -包含至少一种第二生长因子的载体；
[0036] -其中：
[0037] -递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放至少一种第一生长因子；
[0038] -载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放至少一种第二生长因子。
[0039] 在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相释放的方法，所述方法包括：
[0040] -以最初释放模式递送至少一种第一生长因子；
[0041] -以持续释放模式递送至少一种第二生长因子。
[0042] 在又一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0043] -递送载剂组分；
[0044] -与递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0045] -载体组分；和
[0046] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0047] 在又一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0048] -递送载剂组分；
[0049] -载体组分；
[0050] -与递送载剂或载体不相关联的至少一种第一生长因子；和
[0051] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0052] 在一个实施方案中，试剂盒包括至少两个容器，其中第一容器包含递送载剂，第二 容器包含与至少一种第二生长因子和至少一种第一生长因子相关联的载体。在优选实施方 案中，至少一种第一生长因子在递送载剂添加到载体时与递送载剂混合。
[0053] 在一个方面，本发明还提供一种用于例如在处理部位释放至少一种生长因子的体 系、方法和试剂盒，其中硫酸钙"载体"颗粒在其表面容纳至少一种生长因子。为此目的，本 发明的体系可以提供为生物植入物等。
[0054] 在一个方面，本发明的方法以"持续释放模式"递送至少一种生长因子。
[0055] 在本发明的一个方面，载体包含二水合硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物。在优 选实施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
[0056] 在本发明的一些方面，至少一种生长因子从钙载体中以单相释放。在该方面，GF 不由递送载剂释放。在其他方面，至少一种生长因子从钙载体和递送载剂中进行多相释放。 在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释放，其中递送载剂和 载体的量以约0.5:1至4:1 (V:V)的比例提供。在优选实施方案中，所使用的递送载剂的量 为0. 5ml至10. 0ml。在特别优选的实施方案中，每cm3载体使用0. 5ml至2. 5ml的递送载 齐U。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和0. 5cm3的载体。
[0057] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合前，至少一种GF以液态施加到钙颗粒， 然后被冻干到所述颗粒上。
[0058] 在一个实施方案中，冻干GF使得GF中的一部分与载体相关联，GF中的一部分与 载体分开。当递送载剂添加到载体时，分开的GF变得与递送载剂相关联。
[0059] 在优选实施方案中，至少一种GF到钙颗粒上的分布通过改变包含GF的溶液相对 于待冻干到颗粒上的蛋白质的体积来改变。可以通过减少用于递送GF的溶液的体积来使 钙颗粒上结合的GF的量更高。在优选实施方案中，以1:1:0. 5的比例来进行GF到载体颗 粒上的冻干，其中1单位的GF与1单位的溶液混合，并冻干到0. 4单位的载体上。在特别 优选的实施方案中，约I. Omg的GF添加到约I. Oml的溶液中用于冻干到约0. 5cm3的钙颗 粒上。
[0060] 在另一方面，本发明提供一种用于递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0061] -递送载剂组分；
[0062] -包含多个硫酸钙颗粒的载体组分；
[0063] -与载体相关联的至少一种第二生长因子；和任选地
[0064]-与载体不相关联的至少一种第一生长因子，当递送载剂与至少一种第一生长因 子混合时，所述至少一种第一生长因子会变得与递送载剂相关联。
[0065] 在优选实施方案中，试剂盒的载体组分还包含磷酸钙颗粒。在一个特别优选的实 施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
[0066] 在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0067]-递送载剂组分；
[0068]-与递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0069]-包含多个硫酸钙颗粒的载体组分；和
[0070] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0071] 在优选实施方案中，试剂盒的载体组分还包含磷酸钙颗粒。在一个特别优选的实 施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
【专利附图】
【附图说明】
[0072] 现在，将参考【专利附图】
【附图说明】本发明，所述附图在下文进行简单说明。
[0073] 图1示出了本发明的载体所展现的持续释放模式。
[0074] 图2示出了本发明的递送载剂所展现的最初释放模式。
[0075] 图3示出了基于在递送载剂和载体中生长因子的量的不同的释放模式。当生长因 子并入递送载剂和载体（50-50)两者中时，观察到多相释放模式。
[0076] 图4示出了生物植入物的体内活性，其中生长因子根据本发明的方法如图3中所 示进行释放。
[0077] 图5示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物植入到小鼠中时，新骨（骨） 在磷酸钙颗粒（CaP)上的形成。
[0078] 图6示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物植入到小鼠中时，在载体 (载体）上所形成的新骨（骨）的组织学外观。
[0079] 图7示出了根据本发明的方法所制备的载体所产生的短期持续的生长因子释放 模式。
[0080] 图8示出了持续释放模式如何能够通过改变根据本发明的方法所制备的载体的 性能来进行变化。
[0081] 图9A至9D示出了冻干载体，其中冻干溶液的体积是可变的，但是总的冻干蛋白质 是固定的。图示了处理组I(A)、3 (B)和5(C)。
[0082] 图IOA至IOB示出了在根据本发明的方法制备的生物植入物中使用的磷酸钙（A) 和硫酸钙（B)载体组分周围形成的新骨的组织学外观。
[0083] 发明详沭
[0084] 生长因子（GF)在组织的修复和再生中起着不可或缺的作用，外源性GF可以用于 刺激各种组织和器官的修复。为了使外源性生长因子在刺激修复中有效，必须将它们保持 在需要修复的部位，并防止失活、隔绝或降解。为此使用载体。然而，生长因子从已知载体 的释放不理想，并且不能容易地改变。本发明基于以下发现：i)生长因子从生物植入物的 多相释放增加植入物的功效；和ii)使用硫酸钙作为生长因子载体可以提高含GF的生物植 入物的效力。
[0085] 本发明人已经开发了用于通过改善生长因子在植入部位的释放动力学或释放模 式同时保持生长因子的活性来增强例如生物植入物的功效的方法和材料。在一个方面，本 发明提供一种生长因子递送体系和方法，包括含有至少一种生长因子的载体与也含有至少 一种生长因子的递送载剂的组合。由载体和递送载剂所释放的至少一种生长因子可以是相 同或不同的。
[0086] 在另一方面，本发明提供了一种由于使用包含多个在其表面上包含至少一种GF 的二水合硫酸钙颗粒的载体与可以任选地包含至少一种GF的递送载剂的组合而具有增强 的功效的生长因子递送体系及方法。比较而言，先前的使用硫酸钙作为GF载体的尝试涉及 将硫酸钙颗粒与生长因子合并或用生长因子浸渍硫酸钙颗粒，而不是用GF包覆钙颗粒的 表面。在本发明中，GF释放不需要硫酸钙降解。
[0087] 在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释放，其中递 送载剂和载体的量以约0.5:1至4.0:1 (v:v)的比例提供。在优选实施方案中，所使用的递 送载剂的量为〇. 5ml至10. Oml。在特别优选的实施方案中，每cm3载体使用0. 5ml至2. 5ml 的递送载剂。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和0. 5cm3的载体。
[0088] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合以产生载体结构体之前，至少一种GF以 液态施加到小（〈80微米）的钙颗粒，然后被冻干到颗粒上。
[0089] 在另一个实施方案中，GF以液态施加到到大（>100微米）的颗粒，然后与颗粒一 起冻干，生成与颗粒相关联的GF和游离GF的分布。
[0090] 在优选实施方案中，通过改变包含GF的溶液相对于在冻干之前与之一起培养的 颗粒的量的体积来改变至少一种GF在与颗粒相关联和与颗粒分开或"游离于"颗粒之间的 分布。可以通过减少用于递送GF的溶液的体积来使颗粒上结合的GF的量更高。在优选实 施方案中，以1:1: 〇. 5的比例来进行GF到载体颗粒上的冻干，其中1单位的GF与1单位的 溶液混合，并冻干到4单位的载体上。在特别优选的实施方案中，约I. Omg的GF添加到约 I. Oml的溶液中用于冻干到约0. 5cm3的钙颗粒上。
[0091] 本发明的体系和方法能用于各种治疗和临床应用，包括骨折修复；骨植入；脊柱 融合；以及头骨、下颌骨和骨缺损的再生。对于这些应用，本发明的体系优选提供在生物植 入物上或以生物植入物的形式提供。
[0092] 定义
[0093] 除非下文另外定义，本文所使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所理解的相同的意思。
[0094] 如本文所用，术语"生物植入物"是指适合于植入的材料，并且含有外源性生长因 子或生物活性因子。如本文进一步讨论的，本发明的体系优选通过对生物植入物施加所述 物质来使用。然后在对象体内提供生物植入物，其中所述体系以多相释放模式释放至少一 种生长因子。
[0095] 如本文所用，术语"生长因子"是指通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺 激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白（BMP)、转化 生长因子β (TGFP)、胰岛素样生长因子（IGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、血小板衍生生 长因子（PDGF)和血管内皮细胞生长因子。在优选实施方案中，生长因子是BMP。
[0096] "重组体"表示由瞬时转染的、稳定转染的或转基因的宿主细胞或者动物所产生的 蛋白质，所述宿主细胞或者动物受含有关于所述蛋白质的cDNA的表达结构控制。术语"重 组体"还包括这种多肽的可药用盐。
[0097] 如本文所用，术语"多肽"或"蛋白质"是指氨基酸单体的聚合物，所述氨基酸单体 为通过酰胺键连接在一起的α氨基酸。因此，多肽的长度为至少两个氨基酸残基，并且通 常更长。一般地，术语"肽"是指长度上仅有很少氨基酸残基的多肽。与肽相反，多肽可以 包含任意数量的氨基酸残基。因此，术语多肽包括肽以及更长的氨基酸序列。
[0098] 如本文所用，术语"骨形态发生蛋白"或"骨形态生成蛋白"或"BMP"可相互交换地 使用，并且是指生长分化因子的转化生长因子β (TGFP)超家族中骨形态发生蛋白（BMP) 亚家族的任何成员，包括BMP-2、BMP-3 (也称作成骨素）、BMP-3b (也称作生长分化因子10， ⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(也称作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8(也称作成骨蛋 白-2, 0P-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-Il (也称作生长分化因子-8,⑶F-8,或者肌生长抑制蛋 白）、BMP-12 (也称作生长分化因子-7,⑶F-7)、BMP-13 (也称作生长分化因子6,⑶F-6)、 BMP-14(也称作生长分化因子5,⑶F-5)和BMP-15。
[0099] 术语"骨形态发生蛋白"和"BMP"还包括BMP的等位基因变异体、BMP的功能保守 变异体和保持BMP活性的突变BMP。这种变异体和突变体的BMP活性可以通过本领域众所 周知的任何方法（参见下文中测量BMP活性的分析的章节）或如实施例1所说明的进行确 定。
[0100] 在优选实施方案中，BMP 是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。 在特别优选的实施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0101] 在优选实施方案中，BMP是哺乳动物的BMP (例如哺乳动物的BMP-2或哺乳动物的 BMP-7)。在特别优选的实施方案中，BMP是人类的BMP (hBMP)(例如hBMP-2或hBMP-7)。
[0102] 如本文所用，术语"支架"是指其目的为提供支持细胞附着、迁移以及向内生长到 组织修复部位内的结构体的材料。
[0103] 如本文所用，术语"载体"是指包含单一或多种组分的材料，并且适合于在一段时 间内以"持续释放"模式在处理部位释放至少一种生长因子。在一个方面，载体释放至少一 种生长因子的时间段为几天至几周。优选地，载体适合于在几周的时间段内释放至少一种 生长因子。
[0104] 在优选实施方案中，载体也用作支架或基体。如上所述，在本发明的一个方面，载 体由分散在大孔聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体还包覆 有羟磷灰石层。在本发明的另一方面，载体由硫酸钙颗粒形成。在本发明的又一方面，载体 为硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物。在一个实施方案中，在将颗粒与聚合物基体组合之 前，将至少一种生长因子以液态施加到钙颗粒，然后冻干到颗粒上。在优选实施方案中，载 体是固体。
[0105] 如本文所用，术语"递送载剂"是指用于运送载体的材料。在本发明的一个方面， 递送载剂包含至少一种生长因子，或者变得与至少一种生长因子相关联，并适合于在一段 时间内以最初释放模式在处理部位释放至少一种生长因子。在其他方面，递送载剂最初不 包含生长因子。而是，其之后在使用前同与载体不相关联的GF组合，从而产生GF释放的最 初相。在一个方面，递送载剂释放至少一种生长因子的时间段为几小时至几天。在本发明 的一个优选实施方案中，递送载剂以持续几个小时的"最初释放"或"最初释放模式"释放 大部分的至少一种生长因子。优选地，递送载剂适合于在72小时的时间段内释放至少80% 其中包含（或与其相关联）的生长因子。在优选实施方案中，递送载剂为液体或凝胶。
[0106] 在一个方面，本发明的递送载剂可以用于使载体颗粒容易处理，其中载体和递送 载剂的组合导致凝胶或膏状物的形成。
[0107] 在一个方面，形成递送载剂的材料是凝胶形式的。在优选实施方案中，递送载剂为 反相聚合物。如本文所用，术语"反相"是指凭借其聚合物进行从液体到凝胶的可逆温度依 赖转变的性质。在一个方面，转变温度为15°c至37°C。优选地，转变温度为15°C至25°C。 如本领域技术人员会知道的，"正相"材料随着温度降低其黏度增加。相反地，反相材料随着 温度降低到其转变温度以下显示出黏度降低。
[0108] 在特别优选的实施方案中，反相聚合物为泊洛沙姆，更具体地是Pluronic? F127 (也被称为泊洛沙姆407或P407)。
[0109] 在特别优选的实施方案中，P407聚合物溶液为20%至40%的。
[0110] 在优选实施方案中，改变在生物植入物中使用的载体和递送载剂的量以影响从生 物植入物中释放的GF的量。
[0111] 如本文所用，术语"持续释放"或"持续释放模式"是指在几天或几周的时间段内 由载体释放至少一种生长因子，其中在最初时间段释放的量相似于或低于植入的几天或几 周后相同时间段释放的量。优选地，持续释放模式持续至少一周。如本领域技术人员会理 解的，一般地，在前三天内以持续释放模式释放的生长因子的量会低于在之后七天内释放 的量。
[0112] 如本文所用，术语"最初释放"或"最初释放模式"是指由递送载剂最初释放大量 的至少一种生长因子，然后在几小时或几天的时间段内释放逐渐降低的量。在一个方面，最 初释放模式导致在大约72小时的时间段内递送至少80%的负载的生长因子。最初释放模 式图示于图2中。
[0113] 如本文所用，术语"多相释放"是指在最初释放时间段内最初释放至少一种生长因 子，然后在第二时间段内"持续"释放至少一种生长因子。优选地，最初时间段是大约几个 小时，第二时间段是大约几天到几周。这种释放模式还可以称为"双相释放"，这是因为其在 两个阶段进行。在优选实施方案中，最初释放由本发明的递送体系提供，"持续"释放由本发 明的载体提供。
[0114] 如本文所用，术语"效力"是指按照产生指定强度的效果需要的量表达的药物活性 的量度。
[0115] 在本发明的一个方面，递送载剂组分包含由本发明的体系递送的生长因子总量的 至少10%但不超过50%，载体组分包含由所述体系递送的生长因子总量的至少50%。
[0116] 测量BMP活件的分析
[0117] 对重组的BMP的体外和体内功能进行表征的分析在本领域是众所周知的（参 见例如美国专利4, 761，471号；美国专利4, 789, 732号；美国专利4, 795, 804号；美国专 利4, 877, 864号；美国专利5, 013, 649号；美国专利5, 166,058号；美国专利5, 618, 924 号；美国专利5, 631，142号；美国专利6, 150,328号；美国专利6, 593, 109号；Clokie和 Urist，Plast. Reconstr. Surg. 2000 ; 105 :628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ; 19 :3314-3324 ; Vallejo 等，J. Biotech. 2002 ;94 :185-194 ;Peel 等，J. Craniofacial. Surg. 2003 ;14 : 284-291 ;以及 Hu 等，Growth Factors，2004 ;22 :29-33)。
[0118] 这类分析包括：对植入（例如植入后腿及臀部肌肉或胸的区域）进啮齿动物（例 如大鼠或小鼠）后BMP的骨诱导活性进行定量的体内分析（参见例如美国专利4, 761，471 号；美国专利4, 789, 732号；美国专利4, 795, 804号；美国专利4, 877, 864号；美国专利 5, 013, 649号；美国专利5, 166, 058号；美国专利5, 618, 924号；美国专利5, 631，142号； 美国专利 6, 150, 328 号；美国专利 6, 503, 109 ;Kawai 和此18七，（：1111.0竹11〇口.1^1&七· Res. ,1988 ;222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr. Surg. 2000 ;105 :628-637 ; 以及Hu等，Growth Factors, 2004 ;22 :29-33);对再生哺乳动物中头骨环锯缺损的BMP活 性进行定量的体内分析（例如大鼠、狗或猴）（参见例如美国专利4, 761，471号和美国专 利4, 789, 732号）；对诱导体外培养的软骨细胞增殖的BMP活性进行定量的体外分析（参 见例如美国专利4, 795, 804号）；对诱导体外培养的肌肉细胞（例如C2C12细胞，ATCC编 号CRL-1772)或骨髓基质细胞（例如鼠的W-20细胞，ATCC编号CRL-2623)中碱性磷酸 酶活性的BMP活性进行定量的体外分析（参见例如美国专利6, 593, 109号；Ruppert等， Eur J Biocheml996;237 :295-302 ;Kirsch 等，EMBO J，2000; 19 :3314-3324 ;Valle jo 等，J Biotech，2002 ;94 :185-194 ;Peel 等，J Craniofacial Surg.，2003 ;14 :284-291 ;以及 Hu 等，Growth Factors，2004;22:29-33);对诱导培养的间质祖细胞系（例如鼠的C3H10T1-2 细胞）中FGF-受体2 (FGFR3)表达的BMP活性进行定量的体外分析（参见例如Valle jo等， J Biotech2002;94:185-194);对诱导鸡枝芽细胞中蛋白多糖合成的BMP活性进行定量的 体外分析（参见例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ;237 :295-302);以及对诱导骨髓基 质细胞（例如鼠的W-20细胞；ATCC编号CRL-2623)中骨钙素治疗的BMP活性进行定量的 体外分析（参见例如美国专利6, 593, 109号）。
[0119] 测量BMP结合与释放的分析
[0120] 各种分析可以用于测量来自载体的重组BMP的结合与释放。例如，重组BMP蛋白 质的量可以通过本领域中众所周知的任何技术进行定量，包括斑点印迹、免疫分析（例如 酶联免疫吸附分析，ELISA)、当生物植入物包含放射标记的BMP时释放缓冲剂中出现的放 射性增加的测量以及色谱法（例如高压液相色谱、HPLC和离子交换色谱）。
[0121] 这类方法在本领域中是众所周知的（参见例如Harlow和Lane，Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999 ； Gosling 编著，Immunoassays ：A Practical Approach, Oxford University Press, 2000 ； Oliver 编著，HPLC of Macromolecules ：A Practical Approach, Oxford University Press, 1998 ;Millner 编著，High Resolution Chromatography ：A Practical Approach, Oxford University Press,1999 ；Hockfield 等，Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993 ；Gore 编 著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry ：A Practical Approach, Oxford University Press,2000)。
[0122] 例如已经描述了 BMP蛋白质的放射免疫实验分析的方案（参见例如美国专利 4, 857, 456号）。例如已经描述了 BMP蛋白质的免疫印迹分析的方案（参见例如Wang等， Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:2220-2224)。例如用于人类、大鼠或小鼠 BMP-2 的蛋 白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从R&D Systems (目录#DBP200、 PDBP200或SBP200)。例如用于人类BMP-7的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商 业购买的，例如从R&D Systems (目录#DY354或DY354E)。
[0123] 试剂盒
[0124] 在一个方面，本发明提供一种用于包含本文所描述体系的试剂盒。在一个实施方 案中，试剂盒包含用于制造递送载剂和载体以及所需的生长因子的必需组分。即，本发明的 试剂盒会包括必需组分以制造递送载剂和载体以及与递送载剂相关联或之后会变得与其 相关联的至少一种生长因子和与载体相关联的至少一种生长因子。
[0125] 试剂盒优选地包括含有其上可以负载或包覆相关联的生长因子的载体的容器。
[0126] 优选地，递送载剂和任何相关联的生长因子保持在不同的容器中，其可以在使用 时组合。这在递送载剂可以包含液体或凝胶的情况下会是特别优选的。在这种情况下，当 递送载剂包含相关联的生长因子与液体或凝胶两者时，相关联的生长因子可以以冻干粉末 保持在不同的容器中。在使用时，粉末形式的生长因子可以与液体或凝胶递送载剂组合。
[0127] 在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少三个容器用于以下的每一 个：1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子（即与递送载剂相关联的生长因子）；和 3)载体和至少一种第二生长因子（即与载体相关联的生长因子）。使用时，将粉末形式的 至少一种第一生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后将该混合物施加到其上预 负载有至少一种第二生长因子的载体。
[0128] 在另一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少两个容器，分别包含以 下组分：1)递送载剂组分；和2)硫酸钙载体和与载体相关联的至少一种生长因子以及不与 载体相关联的其他生长因子。使用时，将液体或凝胶形式的递送载剂施加到载体和相关联 的GF(结合的或负载的GF)并施加到不与载体相关联的生长因子（"游离"GF)。于是游离 GF变成并入到递送载剂中。
[0129] 在一个优选的实施方案中，载体由硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物构成。在本 发明特别优选的实施方案中，载体由比例约为1:1或2:1的硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混 合物构成。优选地，载体包覆有至少一种生长因子。
[0130] 在又一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少三个容器用于以下的每 一个：1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子（即与递送载剂相关联的生长因子）；和 3)硫酸钙载体和至少一种第二生长因子（即与载体相关联的生长因子）。使用时，将粉末 形式的至少一种第一生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后将该混合物施加到 其上预负载有至少一种第二生长因子的载体。
[0131] 在一个优选的实施方案中，载体由硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物构成。在本 发明特别优选的实施方案中，载体由比例约为1:1或2:1的硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混 合物构成。优选地，载体包覆有至少一种生长因子。
[0132] 在一个方面，本发明的试剂盒根据可能的需要可以包括任何必需的试剂和/或仪 器和/或说明和/或器皿。 实施例
[0133] 现在会通过以下实施例来描述本发明。这些实施例说明了本发明人的新发现，即 生长因子例如rhBMP-2的多相释放模式比仅产生突然释放或持续释放的载体更有效，所述 多相释放模式通过在以持续释放来释放BMP的载体内负载部分的BMP和在以最初释放来释 放BMP的递送载剂内负载部分的BMP而产生。这些实施例还说明了在改善的用于提高生物 植入物的效力的体系、方法和组合物中，二水合硫酸钙或者二水合硫酸钙和磷酸钙的混合 物可以用作生长因子如BMP的载体。
[0134] 如会对本领域技术人员明显的，能够在载体内放置一种生长因子，在递送载剂内 放置不同的生长因子，产生各生长因子不同的释放模式。
[0135] 会理解，本文所提供的实施例仅意欲说明本发明，并不以任何方式限制本发明的 范围。同样地，本发明不限于本文所描述的任何特别优选的实施方案。事实上，在阅读本说 明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员可以是明显的。因此，本发明仅受所附 的权利要求以及权利要求享有权利的等同物的完整范围限制。
[0136] 实施例1 :通讨在PLGA中何封制诰含有BMP的持续释放复合载体
[0137] 该实施例示范如何形成含有rhBMP-2的载体，其以持续释放模式释放生长因子。
[0138] 材料和方法
[0139] 比浓对数黏度为 I. 33dL/g 的 PLGA 75/25 (MW = 205000-210000)购自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四I丐（TTCP)从 Taihei Chemical Industrial Co.(大 阪，日本）获得，无水憐酸二I丐（DCPA)和二甲亚讽（DMSO)从Taihei Chemical Industrial Co. (MO, USA)获得。糖颗粒购自 Tate&Lyle North America Inc.(多伦多，加拿大）。
[0140] 可再吸收的磷酸钙颗粒通过在100%的相对湿度混合等摩尔的TTCP和DCPA与去 离子蒸馈水（ddH 20) 24小时进行制备。反应物进行研磨并通过45 μ m的筛进行筛分。
[0141] 重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂（I. 5mg/ml，pH 4.5;5mm谷氨酸,2.5%甘氨酸,0.5%鹿糖和0.01%TweenTM80与ddH20)中进行制备。蛋白 质溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并搅拌至少15分钟。然后，粉末进行冷冻并冻干。
[0142] 然后，将具有BMP的颗粒（CaP-BMP)或没有BMP的颗粒（CaP)用于通过如下的相 转化/颗粒浙滤来制造 CaP颗粒-PLGA支架块：将PLGA以11. 5 % (w/v)的浓度溶于DMS0。 CaP和CaP-BMP颗粒按照2:1 (w/w)的CaP/PLGA比例充分混合入该溶液。尺寸范围为0. 85mm 至I. 18mm的糖晶体分散于CaP/PLGA中，混合物在-18°C下在模具中进行固化。PLGA沉淀， 糖晶体通过三次更换CldH 2O浸洗来滤出。
[0143] 羟磷灰石层如下沉积到大孔复合支架上并遍及大孔复合支架：干燥的PLGA/CaP 圆柱（测量直径2mm和长2mm)在70 %的乙醇中预湿润，并在37 °C下浸入60ml的3 X SBF 中9天时间。SBF如下制备：在剧烈搅拌下，向I. 8L的CldH2O中依次加入以下盐：29. 711g NaCl，2.206g CaCl2-2H20，10ml IM HCl，0.852Na2HP04。最终体积达到 2L。每天更换 SBF 溶 液。包覆之后，3PCC样品在CldH2O中进行漂洗，并空气干燥。
[0144] 这导致形成能够在至少七天内以持续释放模式释放rhBMP-2的大孔复合载体 (3PS)。这些结果图示于图1中。
[0145] 实施例2 :通讨在磷酸钙骨水泥中何封制诰含有BMP的持续释放载体
[0146] 本实施例示范如何形成具有持续释放模式的含有rhBMP-2的磷酸钙骨水泥（CPC) 载体。
[0147] 材料和方法
[0148] 憐酸四I丐（TTCP)从 Taihei Chemical Industrial Co.(大阪，日本）获得，无 水磷酸二Ii(DCPA)从Sigma Chemical Co获得。大孔双相磷酸|丐颗粒（Eclipse)购自 Citagenix (Laval Qc，加拿大）。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在 配制缓冲剂（1.5mg/ml，pH 4.5;5mm 谷氨酸，2.5(%甘氨酸，0.5(%鹿糖和0.01(%1￥6611 11180 与(IdH2O)中进行制备。
[0149] 可再吸收的磷酸钙骨水泥颗粒通过混合等摩尔的TTCP和DCPA与rhBMP-2溶液来 制备。反应物进行研磨，并通过300 μ m和100 μ m的筛进行筛分,保留100 μ m至300 μ m的 颗粒。
[0150] 这导致形成rhBMP-2并入其中的磷酸钙骨水泥载体颗粒。在植入进动物中后，BMP 在至少几周的时间内以持续的方式进行释放。
[0151] 为了生成也用作大孔支架的基于CPC的持续释放载体，CPC颗粒（0. Imm至0. 3mm) 与大孔磷酸I丐颗粒（lmm至2mm)以1:1的比例（w/w)进行混合。
[0152] 实施例3 :通讨#用结合BMP的何覆层制诰含有BMP的持续释放载体
[0153] 本实施例示范如何通过应用结合BMP的包覆层来形成具有持续释放模式的载体。 一种这样的方法是如在我们的共同待决的申请号美国申请13/002, 444号（其全部内容通 过引用并入本文）中所述的用抗体或结合BMP的蛋白包覆载体。
[0154] 材料和方法
[0155] 纯净的多克隆兔抗人类BMP-2抗体购自Cell Sciences (Canton MA.，目录 #PA0025)。大孔双相磷酸I丐（BCP)颗粒（Eclipse)购自 Citagenix(Laval, Qc，加拿大）。
[0156] 在生物安全柜中称出无菌BCP颗粒，并置于无菌TPP管（Mandel Scientific， Guelph 0N，加拿大）中。抗体溶液在磷酸盐缓冲的盐水中稀释至最终浓度为Iml PBS中 150ng、300ng和600ng抗体，过滤灭菌，并以I: lv/v的比例应用到载体。在进行冷冻和冻干 前，样品在室温下搅拌至少15分钟。然后，BMP溶液应用到颗粒，允许在室温下浸渍15分 钟，然后进行冷冻和再冻干。
[0157] 这导致形成覆盖有结合并以持续方式缓慢释放rhBMP-2的抗体的BCP颗粒。
[0158] 能够结合的rhBMP-2的量能通过增加所用抗体的量来增加。释放的速率能够通过 使用具有更低的亲和性或亲和力的抗体来增加。
[0159] 实施例4 :#用F127制各含BMP的递送载剂
[0160] 本实施例示范如何使用F127制备含有rhBMP-2的递送载剂。
[0161] 材料和方法
[0162] 泊洛沙姆如下进行制备：100ml的蒸馏水冷却到4°C，随着搅拌在几个小时的时间 内缓慢添加各种量的泊洛沙姆407,直到所有固体颗粒都溶解，使最终溶液为12%至33%。 然后，泊洛沙姆溶液在高压灭菌器中进行灭菌（121°C，20分钟，30psi)。在灭菌后，泊洛沙 姆溶液在4°C下保存直到使用。
[0163] 冻干的重组人类BMP-2粉末（rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆 溶液，并缓慢地混合。
[0164] 或者，rhBMP-2 以 1/10 或 l/20(v/v)的比例从溶液（lmg/ml，pH 4. 5 ;5mm谷氨酸， 2. 5 %甘氨酸，0. 5 %蔗糖和0. 01 %吐温80)添加。
[0165] 这导致形成在前两天释放超过80%的rhBMP-2的递送载剂（如图2中所示）。
[0166] 实施例5 :具有多相释放樽式的牛物棺入物的制各
[0167] 本实施例示范如何形成以多相释放模式来释放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。
[0168] 材料和方法
[0169] 制备每5mg载体含有0 μ g、4. 55 μ g或9. 1 μ g的rhBMP-2的3PS载体（如实施例 1所述），并储存于Eppendorf管中。在45. 5μ 1的F127中含有0yg、4. 55yg或9. Iyg 的rhBMP-2的递送载剂（如实施例4所述制备的）在4°C储存于Eppendorf管中。在使用 之前即刻将F127移液到3PS载体上，并且载体混合到递送载剂中。
[0170] 然后，该3PS-F127生物植入物如下文所述用于测量体外BMP释放以及体内骨形成 活性。
[0171] 载体与递送载剂的比例可以改变以产生凝胶（1:1比例V:v)或膏状物（2:1比例 V:V)。另外，BMP与载体的比例或载体的颗粒尺寸可以改变以改变持续释放模式。最终，载 体和递送载剂中rhBMP-2的量可以改变以改变与之后几周释放的量相比在前几个小时最 初释放的rhBMP-2的量。
[0172] 实施例6 :来自牛物棺入物的BMP释放的体外分析
[0173] 本实施例描述了如何测量来自实施例1至5中所述的各种生物植入物的rhBMP-2 的释放。
[0174] 材料和方法
[0175] 如实施例1至5中所制备的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物转移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的总量为相对于每5mg载体以及45. 5 μ 1的F127的9. 1 μ g 的rhBMP-2,或者相对于每IOmg载体以及100 μ 1的F127的20 μ g的rhBMP-2。
[0176] 然后，样品在37°C在搅拌下利用Iml包含磷酸盐缓冲盐溶液（PBS)+1 % BSA的释 放缓冲溶液进行培养。在不同时期（例如1、2、5、7和10天）后，移除缓冲剂，并替换为新 鲜的释放缓冲剂，然后将收集的溶液在_20°C下储存于I. 5ml的小瓶中用于进一步的分析。
[0177] 使用商业的 ELISA (Quantikine? hBMP_2ELISA，RnD Systems)测量释放到缓冲剂 中的BMP-2的量。ELISA根据制造商的说明来实施。
[0178] 结果
[0179] 在从任何未负载BMP的生物植入物所收集的释放缓冲剂中没有可以检测到的 BMP。已经负载rhBMP-2的载体样品证实在研究期间持续释放rhBMP-2,而仅在递送载剂中 的样品以"最初释放模式"进行释放。
[0180] 当载体和递送载剂组合时，根据BMP所负载入的组分获得各种释放模式。当100% 的rhBMP-2(9. 1 μ g)负载在之后与33%的F127(45. 5μ 1)混合的3PS(5mg)载体内时，BMP 释放模式与持续形式匹配，其中在前两天释放的BMP的量为5ng，在第3天至第5天其为 8ng，在第5天至第7天其为IOng (图3 ;100-0)。
[0181] 当100%的rhBMP-2(9. Iyg)负载在33%的F127(45. 5μ 1)内，然后与其中没有 BMP的3PS载体（5mg)混合时，BMP被释放，其中释放的BMP的量在第一天为2363ng，在第 二天为381ng，然后在第三天为12ng (图3 ;0-100)。
[0182] 当BMP分布在载体和递送载剂之间时，生物植入物证实双相释放模式，其中在中 等最初释放之后是BMP的持续释放（图3 ;50-50)。
[0183] 实施例7 :测试释放的BMP的活件的体外分析
[0184] 本实施例描述了如何确定从生物植入物释放的rhBMP-2是否保持其活性。为了 证实释放的rhBMP是生物活性的，应答细胞可以与释放物一起培养，并测量其对生长因 子的应答。这种分析在本领域中是已知的（参见Peel等，J. Craniofac. Surg. 2003,14 : 284-291)。
[0185] 材料和方法
[0186] 制备如实施例1至5中所述的具有或没有rhBMP-2的材料。释放物如实施例 3中所述进行制备，除了缓冲剂是具有15%的胎牛血清和抗生素的α最小必需培养基 (aMEM+15% FBS+AB) 〇
[0187] C2C12细胞以0. 5Χ IO5细胞/ml接种到24孔组织培养板中，每孔Iml α ΜΕΜ+15% FBS。在24至72小时的各种时期后，除去培养基并应用各种释放物。阴性对照包括利用 新鲜的aMEM+15% FBS+AB培养的C2C12细胞。阳性对照包括利用含有25ng/ml、50ng/ ml 和 100ng/ml 的 rhBMP-2 的 α MEM+15 % FBS+AB 培养的 C2C12 细胞。48 小时后，细胞 在Iml细胞溶解缓冲剂（Cellytic Sigma Aldrich)中溶解，使用对硝基苯酚磷酸盐分析 物（Sigma Aldrich)测量细胞溶解物的碱性磷酸酶（ALP)活性。使用Coomassie Plus Reagent(Fisher)测量溶解物的细胞蛋白含量，并将其用于对每孔的细胞数标准化ALP活 性。
[0188] 一般地，为了确定是否在与载体或递送载剂相结合时已经有BMP活性的任何损 失，确定未与载体或递送载剂相结合的rhBMP-2标准物的ALP/PTN结果的标准活性曲线。释 放物中活性rhBMP-2的浓度可以从该标准曲线进行确定，其表达为如通过ELISA测定的释 放物中存在的rhBMP-2总量的百分比。
[0189] 实施例8 :多相BMP棺入物的骨诱导活件的评价
[0190] 本实施例描述了如何测定含有BMP的生物植入物的体内骨诱导活性。为了评价生 物植入物诱导骨形成的活性，使用小鼠肌袋分析。在该模型中，生物植入物置于在小鼠后肢 中制造的肌袋中，形成的诱导骨的尺寸与试验的BMP的量成比例。这种分析在本领域是已 知的（参见例如 Barr 等，Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod.，2010 ; 109 :531-40)。
[0191] 材料和方法
[0192] 生物植入物如实施例I和5中所述进行制备。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶-I 小鼠的后肢的大腿肌肉中通过钝器解剖制造双侧的袋。然后，生物植入物置入已经置入肌 袋的无菌胶囊中。将肌肉拉到一起，用Mitchel夹使皮肤闭合。
[0193] 动物在术后第28天进行安乐死。收获后肢，并用10%缓冲的福尔马林进行固定。 固定之后，试样使用微CT扫描仪（General Electric Healthcare eXplore? Locus SP)进 行成像。扫描样品，并使用制造商软件在59μπι的分辨率下重构。图像重构之后，确定感兴 趣的区域（ROI)。该区域包括含有生物植入物诱导的骨的所有区域。根据位置和密度这些 可以简单地与骨骼骨进行区分。
[0194] 为了分析ROI内的骨的数量和质量，mCT图像的体素区分为骨和非骨的相。区分 通过确定体素灰度的阈值来实现，在所述阈值体素视为骨。对每个样品测定ROI的总体积 (TV)、骨体积（BV)、总体积的矿物质密度（TV-MD)、骨体积的矿物质密度（BV-MD)、总体积的 矿物质含量（TV-MC)、骨体积的矿物质含量（BV-MC)和骨体积分数（BVF)。对于由于载体 引起的钙的存在，通过使用仅选择载体的阈值上限并将其从使用包括载体加新骨的阈值下 限获得的数值中扣除来校正数值（参见Humber等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology. 2010. 109 :372-384)。
[0195] 在微CT分析完成之后，试样或者包埋在spurs树脂中，或者在甲酸中脱钙并包埋 在石蜡中。树脂包埋的样品通过背散射SEM进行评价，而将石蜡包埋的样品进行切割并利 用苏木精和曙红（H&E)进行染色，并通过光学显微镜进行检查，以评价植入部位存在的组 织类型。
[0196] 益果
[0197] 载体和递送载剂如实施例5所述进行组合。
[0198] 微CT分析显示，所有BMP都在3PS载体内的生物植入物生成最小的骨小骨，所述 生物植入物具有持续BMP释放模式（图4 :100-0)，所有BMP都在F127递送载剂内的生物 植入物生成中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP释放模式（图4 :0-100)，而 50% BMP负载入载体并且50%负载入递送载剂的生物植入物生成最大的骨小骨，所述生物 植入物具有多相BMP释放模式（图4 :50-50)。
[0199] 背散射SEM显示，到28天时骨遍及生物植入物形成以及形成到已经并入PLGA的 磷酸钙颗粒上（图5)。组织学确认所形成的组织是骨（图6)。
[0200] 实施例9 :来自牛物棺入物的BMP释放的活体分析
[0201] 本实施例描述了如何测量植入后从实施例1、2、3、4或5中所述的各种生物植入物 到动物中的rhBMP-2的释放。为此的方法在本领域是众所周知的。例如参见Uludag等，J Biomed Mater Res，46,193 -202,1999。
[0202] 材料和方法
[0203] 重组的hBMP-2通过珀金埃尔默（Perkin Elmer)用碘125(1-125)进行放射性标 记。放射性标记的rhBMP-2 (强放射性的）与未标记的rhBMP-2 (无放射性的）混合，以产 生1:100的强放射性的无放射性的混合物。
[0204] 含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如实施例1至5中进行制备。然后，这些生物 植入物如实施例8中所述植入到动物中。在各个时间段，宰杀动物并切出植入物部位。然 后对切出的组织称重，放射性的量使用Y计数器进行测定。
[0205] 为了确定计数是否与蛋白质相关，组织在0.5ml PBS+0. 5% BSA中均匀化。两ml 冰冷的10%三氯乙酸加入匀浆中，然后在4°C保持至少1小时。然后，离心匀浆，并移除上 层清液。然后，沉淀物的放射性使用Y计数器进行测量。
[0206] 与植入物相关的放射性对衰减进行校正，估计保持在植入物中的BMP的总量。
[0207] 实施例10 :具有短持续释放樽式的载体的制各
[0208] 本实施例描述了制备以短持续释放模式来释放生长因子的载体的手段。
[0209] 材料和方法
[0210] 大孔双相磷酸I丐（BCP)颗粒（Eclipse)购自Citagenix (Laval, Qc,加拿大）。重 组的人类 BMP_2(rhBMP-2，Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂（I. 5mg/ml，pH 4. 5 ;5mm 谷氨酸，2. 5%甘氨酸，0. 5%蔗糖和0. 01% TWeenTM80与ddH20)中进行制备。
[0211] 无菌的rhBMP-2溶液在摇动下以9. 1 μ g每5mg或4. 55 μ g每5mg (BMP每BCP)的 比例与无菌BCP颗粒一起培养15分钟。然后，样品进行冷冻并无菌冻干。
[0212] 冻干之后，载体称为5mg的等分部分，并置于无菌的Eppindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45. 5 μ 1)。然后，BMP释放模式如实施例6中所述进行测定。
[0213] 益果
[0214] 未用F127包覆的载体（BCP)显示突然释放模式，其中在第一天释放大量ΒΜΡ，然后 在每一之后的时间点释放减少量的BMP。在F127内混合BCP (BCP-Pol)产生短期的持续释 放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (图7)。
[0215] 实施例11 :改夺载体的持续释放樽式
[0216] 本实施例描述改变载体的释放模式的手段。
[0217] 材料和方法
[0218] 具有不同比浓对数黏度和分子量的PLGA购自Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL)。然后，载体如实施例1所述使用这些PLGA来制造。这些载体的BMP释 放模式根据实施例6的方法进行测定。
[0219] 益果
[0220] 所有载体产生持续释放模式。然而，释放的BMP的量根据所用PLGA的黏度/分子 量而不同。以低黏度PLGA(Pol-I)制造的载体在研究期间的12周内比使用高黏度（Pol-2) PLGA的那些释放更多的rhBMP-2 (图8)。
[0221] 实施例12 :在冻干期间改夺结合蛋白质和未结合蛋白质的分布
[0222] 本实施例描述了一种通过改变冻干溶液的体积但是保持总的蛋白质和载体含量 固定来改变蛋白质在与载体颗粒结合的冻干物和未结合的冻干物之间的分布的手段。该手 段允许在递送载剂之后添加到冻干容器中时蛋白质在载体关联的蛋白质和递送载剂关联 的蛋白质之间分布。
[0223] 材料和方法
[0224] 实验设计：为了测试改变在冻干之前添加到载体的蛋白质缓冲液的体积对冻干材 料的分布的影响，改变载体与液体蛋白质的体积比，而蛋白质（牛血清蛋白，"BSA"）的量和 载体的量分别固定在Img和400mg。
[0225] 基于以上标准，研究设计为如表1中所述，其中改变添加的蛋白质溶液的体积（即 2. Oml/瓶、I. 5ml/瓶、I. Oml/瓶、0· 75ml/瓶和0· 5ml/瓶）和添加的蛋白质的浓度（0· 5mg/ ml、0. 67mg/ml、l. 0mg/ml、l. 33mg/ml 和 2. Omg/ml) 〇
[0226] 表I :实验设计
[0227]
【权利要求】
1. 一种用于在处理部位释放至少一种生长因子的体系，所述体系包含： a) 包含至少一种生长因子的载体，其中所述载体适合于以持续释放模式释放所述至少 一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，所述颗粒在其表面上包含所述至少一种生长 因子，并且其中所述多个颗粒包含二水合硫酸钙；和 b) 递送载剂。
2. 根据权利要求1所述的体系，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
3. 根据权利要求2所述的体系，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1 或 2:1。
4. 根据权利要求1所述的体系，其中，所述递送载剂包含聚合物。
5. 根据权利要求4所述的体系，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
6. 根据权利要求5所述的体系，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
7. 根据权利要求6所述的体系，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为：骨形态 生成蛋白（BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、 血小板衍生生长因子（PDGF)或血管内皮生长因子（VEGF)。
9. 根据权利要求8所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为BMP。
10. 根据权利要求9所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为BMP-2或BMP-7。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的体系，其中， i) 所述递送载剂适合于在第一时间段以持续释放模式释放至少一种第一生长因子； 和 ii) 所述载体适合于在第二时间段以最初释放模式释放至少一种第二生长因子。
12. 根据权利要求11所述的体系，其中，所述第一时间段包括数小时或数日。
13. 根据权利要求11或12所述的体系，其中，所述第二时间段包括数日或数周。
14. 根据权利要求11至13中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是相同的。
15. 根据权利要求11至13中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是不同的。
16. 根据权利要求11至15中任一项所述的体系，其中，所述第一生长因子和所述第 二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白 (BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
17. 根据权利要求16所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP。
18. 根据权利要求17所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP-2或BMP-7。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的体系，其中，所述载体递送所述至少一种生长 因子的总量的100%。
20. 根据权利要求1至18中任一项所述的体系，其中，所述载体递送所述至少一种生 长因子的总量的至少70%，而所述递送载剂递送所述至少一种生长因子的总量的至少约 10%。
21. 根据权利要求1至18中任一项或权利要求20所述的体系，其中，所述载体递送所 述至少一种生长因子的总量的约70%，而所述递送载剂递送所述至少一种生长因子的总量 的约30%。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为约 0· 5:1 至 4:1。
23. 根据权利要求22所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
24. 根据权利要求23所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约I. 0ml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
25. 根据权利要求1至24中任一项所述的体系，其中，与所述载体相关联的所述至少一 种生长因子是以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上的。
26. 根据权利要求25所述的体系，其中，与所述载体相关联的所述至少一种生长因子、 液体和载体的比例为约1:1: 〇. 5。
27. 根据权利要求26所述的体系，其中，I. Omg的与所述载体相关联的所述至少一种生 长因子被添加到I. Oml的所述液体中，它们一起冻干到约0. 5cc的所述载体上。
28. -种包含根据权利要求1至27中任一项所述的生长因子释放体系的生物植入物。
29. -种释放至少一种生长因子的方法，所述方法包括： -通过载体递送至少一种生长因子，其中所述载体适合于以持续释放模式释放所述至 少一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，并且其中所述多个颗粒包含二水合硫酸钙； 和 -利用递送载剂递送所述载体。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约 1:1 或 2:1。
32. 根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为：血 小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白（BMP)、转化生长因 子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为BMP。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为BMP-2或BMP-7。
35. 根据权利要求29至34中任一项所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为 约 0. 5:1 至 4:1。
36. 根据权利要求35所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
37. 根据权利要求36所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约1.0ml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
38. 根据权利要求29至37中任一项所述的体系，其中，将所述至少一种生长因子以液 体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上。
39. 根据权利要求38所述的体系，其中，所述至少一种生长因子、液体和载体的比例为 约 1:1:0.5。
40. 根据权利要求39所述的体系，其中，将LOmg的所述至少一种生长因子添加到 I. Oml的所述液体中，将它们一起冻干到0. 5cm3的所述载体上。
41. 一种多相释放生长因子的方法，所述方法包括： -通过递送载剂以最初释放模式递送至少一种第一生长因子； -通过载体以持续释放模式递送至少一种第二生长因子，其中所述载体适合于以持续 释放模式释放至少一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，并且其中所述多个颗粒包 含二水合硫酸钙。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约 1:1 或 2:1。
44. 根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是相同的。
45. 根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是不同的。
46. 根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、 骨形态生成蛋白（BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子 (FGF)。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP-2或BMP-7。
49. 根据权利要求41至48中任一项所述的方法，其中，所述载体递送所述生长因子的 总量的100%。
50. 根据权利要求41至48中任一项所述的方法，其中，所述递送载剂递送所述生长因 子的总量的至少10%，而所述载体递送所述生长因子的总量的至少50%。
51. 根据权利要求41至50中任一项所述的方法，其中，所述递送载剂与载体的比例为 约 0. 5:1 至 4:1。
52. 根据权利要求51所述的方法，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中，所述递送载剂的量为约I. Oml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
54. 根据权利要求41至53中任一项所述的方法，其中，将与所述载体相关联的所述至 少一种生长因子以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中，与所述载体相关联的所述至少一种生长因子、 液体和载体的比例为约1:1: 〇. 5cm3。
56. 根据权利要求55所述的方法，其中，将I. Omg的与所述载体相关联的所述至少一种 生长因子添加到I. Oml的所述液体中，将它们一起冻干到0. 5cm3的所述载体上。
57. -种用于递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括： -递送载剂组分； -包含多个二水合硫酸钙颗粒的载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种生长因子。
58. 根据权利要求57所述的试剂盒，其中，所述载体组分还包含磷酸钙颗粒。
59. 根据权利要求58所述的试剂盒，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为 约 1:1 或 2:1。
60. 根据权利要求57至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂组分和所述载 体组分在分开的容器中。
61. 根据权利要求57至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述载体和所述至少一种生 长因子在单个容器中组合，并且其中，所述至少一种生长因子负载或包覆在所述载体组分 上。
62. 根据权利要求57至61中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂包含聚合物。
63. 根据权利要求62所述的试剂盒，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
64. 根据权利要求63所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
65. 根据权利要求64所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
66. -种用于多相递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括： -递送载剂组分； -与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子； -包含多个二水合硫酸钙颗粒的载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
67. 根据权利要求66所述的试剂盒，其中，所述载体组分还包含磷酸钙颗粒。
68. 根据权利要求67所述的试剂盒，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为 约 1:1 或 2:1。
69. 根据权利要求66至68中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂组分和所述载 体组分在分开的容器中。
70. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中，所述递送载剂和所述至少一种第一生长因 子在分开的容器中提供。
71. 根据权利要求66至70中任一项所述的试剂盒，其中，所述载体和所述至少一种第 二生长因子在单个容器中组合，并且其中，所述至少一种第二生长因子负载或包覆在所述 载体组分上。
72. 根据权利要求71所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子与所述载体组 分一起提供。
73. 根据权利要求66至72中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂包含聚合物。
74. 根据权利要求73所述的试剂盒，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
75. 根据权利要求74所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
76. 根据权利要求75所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
77. 根据权利要求66至76中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 和所述至少一种第二生长因子是相同的。
78. 根据权利要求66至76中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 和所述至少一种第二生长因子是不同的。
79. 根据权利要求66至78中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第 二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白 (BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
80. 根据权利要求79所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第二生长因子中 的至少一者为BMP。
81. 根据权利要求80所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第二生长因子中 的至少一者为BMP-2或BMP-7。
82. 根据权利要求66至81中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 占在所述试剂盒中提供的生长因子的总量的至少10%，而所述至少一种第二生长因子占在 所述试剂盒中提供的生长因子的总量的至少50%。
83. -种用于在处理部位多相释放生长因子的体系，所述体系包含： -包含至少一种第一生长因子的递送载剂；和 -包含至少一种第二生长因子的载体； _其中： -所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放所述至少一种第一生长因 子； -所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放所述至少一种第二生长因子。
84. 根据权利要求83所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为约0.5:1至 4:1。
85. 根据权利要求84所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
86. 根据权利要求85所述的体系，其中，所述递送载剂的量为1.0ml，而所述载体的量 为约 0· 5cm3。
87. 根据权利要求83至86中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第二生长因子是 以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上的。
88. 根据权利要求87所述的体系，其中，所述至少一种第二生长因子、液体和载体的比 例为约1:1:0. 5。
89. 根据权利要求88所述的体系，其中，I. Omg的所述至少一种第二生长因子被添加到 I. Oml的所述液体中，它们一起冻干到约0. 5cm3的所述载体上。
90. 根据权利要求83至89中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子是 在所述载体的存在下被添加到所述递送载剂的。
【文档编号】A61K47/34GK104220046SQ201280072332
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2012年4月11日
【发明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申请人:感应生物制品股份有限公司
【专利摘要】一种用于至少一种生长因子在处理部位的多相递送的体系，包括用于以最初释放模式来释放至少一种生长因子的递送载剂，和用于以持续释放模式来释放至少一种生长因子的载体。最初释放模式在数小时至数天的时间段内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子最初大量释放，剩余物以逐渐降低的量释放。持续释放模式在数天至数周的时间段内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子在该时间段内以通常恒定的量进行释放。本发明的体系特别适合应用于生物植入物。本发明还包括用于至少一种生长因子的多相递送的方法和试剂盒。本发明还包括硫酸钙作为用于在单相和多相体系两者中释放至少一种生长因子的载体，用于在处理部位处递送至少一种生长因子。
【专利说明】用于生长因子多相释放的体系和方法
[0001] 在先申请的夺叉引用
[0002] 本申请是于2012年4月11日提交的PCT/CA2012/050234的部分继续申请，所述 PCT申请根据巴黎公约要求于2011年4月11日提交的美国申请61/474, 049号的优先权， 各申请的全部内容通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及用于释放生物物质的体系和方法。特别地，本发明涉及与生物植入物 相关联的生长因子的释放。更特别地，本发明提供一种用于产生至少一种生长因子的多相 释放模式以改善生物植入物性能的体系和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 生长因子（GF)是通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/ 或分化的肽和蛋白质。生长因子在组织的修复和再生中起着不可或缺的作用，GF的外源性 应用可以用于刺激包括骨、软骨、皮肤和粘膜在内的各种组织和器官的修复，以及用于通过 在修复部位刺激血管再生而增强组织的修复。
[0006] 哺乳动物中所分泌的生长分化因子的转化生长因子β (TGFi3)超家族有超过30 个成员。这些二聚蛋白质的特征在于保守的以七个胱氨酸结为基础的结构。它们调节许多 细胞类型的增殖、分化和迁移，并在形态发生、器官发生、组织维护和创伤愈合方面具有重 要作用。生长因子的TGFii超家族可以细分为几个亚家族，包括转化生长因子β亚家族、 骨形态发生蛋白（BMP)和生长分化因子（GDF)家族（也称作BMP亚家族），以及抑制素和激 活素亚家族。
[0007] TGF β超家族的BMP亚家族包含至少二十种蛋白质，包括BMP-2、BMP-3 (也被称为 成骨素）、BMP-3b (也被称为生长分化因子10,⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也被 称为成骨蛋白-I，0P-1)、BMP-8 (也被称为成骨蛋白-2, 0P-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-11 (也 被称为生长分化因子-8,⑶F-8,或者肌生长抑制蛋白）、BMP-12(也被称为生长分化因子 7,⑶F-7)、BMP-13 (也被称为生长分化因子6,⑶F-6)、BMP-14 (也被称为生长分化因子5， GDF-5)和 BMP_15(关于综述，参见例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs 2001; 10: 1677-1686)。
[0008] BMP已经显示出在成软骨细胞中刺激基质合成；在成骨细胞中刺激碱性磷酸酶活 性和胶原蛋白合成，诱导早期间质祖细胞分化为成骨原细胞（骨诱导），调节单核细胞和间 质细胞的趋化性，以及调节神经细胞的分化（关于综述，参见例如Azari等，Expert Opin Invest Drugs 2001 ; 10 :1677-1686 和 Hoffman 等，Appl. Microbiol. Biotech 2001 ;57: 294-308)。
[0009] BMP蛋白质的许多功能之一是在脊椎动物中诱导软骨、骨和结缔组织的形成。BMP 亚家族最具有骨诱导能力的成员是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (参见例如 Hoffman 等，Appl. Microbiol Biotech 2001 ;57-294_308;Yeh 等，J Cellular Biochem., 2005 ;95-173-188 ;和 Boden，Orthopaedic Nursing 2005,24 :49-52)。已经长期认为 BMP 的这种骨诱导能力对于各种治疗和临床应用非常有前景，所述治疗和临床应用包括骨折修 复；脊柱融合；骨骼疾病的治疗，头骨、下颌骨和骨缺损的再生；以及在口腔和牙科应用中 非常有前景，例如在牙周创伤再生期间的牙齿发生和牙骨质发生、拔牙窝植入、牙槽嵴增高 和上颌窦增高。目前，由美敦力（Medtronic)以INFUSE?^I售的重组人类BMP-2被FDA 批准用于脊柱融合手术，用于骨折不愈合的修复以及用于口腔手术，而由史赛克（Stryker) 以OP- 1?销售的重组人类BMP-7被批准作为顽固的长骨不愈合中自体植入的替代，以及用 于后外侧（横突间）腰椎融合的翻修术，其中自体植入和骨髓收获是不可行的，或者预期不 会促进融合。
[0010] 已经外源地用于增强骨修复的其他重组生长因子包括各种TGFP (参见 Clokie&Bell，J. Craniofacial Surg. 2003,14 :268-77)、成纤维细胞生长因子超家族（FGF) 的成员（参见Kawaguchi 等，（2007) J. Orthopaedic Res. 25(4) :480-487)、血小板衍生生长 因子超家族（PDGF)的成员（参见Hollinger等，2008JBJS90 (si) :48-54)和血管内皮细胞 生长因子（VEGF)(参见 Street 等，2002PNAS99:9656-61)。
[0011] 为了使这些生长因子有效，它们在修复部位存在适当的应答细胞的临界密度时， 必须是活性的并且可获得足够的浓度。GF的短的半衰期、热不稳定性、对蛋白酶敏感和/或 溶解性要求它们与载体组合施用，以满足该要求。
[0012] 已经对用于GF递送的大量载体进行了评价。这些载体包括纤维胶原海绵，明胶 水凝胶，纤维蛋白凝胶，肝素，反相聚合物（例如泊洛沙姆），由聚乳酸（PLA)、聚羟基乙酸 (PGA)或其共聚物（PLGA)构成的载体，肝素缀合的PLGA载体和无机材料例如磷酸钙。例 如，用于牙周再生的生物植入物（GEM-.21S?)使用β-磷酸三钙（β-TCP)作为rhH)GF-BB 的载体（参见 http://www. osteohealth. com/GEM21S. aspx)。
[0013] 然而，这些载体具有有限的效力，这是因为当与载体相关联时生长因子活性的损 失，GF在植入部位无效率的释放，和/或对蛋白质水解和降解差的防护。例如，生物植入物 Infuse?使用I型胶原海绵作为rhBMP-2的载体。rhBMP-2从载体突然释放，BMP在创伤 部位内的半衰期为 1 至 3 天（Winn 等，1998，Adv. Drug Del. Rev. 31 :303 ;Friess 等，1999， Inti. J. Pharm.，187 :91)。到使骨再生的间充质干细胞迁移进入创伤部位的时候，仅所负载 的BMP初始量百分比的一部分存在以刺激这些细胞制造骨。目前用于确保在这些稍后的时 间内保持有效水平的BMP的解决方案是显著地增加最初负载的BMP的量。这些增加的剂量 增加并发症的风险，所述并发症包括远离植入部位的骨形成、自身免疫应答和可能的癌症。 另外,这急剧地增加了植入的成本。
[0014] 因此，本领域中存在对以一定模式释放生长因子的材料和方法的需求，所述模式 最小化实现要求的治疗效果所需要负载的生长因子的量。
[0015] 一种策略是将GF包封在生物可降解的聚合物基体中，所述生物可降解的聚合物 基体以持续释放模式释放GF许多天。例如，BMP已经与聚乳酸（PLA)或乳酸-羟基乙酸共 聚物（PLGA)结合以产生持续释放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP会使BMP变性，从 而降低其活性，并且难以控制释放模式以优化生物植入物的效力。另外，这些载体的降解速 率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。因此，需要将大量GF负载到这些聚合 物中以确保在合适的时间存在充足的GF。
[0016] 另一种策略是将GF以化学方法直接固定到载体的表面上。然而，这可能导致GF 的活性部分或全部损失，并且可能限制GF的活性使得只有直接与载体接触的那些细胞才 能够与 GF 相互作用并应答（参见 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials，2006,27: 4547-56)，由于效果会受限于与载体的直接界面处而不遍及创伤部位，因此这会是不期望 的。
[0017] 载体的组成可以影响GF的递送。已经考虑硫酸钙期望作为骨替代物和GF载体， 这是因为其是骨传导的、生物可降解的、生物相容的和无毒的（Chen等，J. Craniofacial Surg.，2010, 21 :188-197)。然而，还已知硫酸钙原位添加到骨时具有快速的降解速率，并且 几乎没有骨诱导能力，这限制了其在骨植入物中的有效性。
[0018] -种对付硫酸钙原位降解的策略是通过改变晶体结构和向硫酸钙植入物混合物 中添加聚合物（例如壳聚糖）来控制降解速率（Chen等，同上）。已经浸渍有BMP的聚合 物包覆的硫酸钙丸粒可以降低硫酸钙再吸收的速度，并增加混合物的压缩强度和骨诱导 (Chen等，同上）。
[0019] 含有羟磷灰石（HAp，骨的主要矿物质组分）和硫酸钙半水合物（CSH，熟石膏） 的复合材料已经在整形外科植入中使用（例如，Damien, C等，J. Biomed. Mat. Res.，1990， 24 :639-654 ;Damien, C 等，Spine，2002,16S :S50-S58 ;Parsons，J.等，Annals Ν·Υ· Acad. Sci.)。当CSH与无菌生理盐水或水混合时，其立即开始胶化。然而在凝胶状态下，HAp、生 长因子和/或各种基体组分可以与CSH混合到一起以形成植入复合材料，其可以插入或注 入到骨缺损中，在该骨缺损处其原位凝固。在这类方法中，CSH首先作为黏合剂。然而，之 后的硫酸钙再吸收为骨长入留下具有空间的多孔基体，该骨长入可以通过已变硬的复合材 料中的生长因子来刺激。相似地，用于递送成骨蛋白的包含CSH、多孔微粒聚合物混合物和 成骨蛋白的组合物是已知的（美国专利5, 385, 887和美国专利申请公布2008/0233165号， 其中每个都通过引用如同完整地说明般并入本文）。在这些方法的每个中，都需要硫酸钙降 解用于生长因子释放。因此，骨再生取决于硫酸钙降解的速率。
[0020] 含有微粒骨和生物相容的包含CSH和磷酸钙产品的固体组分的骨植入物是已 知的，但是骨植入物不涉及使用CSH或磷酸钙作为生长因子载体（美国专利申请公布 2011/0208305号，通过引用如同完整地说明般并入本文）。
[0021] 实际上，在创伤愈合期间，多种GF在不同的时间以变化的浓度存在于创伤部位和 周围组织中。例如，骨折之后即刻，受伤部位的血小板最初会释放大量的roGF，并且在接下 来的几天里骨折部位内的蛋白质水平急剧下降（参见Tyndall等，Clinical Orthopedics and Related Research，2003,408 :319 - 330)。相反地，BMP-2在骨折愈合过程的所有阶段 均表达（参见Rasubala等，British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2003, 41 :173 - 178)，但是 BMP-2 的量随时间变化（参加 Meyer 等，J Bone Jt. Surg2003,85-A : 1243-1254)。估计这些生长因子的浓度比外源性GF的治疗应用期间所使用的生长因子的 浓度低多个数量级，这是由于浓度与细胞需求的匹配以及多种生长因子的协同效应。产生 允许递送具有多相释放模式的生长因子和释放具有不同的释放模式的多种生长因子的体 系会允许使用具有GF释放模式的生物植入物，所述GF释放模式比目前以突然释放或持续 释放来释放单一生长因子的生物植入物更接近地模拟在自然愈合过程中的GF释放。
[0022] 该背景信息是为了使本 申请人:认为的已知信息能够与本发明相关联而提供的。既 不必意欲承认也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
【发明内容】
[0023] 在一个方面，本发明提供一种用于至少一种生长因子在例如处理部位的多相释放 的体系、方法和试剂盒。为此目的，本发明的体系可以提供为生物植入物等。在一个方面， 本发明的方法以最初释放来递送至少一种生长因子，之后以"持续释放模式"递送至少一种 生长因子。本发明利用用于最初释放的递送体系和用于持续释放的载体。
[0024] 在一个方面，相同的生长因子以最初释放模式和持续释放模式进行释放。在另一 个方面，释放不同的生长因子，其中第一生长因子以最初模式释放，第二生长因子以持续释 放模式释放。如会被本领域技术人员所知的，据信两种不同的生长因子以这样不同的方式 释放更接近地模拟处理部位自然的生长因子释放体系。
[0025] 根据本发明的一个方面，提供一种提供至少一种生长因子的持续释放的载体与提 供至少一种生长因子的最初释放的递送载剂的组合。载体和递送载剂的组合产生生长因子 的多相释放模式。在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释 放，其中递送载剂和载体的量以约0.5:1至4.0:1 (V:V)的比例提供。在优选实施方案中， 所使用的递送载剂的量为〇. 5ml至10. 0ml。在特别优选的实施方案中，0. 75ml至2. 5ml的 递送载剂与Icm3的载体一起使用。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和 0. 5cm3的载体。
[0026] 在优选实施方案中，生长因子（"GF"）是转化生长因子β (TGFP)超家族的成员。 在特别优选的实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白（BMP)。
[0027] 在本发明的一个方面，载体（"CAR"）由分散在产生较大结构的聚合物基体中的尺 寸小于80微米、优选小于45微米的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，该结构还包覆有羟磷灰 石层。
[0028] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合前，至少一种GF以液态施加到钙颗粒， 然后被冻干到颗粒上。在一些实施方案中，100%的冻干GF与颗粒相关联。在其他实施方 案中，小于100%的冻干GF与颗粒相关联，其余部分不与颗粒相关联。包含与GF相关联的 颗粒和不与颗粒相关联的冻干GF的这种组合物可以与递送载剂组合，使得未关联颗粒分 布在递送载剂中，在这种情况下之后可以释放该未关联颗粒。
[0029] 在本发明的另一方面，载体通过将一种或更多种磷酸钙粉末与包含至少一种生长 因子的液体溶液混合以生成磷酸钙骨水泥来形成。在一个方面，该骨水泥之后被研磨成具 有至少100微米直径、优选0· 3mm至3mm直径的颗粒。
[0030] 在本发明的另一方面，载体包含一种或更多种钙盐的直径为至少100微米、优选 0. 3_至3_的颗粒。然后，生长因子冻干到载体颗粒的表面上。
[0031] 在优选实施方案中，递送载剂为反相聚合物。在特别优选的实施方案中，反相聚合 物为泊洛沙姆，更特别是泊洛沙姆407(也称作？1111'〇1^(^?127)，浓度为至少12 (%、优选 20 %至40%。在一些特别优选的实施方案中，改变P407和载体的量以影响从载体和任选地 从递送载剂中释放的GF的量。
[0032] 如上所述，在一个方面，载体和递送载剂释放相同的生长因子，而在另一方面，载 体和递送载剂释放不同的生长因子。在本发明的又一方面，载体和递送载剂分别适合于 释放两种或更多种生长因子的组合，载体和递送载剂中的每个释放的组合是相同的或不同 的。
[0033] 因此，在一个方面，本发明提供一种用于生长因子在处理部位的多相释放的体系， 所述体系包括：
[0034] -包含至少一种第一生长因子的递送载剂；和
[0035] -包含至少一种第二生长因子的载体；
[0036] -其中：
[0037] -递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放至少一种第一生长因子；
[0038] -载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放至少一种第二生长因子。
[0039] 在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相释放的方法，所述方法包括：
[0040] -以最初释放模式递送至少一种第一生长因子；
[0041] -以持续释放模式递送至少一种第二生长因子。
[0042] 在又一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0043] -递送载剂组分；
[0044] -与递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0045] -载体组分；和
[0046] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0047] 在又一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0048] -递送载剂组分；
[0049] -载体组分；
[0050] -与递送载剂或载体不相关联的至少一种第一生长因子；和
[0051] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0052] 在一个实施方案中，试剂盒包括至少两个容器，其中第一容器包含递送载剂，第二 容器包含与至少一种第二生长因子和至少一种第一生长因子相关联的载体。在优选实施方 案中，至少一种第一生长因子在递送载剂添加到载体时与递送载剂混合。
[0053] 在一个方面，本发明还提供一种用于例如在处理部位释放至少一种生长因子的体 系、方法和试剂盒，其中硫酸钙"载体"颗粒在其表面容纳至少一种生长因子。为此目的，本 发明的体系可以提供为生物植入物等。
[0054] 在一个方面，本发明的方法以"持续释放模式"递送至少一种生长因子。
[0055] 在本发明的一个方面，载体包含二水合硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物。在优 选实施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
[0056] 在本发明的一些方面，至少一种生长因子从钙载体中以单相释放。在该方面，GF 不由递送载剂释放。在其他方面，至少一种生长因子从钙载体和递送载剂中进行多相释放。 在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释放，其中递送载剂和 载体的量以约0.5:1至4:1 (V:V)的比例提供。在优选实施方案中，所使用的递送载剂的量 为0. 5ml至10. 0ml。在特别优选的实施方案中，每cm3载体使用0. 5ml至2. 5ml的递送载 齐U。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和0. 5cm3的载体。
[0057] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合前，至少一种GF以液态施加到钙颗粒， 然后被冻干到所述颗粒上。
[0058] 在一个实施方案中，冻干GF使得GF中的一部分与载体相关联，GF中的一部分与 载体分开。当递送载剂添加到载体时，分开的GF变得与递送载剂相关联。
[0059] 在优选实施方案中，至少一种GF到钙颗粒上的分布通过改变包含GF的溶液相对 于待冻干到颗粒上的蛋白质的体积来改变。可以通过减少用于递送GF的溶液的体积来使 钙颗粒上结合的GF的量更高。在优选实施方案中，以1:1:0. 5的比例来进行GF到载体颗 粒上的冻干，其中1单位的GF与1单位的溶液混合，并冻干到0. 4单位的载体上。在特别 优选的实施方案中，约I. Omg的GF添加到约I. Oml的溶液中用于冻干到约0. 5cm3的钙颗 粒上。
[0060] 在另一方面，本发明提供一种用于递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0061] -递送载剂组分；
[0062] -包含多个硫酸钙颗粒的载体组分；
[0063] -与载体相关联的至少一种第二生长因子；和任选地
[0064]-与载体不相关联的至少一种第一生长因子，当递送载剂与至少一种第一生长因 子混合时，所述至少一种第一生长因子会变得与递送载剂相关联。
[0065] 在优选实施方案中，试剂盒的载体组分还包含磷酸钙颗粒。在一个特别优选的实 施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
[0066] 在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0067]-递送载剂组分；
[0068]-与递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0069]-包含多个硫酸钙颗粒的载体组分；和
[0070] -与载体相关联的至少一种第二生长因子。
[0071] 在优选实施方案中，试剂盒的载体组分还包含磷酸钙颗粒。在一个特别优选的实 施方案中，硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1或2:1。
【专利附图】
【附图说明】
[0072] 现在，将参考【专利附图】
【附图说明】本发明，所述附图在下文进行简单说明。
[0073] 图1示出了本发明的载体所展现的持续释放模式。
[0074] 图2示出了本发明的递送载剂所展现的最初释放模式。
[0075] 图3示出了基于在递送载剂和载体中生长因子的量的不同的释放模式。当生长因 子并入递送载剂和载体（50-50)两者中时，观察到多相释放模式。
[0076] 图4示出了生物植入物的体内活性，其中生长因子根据本发明的方法如图3中所 示进行释放。
[0077] 图5示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物植入到小鼠中时，新骨（骨） 在磷酸钙颗粒（CaP)上的形成。
[0078] 图6示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物植入到小鼠中时，在载体 (载体）上所形成的新骨（骨）的组织学外观。
[0079] 图7示出了根据本发明的方法所制备的载体所产生的短期持续的生长因子释放 模式。
[0080] 图8示出了持续释放模式如何能够通过改变根据本发明的方法所制备的载体的 性能来进行变化。
[0081] 图9A至9D示出了冻干载体，其中冻干溶液的体积是可变的，但是总的冻干蛋白质 是固定的。图示了处理组I(A)、3 (B)和5(C)。
[0082] 图IOA至IOB示出了在根据本发明的方法制备的生物植入物中使用的磷酸钙（A) 和硫酸钙（B)载体组分周围形成的新骨的组织学外观。
[0083] 发明详沭
[0084] 生长因子（GF)在组织的修复和再生中起着不可或缺的作用，外源性GF可以用于 刺激各种组织和器官的修复。为了使外源性生长因子在刺激修复中有效，必须将它们保持 在需要修复的部位，并防止失活、隔绝或降解。为此使用载体。然而，生长因子从已知载体 的释放不理想，并且不能容易地改变。本发明基于以下发现：i)生长因子从生物植入物的 多相释放增加植入物的功效；和ii)使用硫酸钙作为生长因子载体可以提高含GF的生物植 入物的效力。
[0085] 本发明人已经开发了用于通过改善生长因子在植入部位的释放动力学或释放模 式同时保持生长因子的活性来增强例如生物植入物的功效的方法和材料。在一个方面，本 发明提供一种生长因子递送体系和方法，包括含有至少一种生长因子的载体与也含有至少 一种生长因子的递送载剂的组合。由载体和递送载剂所释放的至少一种生长因子可以是相 同或不同的。
[0086] 在另一方面，本发明提供了一种由于使用包含多个在其表面上包含至少一种GF 的二水合硫酸钙颗粒的载体与可以任选地包含至少一种GF的递送载剂的组合而具有增强 的功效的生长因子递送体系及方法。比较而言，先前的使用硫酸钙作为GF载体的尝试涉及 将硫酸钙颗粒与生长因子合并或用生长因子浸渍硫酸钙颗粒，而不是用GF包覆钙颗粒的 表面。在本发明中，GF释放不需要硫酸钙降解。
[0087] 在优选实施方案中，改变载体和递送载剂的量以控制至少一种GF的释放，其中递 送载剂和载体的量以约0.5:1至4.0:1 (v:v)的比例提供。在优选实施方案中，所使用的递 送载剂的量为〇. 5ml至10. Oml。在特别优选的实施方案中，每cm3载体使用0. 5ml至2. 5ml 的递送载剂。在特别优选的实施方案中，使用I. Oml的递送载剂和0. 5cm3的载体。
[0088] 在一个实施方案中，在与聚合物基体组合以产生载体结构体之前，至少一种GF以 液态施加到小（〈80微米）的钙颗粒，然后被冻干到颗粒上。
[0089] 在另一个实施方案中，GF以液态施加到到大（>100微米）的颗粒，然后与颗粒一 起冻干，生成与颗粒相关联的GF和游离GF的分布。
[0090] 在优选实施方案中，通过改变包含GF的溶液相对于在冻干之前与之一起培养的 颗粒的量的体积来改变至少一种GF在与颗粒相关联和与颗粒分开或"游离于"颗粒之间的 分布。可以通过减少用于递送GF的溶液的体积来使颗粒上结合的GF的量更高。在优选实 施方案中，以1:1: 〇. 5的比例来进行GF到载体颗粒上的冻干，其中1单位的GF与1单位的 溶液混合，并冻干到4单位的载体上。在特别优选的实施方案中，约I. Omg的GF添加到约 I. Oml的溶液中用于冻干到约0. 5cm3的钙颗粒上。
[0091] 本发明的体系和方法能用于各种治疗和临床应用，包括骨折修复；骨植入；脊柱 融合；以及头骨、下颌骨和骨缺损的再生。对于这些应用，本发明的体系优选提供在生物植 入物上或以生物植入物的形式提供。
[0092] 定义
[0093] 除非下文另外定义，本文所使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所理解的相同的意思。
[0094] 如本文所用，术语"生物植入物"是指适合于植入的材料，并且含有外源性生长因 子或生物活性因子。如本文进一步讨论的，本发明的体系优选通过对生物植入物施加所述 物质来使用。然后在对象体内提供生物植入物，其中所述体系以多相释放模式释放至少一 种生长因子。
[0095] 如本文所用，术语"生长因子"是指通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺 激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白（BMP)、转化 生长因子β (TGFP)、胰岛素样生长因子（IGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、血小板衍生生 长因子（PDGF)和血管内皮细胞生长因子。在优选实施方案中，生长因子是BMP。
[0096] "重组体"表示由瞬时转染的、稳定转染的或转基因的宿主细胞或者动物所产生的 蛋白质，所述宿主细胞或者动物受含有关于所述蛋白质的cDNA的表达结构控制。术语"重 组体"还包括这种多肽的可药用盐。
[0097] 如本文所用，术语"多肽"或"蛋白质"是指氨基酸单体的聚合物，所述氨基酸单体 为通过酰胺键连接在一起的α氨基酸。因此，多肽的长度为至少两个氨基酸残基，并且通 常更长。一般地，术语"肽"是指长度上仅有很少氨基酸残基的多肽。与肽相反，多肽可以 包含任意数量的氨基酸残基。因此，术语多肽包括肽以及更长的氨基酸序列。
[0098] 如本文所用，术语"骨形态发生蛋白"或"骨形态生成蛋白"或"BMP"可相互交换地 使用，并且是指生长分化因子的转化生长因子β (TGFP)超家族中骨形态发生蛋白（BMP) 亚家族的任何成员，包括BMP-2、BMP-3 (也称作成骨素）、BMP-3b (也称作生长分化因子10， ⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(也称作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8(也称作成骨蛋 白-2, 0P-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-Il (也称作生长分化因子-8,⑶F-8,或者肌生长抑制蛋 白）、BMP-12 (也称作生长分化因子-7,⑶F-7)、BMP-13 (也称作生长分化因子6,⑶F-6)、 BMP-14(也称作生长分化因子5,⑶F-5)和BMP-15。
[0099] 术语"骨形态发生蛋白"和"BMP"还包括BMP的等位基因变异体、BMP的功能保守 变异体和保持BMP活性的突变BMP。这种变异体和突变体的BMP活性可以通过本领域众所 周知的任何方法（参见下文中测量BMP活性的分析的章节）或如实施例1所说明的进行确 定。
[0100] 在优选实施方案中，BMP 是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。 在特别优选的实施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0101] 在优选实施方案中，BMP是哺乳动物的BMP (例如哺乳动物的BMP-2或哺乳动物的 BMP-7)。在特别优选的实施方案中，BMP是人类的BMP (hBMP)(例如hBMP-2或hBMP-7)。
[0102] 如本文所用，术语"支架"是指其目的为提供支持细胞附着、迁移以及向内生长到 组织修复部位内的结构体的材料。
[0103] 如本文所用，术语"载体"是指包含单一或多种组分的材料，并且适合于在一段时 间内以"持续释放"模式在处理部位释放至少一种生长因子。在一个方面，载体释放至少一 种生长因子的时间段为几天至几周。优选地，载体适合于在几周的时间段内释放至少一种 生长因子。
[0104] 在优选实施方案中，载体也用作支架或基体。如上所述，在本发明的一个方面，载 体由分散在大孔聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体还包覆 有羟磷灰石层。在本发明的另一方面，载体由硫酸钙颗粒形成。在本发明的又一方面，载体 为硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物。在一个实施方案中，在将颗粒与聚合物基体组合之 前，将至少一种生长因子以液态施加到钙颗粒，然后冻干到颗粒上。在优选实施方案中，载 体是固体。
[0105] 如本文所用，术语"递送载剂"是指用于运送载体的材料。在本发明的一个方面， 递送载剂包含至少一种生长因子，或者变得与至少一种生长因子相关联，并适合于在一段 时间内以最初释放模式在处理部位释放至少一种生长因子。在其他方面，递送载剂最初不 包含生长因子。而是，其之后在使用前同与载体不相关联的GF组合，从而产生GF释放的最 初相。在一个方面，递送载剂释放至少一种生长因子的时间段为几小时至几天。在本发明 的一个优选实施方案中，递送载剂以持续几个小时的"最初释放"或"最初释放模式"释放 大部分的至少一种生长因子。优选地，递送载剂适合于在72小时的时间段内释放至少80% 其中包含（或与其相关联）的生长因子。在优选实施方案中，递送载剂为液体或凝胶。
[0106] 在一个方面，本发明的递送载剂可以用于使载体颗粒容易处理，其中载体和递送 载剂的组合导致凝胶或膏状物的形成。
[0107] 在一个方面，形成递送载剂的材料是凝胶形式的。在优选实施方案中，递送载剂为 反相聚合物。如本文所用，术语"反相"是指凭借其聚合物进行从液体到凝胶的可逆温度依 赖转变的性质。在一个方面，转变温度为15°c至37°C。优选地，转变温度为15°C至25°C。 如本领域技术人员会知道的，"正相"材料随着温度降低其黏度增加。相反地，反相材料随着 温度降低到其转变温度以下显示出黏度降低。
[0108] 在特别优选的实施方案中，反相聚合物为泊洛沙姆，更具体地是Pluronic? F127 (也被称为泊洛沙姆407或P407)。
[0109] 在特别优选的实施方案中，P407聚合物溶液为20%至40%的。
[0110] 在优选实施方案中，改变在生物植入物中使用的载体和递送载剂的量以影响从生 物植入物中释放的GF的量。
[0111] 如本文所用，术语"持续释放"或"持续释放模式"是指在几天或几周的时间段内 由载体释放至少一种生长因子，其中在最初时间段释放的量相似于或低于植入的几天或几 周后相同时间段释放的量。优选地，持续释放模式持续至少一周。如本领域技术人员会理 解的，一般地，在前三天内以持续释放模式释放的生长因子的量会低于在之后七天内释放 的量。
[0112] 如本文所用，术语"最初释放"或"最初释放模式"是指由递送载剂最初释放大量 的至少一种生长因子，然后在几小时或几天的时间段内释放逐渐降低的量。在一个方面，最 初释放模式导致在大约72小时的时间段内递送至少80%的负载的生长因子。最初释放模 式图示于图2中。
[0113] 如本文所用，术语"多相释放"是指在最初释放时间段内最初释放至少一种生长因 子，然后在第二时间段内"持续"释放至少一种生长因子。优选地，最初时间段是大约几个 小时，第二时间段是大约几天到几周。这种释放模式还可以称为"双相释放"，这是因为其在 两个阶段进行。在优选实施方案中，最初释放由本发明的递送体系提供，"持续"释放由本发 明的载体提供。
[0114] 如本文所用，术语"效力"是指按照产生指定强度的效果需要的量表达的药物活性 的量度。
[0115] 在本发明的一个方面，递送载剂组分包含由本发明的体系递送的生长因子总量的 至少10%但不超过50%，载体组分包含由所述体系递送的生长因子总量的至少50%。
[0116] 测量BMP活件的分析
[0117] 对重组的BMP的体外和体内功能进行表征的分析在本领域是众所周知的（参 见例如美国专利4, 761，471号；美国专利4, 789, 732号；美国专利4, 795, 804号；美国专 利4, 877, 864号；美国专利5, 013, 649号；美国专利5, 166,058号；美国专利5, 618, 924 号；美国专利5, 631，142号；美国专利6, 150,328号；美国专利6, 593, 109号；Clokie和 Urist，Plast. Reconstr. Surg. 2000 ; 105 :628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ; 19 :3314-3324 ; Vallejo 等，J. Biotech. 2002 ;94 :185-194 ;Peel 等，J. Craniofacial. Surg. 2003 ;14 : 284-291 ;以及 Hu 等，Growth Factors，2004 ;22 :29-33)。
[0118] 这类分析包括：对植入（例如植入后腿及臀部肌肉或胸的区域）进啮齿动物（例 如大鼠或小鼠）后BMP的骨诱导活性进行定量的体内分析（参见例如美国专利4, 761，471 号；美国专利4, 789, 732号；美国专利4, 795, 804号；美国专利4, 877, 864号；美国专利 5, 013, 649号；美国专利5, 166, 058号；美国专利5, 618, 924号；美国专利5, 631，142号； 美国专利 6, 150, 328 号；美国专利 6, 503, 109 ;Kawai 和此18七，（：1111.0竹11〇口.1^1&七· Res. ,1988 ;222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr. Surg. 2000 ;105 :628-637 ; 以及Hu等，Growth Factors, 2004 ;22 :29-33);对再生哺乳动物中头骨环锯缺损的BMP活 性进行定量的体内分析（例如大鼠、狗或猴）（参见例如美国专利4, 761，471号和美国专 利4, 789, 732号）；对诱导体外培养的软骨细胞增殖的BMP活性进行定量的体外分析（参 见例如美国专利4, 795, 804号）；对诱导体外培养的肌肉细胞（例如C2C12细胞，ATCC编 号CRL-1772)或骨髓基质细胞（例如鼠的W-20细胞，ATCC编号CRL-2623)中碱性磷酸 酶活性的BMP活性进行定量的体外分析（参见例如美国专利6, 593, 109号；Ruppert等， Eur J Biocheml996;237 :295-302 ;Kirsch 等，EMBO J，2000; 19 :3314-3324 ;Valle jo 等，J Biotech，2002 ;94 :185-194 ;Peel 等，J Craniofacial Surg.，2003 ;14 :284-291 ;以及 Hu 等，Growth Factors，2004;22:29-33);对诱导培养的间质祖细胞系（例如鼠的C3H10T1-2 细胞）中FGF-受体2 (FGFR3)表达的BMP活性进行定量的体外分析（参见例如Valle jo等， J Biotech2002;94:185-194);对诱导鸡枝芽细胞中蛋白多糖合成的BMP活性进行定量的 体外分析（参见例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ;237 :295-302);以及对诱导骨髓基 质细胞（例如鼠的W-20细胞；ATCC编号CRL-2623)中骨钙素治疗的BMP活性进行定量的 体外分析（参见例如美国专利6, 593, 109号）。
[0119] 测量BMP结合与释放的分析
[0120] 各种分析可以用于测量来自载体的重组BMP的结合与释放。例如，重组BMP蛋白 质的量可以通过本领域中众所周知的任何技术进行定量，包括斑点印迹、免疫分析（例如 酶联免疫吸附分析，ELISA)、当生物植入物包含放射标记的BMP时释放缓冲剂中出现的放 射性增加的测量以及色谱法（例如高压液相色谱、HPLC和离子交换色谱）。
[0121] 这类方法在本领域中是众所周知的（参见例如Harlow和Lane，Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999 ； Gosling 编著，Immunoassays ：A Practical Approach, Oxford University Press, 2000 ； Oliver 编著，HPLC of Macromolecules ：A Practical Approach, Oxford University Press, 1998 ;Millner 编著，High Resolution Chromatography ：A Practical Approach, Oxford University Press,1999 ；Hockfield 等，Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993 ；Gore 编 著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry ：A Practical Approach, Oxford University Press,2000)。
[0122] 例如已经描述了 BMP蛋白质的放射免疫实验分析的方案（参见例如美国专利 4, 857, 456号）。例如已经描述了 BMP蛋白质的免疫印迹分析的方案（参见例如Wang等， Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:2220-2224)。例如用于人类、大鼠或小鼠 BMP-2 的蛋 白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从R&D Systems (目录#DBP200、 PDBP200或SBP200)。例如用于人类BMP-7的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商 业购买的，例如从R&D Systems (目录#DY354或DY354E)。
[0123] 试剂盒
[0124] 在一个方面，本发明提供一种用于包含本文所描述体系的试剂盒。在一个实施方 案中，试剂盒包含用于制造递送载剂和载体以及所需的生长因子的必需组分。即，本发明的 试剂盒会包括必需组分以制造递送载剂和载体以及与递送载剂相关联或之后会变得与其 相关联的至少一种生长因子和与载体相关联的至少一种生长因子。
[0125] 试剂盒优选地包括含有其上可以负载或包覆相关联的生长因子的载体的容器。
[0126] 优选地，递送载剂和任何相关联的生长因子保持在不同的容器中，其可以在使用 时组合。这在递送载剂可以包含液体或凝胶的情况下会是特别优选的。在这种情况下，当 递送载剂包含相关联的生长因子与液体或凝胶两者时，相关联的生长因子可以以冻干粉末 保持在不同的容器中。在使用时，粉末形式的生长因子可以与液体或凝胶递送载剂组合。
[0127] 在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少三个容器用于以下的每一 个：1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子（即与递送载剂相关联的生长因子）；和 3)载体和至少一种第二生长因子（即与载体相关联的生长因子）。使用时，将粉末形式的 至少一种第一生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后将该混合物施加到其上预 负载有至少一种第二生长因子的载体。
[0128] 在另一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少两个容器，分别包含以 下组分：1)递送载剂组分；和2)硫酸钙载体和与载体相关联的至少一种生长因子以及不与 载体相关联的其他生长因子。使用时，将液体或凝胶形式的递送载剂施加到载体和相关联 的GF(结合的或负载的GF)并施加到不与载体相关联的生长因子（"游离"GF)。于是游离 GF变成并入到递送载剂中。
[0129] 在一个优选的实施方案中，载体由硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物构成。在本 发明特别优选的实施方案中，载体由比例约为1:1或2:1的硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混 合物构成。优选地，载体包覆有至少一种生长因子。
[0130] 在又一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包括至少三个容器用于以下的每 一个：1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子（即与递送载剂相关联的生长因子）；和 3)硫酸钙载体和至少一种第二生长因子（即与载体相关联的生长因子）。使用时，将粉末 形式的至少一种第一生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后将该混合物施加到 其上预负载有至少一种第二生长因子的载体。
[0131] 在一个优选的实施方案中，载体由硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混合物构成。在本 发明特别优选的实施方案中，载体由比例约为1:1或2:1的硫酸钙颗粒和磷酸钙颗粒的混 合物构成。优选地，载体包覆有至少一种生长因子。
[0132] 在一个方面，本发明的试剂盒根据可能的需要可以包括任何必需的试剂和/或仪 器和/或说明和/或器皿。 实施例
[0133] 现在会通过以下实施例来描述本发明。这些实施例说明了本发明人的新发现，即 生长因子例如rhBMP-2的多相释放模式比仅产生突然释放或持续释放的载体更有效，所述 多相释放模式通过在以持续释放来释放BMP的载体内负载部分的BMP和在以最初释放来释 放BMP的递送载剂内负载部分的BMP而产生。这些实施例还说明了在改善的用于提高生物 植入物的效力的体系、方法和组合物中，二水合硫酸钙或者二水合硫酸钙和磷酸钙的混合 物可以用作生长因子如BMP的载体。
[0134] 如会对本领域技术人员明显的，能够在载体内放置一种生长因子，在递送载剂内 放置不同的生长因子，产生各生长因子不同的释放模式。
[0135] 会理解，本文所提供的实施例仅意欲说明本发明，并不以任何方式限制本发明的 范围。同样地，本发明不限于本文所描述的任何特别优选的实施方案。事实上，在阅读本说 明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员可以是明显的。因此，本发明仅受所附 的权利要求以及权利要求享有权利的等同物的完整范围限制。
[0136] 实施例1 :通讨在PLGA中何封制诰含有BMP的持续释放复合载体
[0137] 该实施例示范如何形成含有rhBMP-2的载体，其以持续释放模式释放生长因子。
[0138] 材料和方法
[0139] 比浓对数黏度为 I. 33dL/g 的 PLGA 75/25 (MW = 205000-210000)购自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四I丐（TTCP)从 Taihei Chemical Industrial Co.(大 阪，日本）获得，无水憐酸二I丐（DCPA)和二甲亚讽（DMSO)从Taihei Chemical Industrial Co. (MO, USA)获得。糖颗粒购自 Tate&Lyle North America Inc.(多伦多，加拿大）。
[0140] 可再吸收的磷酸钙颗粒通过在100%的相对湿度混合等摩尔的TTCP和DCPA与去 离子蒸馈水（ddH 20) 24小时进行制备。反应物进行研磨并通过45 μ m的筛进行筛分。
[0141] 重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂（I. 5mg/ml，pH 4.5;5mm谷氨酸,2.5%甘氨酸,0.5%鹿糖和0.01%TweenTM80与ddH20)中进行制备。蛋白 质溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并搅拌至少15分钟。然后，粉末进行冷冻并冻干。
[0142] 然后，将具有BMP的颗粒（CaP-BMP)或没有BMP的颗粒（CaP)用于通过如下的相 转化/颗粒浙滤来制造 CaP颗粒-PLGA支架块：将PLGA以11. 5 % (w/v)的浓度溶于DMS0。 CaP和CaP-BMP颗粒按照2:1 (w/w)的CaP/PLGA比例充分混合入该溶液。尺寸范围为0. 85mm 至I. 18mm的糖晶体分散于CaP/PLGA中，混合物在-18°C下在模具中进行固化。PLGA沉淀， 糖晶体通过三次更换CldH 2O浸洗来滤出。
[0143] 羟磷灰石层如下沉积到大孔复合支架上并遍及大孔复合支架：干燥的PLGA/CaP 圆柱（测量直径2mm和长2mm)在70 %的乙醇中预湿润，并在37 °C下浸入60ml的3 X SBF 中9天时间。SBF如下制备：在剧烈搅拌下，向I. 8L的CldH2O中依次加入以下盐：29. 711g NaCl，2.206g CaCl2-2H20，10ml IM HCl，0.852Na2HP04。最终体积达到 2L。每天更换 SBF 溶 液。包覆之后，3PCC样品在CldH2O中进行漂洗，并空气干燥。
[0144] 这导致形成能够在至少七天内以持续释放模式释放rhBMP-2的大孔复合载体 (3PS)。这些结果图示于图1中。
[0145] 实施例2 :通讨在磷酸钙骨水泥中何封制诰含有BMP的持续释放载体
[0146] 本实施例示范如何形成具有持续释放模式的含有rhBMP-2的磷酸钙骨水泥（CPC) 载体。
[0147] 材料和方法
[0148] 憐酸四I丐（TTCP)从 Taihei Chemical Industrial Co.(大阪，日本）获得，无 水磷酸二Ii(DCPA)从Sigma Chemical Co获得。大孔双相磷酸|丐颗粒（Eclipse)购自 Citagenix (Laval Qc，加拿大）。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在 配制缓冲剂（1.5mg/ml，pH 4.5;5mm 谷氨酸，2.5(%甘氨酸，0.5(%鹿糖和0.01(%1￥6611 11180 与(IdH2O)中进行制备。
[0149] 可再吸收的磷酸钙骨水泥颗粒通过混合等摩尔的TTCP和DCPA与rhBMP-2溶液来 制备。反应物进行研磨，并通过300 μ m和100 μ m的筛进行筛分,保留100 μ m至300 μ m的 颗粒。
[0150] 这导致形成rhBMP-2并入其中的磷酸钙骨水泥载体颗粒。在植入进动物中后，BMP 在至少几周的时间内以持续的方式进行释放。
[0151] 为了生成也用作大孔支架的基于CPC的持续释放载体，CPC颗粒（0. Imm至0. 3mm) 与大孔磷酸I丐颗粒（lmm至2mm)以1:1的比例（w/w)进行混合。
[0152] 实施例3 :通讨#用结合BMP的何覆层制诰含有BMP的持续释放载体
[0153] 本实施例示范如何通过应用结合BMP的包覆层来形成具有持续释放模式的载体。 一种这样的方法是如在我们的共同待决的申请号美国申请13/002, 444号（其全部内容通 过引用并入本文）中所述的用抗体或结合BMP的蛋白包覆载体。
[0154] 材料和方法
[0155] 纯净的多克隆兔抗人类BMP-2抗体购自Cell Sciences (Canton MA.，目录 #PA0025)。大孔双相磷酸I丐（BCP)颗粒（Eclipse)购自 Citagenix(Laval, Qc，加拿大）。
[0156] 在生物安全柜中称出无菌BCP颗粒，并置于无菌TPP管（Mandel Scientific， Guelph 0N，加拿大）中。抗体溶液在磷酸盐缓冲的盐水中稀释至最终浓度为Iml PBS中 150ng、300ng和600ng抗体，过滤灭菌，并以I: lv/v的比例应用到载体。在进行冷冻和冻干 前，样品在室温下搅拌至少15分钟。然后，BMP溶液应用到颗粒，允许在室温下浸渍15分 钟，然后进行冷冻和再冻干。
[0157] 这导致形成覆盖有结合并以持续方式缓慢释放rhBMP-2的抗体的BCP颗粒。
[0158] 能够结合的rhBMP-2的量能通过增加所用抗体的量来增加。释放的速率能够通过 使用具有更低的亲和性或亲和力的抗体来增加。
[0159] 实施例4 :#用F127制各含BMP的递送载剂
[0160] 本实施例示范如何使用F127制备含有rhBMP-2的递送载剂。
[0161] 材料和方法
[0162] 泊洛沙姆如下进行制备：100ml的蒸馏水冷却到4°C，随着搅拌在几个小时的时间 内缓慢添加各种量的泊洛沙姆407,直到所有固体颗粒都溶解，使最终溶液为12%至33%。 然后，泊洛沙姆溶液在高压灭菌器中进行灭菌（121°C，20分钟，30psi)。在灭菌后，泊洛沙 姆溶液在4°C下保存直到使用。
[0163] 冻干的重组人类BMP-2粉末（rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆 溶液，并缓慢地混合。
[0164] 或者，rhBMP-2 以 1/10 或 l/20(v/v)的比例从溶液（lmg/ml，pH 4. 5 ;5mm谷氨酸， 2. 5 %甘氨酸，0. 5 %蔗糖和0. 01 %吐温80)添加。
[0165] 这导致形成在前两天释放超过80%的rhBMP-2的递送载剂（如图2中所示）。
[0166] 实施例5 :具有多相释放樽式的牛物棺入物的制各
[0167] 本实施例示范如何形成以多相释放模式来释放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。
[0168] 材料和方法
[0169] 制备每5mg载体含有0 μ g、4. 55 μ g或9. 1 μ g的rhBMP-2的3PS载体（如实施例 1所述），并储存于Eppendorf管中。在45. 5μ 1的F127中含有0yg、4. 55yg或9. Iyg 的rhBMP-2的递送载剂（如实施例4所述制备的）在4°C储存于Eppendorf管中。在使用 之前即刻将F127移液到3PS载体上，并且载体混合到递送载剂中。
[0170] 然后，该3PS-F127生物植入物如下文所述用于测量体外BMP释放以及体内骨形成 活性。
[0171] 载体与递送载剂的比例可以改变以产生凝胶（1:1比例V:v)或膏状物（2:1比例 V:V)。另外，BMP与载体的比例或载体的颗粒尺寸可以改变以改变持续释放模式。最终，载 体和递送载剂中rhBMP-2的量可以改变以改变与之后几周释放的量相比在前几个小时最 初释放的rhBMP-2的量。
[0172] 实施例6 :来自牛物棺入物的BMP释放的体外分析
[0173] 本实施例描述了如何测量来自实施例1至5中所述的各种生物植入物的rhBMP-2 的释放。
[0174] 材料和方法
[0175] 如实施例1至5中所制备的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物转移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的总量为相对于每5mg载体以及45. 5 μ 1的F127的9. 1 μ g 的rhBMP-2,或者相对于每IOmg载体以及100 μ 1的F127的20 μ g的rhBMP-2。
[0176] 然后，样品在37°C在搅拌下利用Iml包含磷酸盐缓冲盐溶液（PBS)+1 % BSA的释 放缓冲溶液进行培养。在不同时期（例如1、2、5、7和10天）后，移除缓冲剂，并替换为新 鲜的释放缓冲剂，然后将收集的溶液在_20°C下储存于I. 5ml的小瓶中用于进一步的分析。
[0177] 使用商业的 ELISA (Quantikine? hBMP_2ELISA，RnD Systems)测量释放到缓冲剂 中的BMP-2的量。ELISA根据制造商的说明来实施。
[0178] 结果
[0179] 在从任何未负载BMP的生物植入物所收集的释放缓冲剂中没有可以检测到的 BMP。已经负载rhBMP-2的载体样品证实在研究期间持续释放rhBMP-2,而仅在递送载剂中 的样品以"最初释放模式"进行释放。
[0180] 当载体和递送载剂组合时，根据BMP所负载入的组分获得各种释放模式。当100% 的rhBMP-2(9. 1 μ g)负载在之后与33%的F127(45. 5μ 1)混合的3PS(5mg)载体内时，BMP 释放模式与持续形式匹配，其中在前两天释放的BMP的量为5ng，在第3天至第5天其为 8ng，在第5天至第7天其为IOng (图3 ;100-0)。
[0181] 当100%的rhBMP-2(9. Iyg)负载在33%的F127(45. 5μ 1)内，然后与其中没有 BMP的3PS载体（5mg)混合时，BMP被释放，其中释放的BMP的量在第一天为2363ng，在第 二天为381ng，然后在第三天为12ng (图3 ;0-100)。
[0182] 当BMP分布在载体和递送载剂之间时，生物植入物证实双相释放模式，其中在中 等最初释放之后是BMP的持续释放（图3 ;50-50)。
[0183] 实施例7 :测试释放的BMP的活件的体外分析
[0184] 本实施例描述了如何确定从生物植入物释放的rhBMP-2是否保持其活性。为了 证实释放的rhBMP是生物活性的，应答细胞可以与释放物一起培养，并测量其对生长因 子的应答。这种分析在本领域中是已知的（参见Peel等，J. Craniofac. Surg. 2003,14 : 284-291)。
[0185] 材料和方法
[0186] 制备如实施例1至5中所述的具有或没有rhBMP-2的材料。释放物如实施例 3中所述进行制备，除了缓冲剂是具有15%的胎牛血清和抗生素的α最小必需培养基 (aMEM+15% FBS+AB) 〇
[0187] C2C12细胞以0. 5Χ IO5细胞/ml接种到24孔组织培养板中，每孔Iml α ΜΕΜ+15% FBS。在24至72小时的各种时期后，除去培养基并应用各种释放物。阴性对照包括利用 新鲜的aMEM+15% FBS+AB培养的C2C12细胞。阳性对照包括利用含有25ng/ml、50ng/ ml 和 100ng/ml 的 rhBMP-2 的 α MEM+15 % FBS+AB 培养的 C2C12 细胞。48 小时后，细胞 在Iml细胞溶解缓冲剂（Cellytic Sigma Aldrich)中溶解，使用对硝基苯酚磷酸盐分析 物（Sigma Aldrich)测量细胞溶解物的碱性磷酸酶（ALP)活性。使用Coomassie Plus Reagent(Fisher)测量溶解物的细胞蛋白含量，并将其用于对每孔的细胞数标准化ALP活 性。
[0188] 一般地，为了确定是否在与载体或递送载剂相结合时已经有BMP活性的任何损 失，确定未与载体或递送载剂相结合的rhBMP-2标准物的ALP/PTN结果的标准活性曲线。释 放物中活性rhBMP-2的浓度可以从该标准曲线进行确定，其表达为如通过ELISA测定的释 放物中存在的rhBMP-2总量的百分比。
[0189] 实施例8 :多相BMP棺入物的骨诱导活件的评价
[0190] 本实施例描述了如何测定含有BMP的生物植入物的体内骨诱导活性。为了评价生 物植入物诱导骨形成的活性，使用小鼠肌袋分析。在该模型中，生物植入物置于在小鼠后肢 中制造的肌袋中，形成的诱导骨的尺寸与试验的BMP的量成比例。这种分析在本领域是已 知的（参见例如 Barr 等，Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod.，2010 ; 109 :531-40)。
[0191] 材料和方法
[0192] 生物植入物如实施例I和5中所述进行制备。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶-I 小鼠的后肢的大腿肌肉中通过钝器解剖制造双侧的袋。然后，生物植入物置入已经置入肌 袋的无菌胶囊中。将肌肉拉到一起，用Mitchel夹使皮肤闭合。
[0193] 动物在术后第28天进行安乐死。收获后肢，并用10%缓冲的福尔马林进行固定。 固定之后，试样使用微CT扫描仪（General Electric Healthcare eXplore? Locus SP)进 行成像。扫描样品，并使用制造商软件在59μπι的分辨率下重构。图像重构之后，确定感兴 趣的区域（ROI)。该区域包括含有生物植入物诱导的骨的所有区域。根据位置和密度这些 可以简单地与骨骼骨进行区分。
[0194] 为了分析ROI内的骨的数量和质量，mCT图像的体素区分为骨和非骨的相。区分 通过确定体素灰度的阈值来实现，在所述阈值体素视为骨。对每个样品测定ROI的总体积 (TV)、骨体积（BV)、总体积的矿物质密度（TV-MD)、骨体积的矿物质密度（BV-MD)、总体积的 矿物质含量（TV-MC)、骨体积的矿物质含量（BV-MC)和骨体积分数（BVF)。对于由于载体 引起的钙的存在，通过使用仅选择载体的阈值上限并将其从使用包括载体加新骨的阈值下 限获得的数值中扣除来校正数值（参见Humber等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology. 2010. 109 :372-384)。
[0195] 在微CT分析完成之后，试样或者包埋在spurs树脂中，或者在甲酸中脱钙并包埋 在石蜡中。树脂包埋的样品通过背散射SEM进行评价，而将石蜡包埋的样品进行切割并利 用苏木精和曙红（H&E)进行染色，并通过光学显微镜进行检查，以评价植入部位存在的组 织类型。
[0196] 益果
[0197] 载体和递送载剂如实施例5所述进行组合。
[0198] 微CT分析显示，所有BMP都在3PS载体内的生物植入物生成最小的骨小骨，所述 生物植入物具有持续BMP释放模式（图4 :100-0)，所有BMP都在F127递送载剂内的生物 植入物生成中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP释放模式（图4 :0-100)，而 50% BMP负载入载体并且50%负载入递送载剂的生物植入物生成最大的骨小骨，所述生物 植入物具有多相BMP释放模式（图4 :50-50)。
[0199] 背散射SEM显示，到28天时骨遍及生物植入物形成以及形成到已经并入PLGA的 磷酸钙颗粒上（图5)。组织学确认所形成的组织是骨（图6)。
[0200] 实施例9 :来自牛物棺入物的BMP释放的活体分析
[0201] 本实施例描述了如何测量植入后从实施例1、2、3、4或5中所述的各种生物植入物 到动物中的rhBMP-2的释放。为此的方法在本领域是众所周知的。例如参见Uludag等，J Biomed Mater Res，46,193 -202,1999。
[0202] 材料和方法
[0203] 重组的hBMP-2通过珀金埃尔默（Perkin Elmer)用碘125(1-125)进行放射性标 记。放射性标记的rhBMP-2 (强放射性的）与未标记的rhBMP-2 (无放射性的）混合，以产 生1:100的强放射性的无放射性的混合物。
[0204] 含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如实施例1至5中进行制备。然后，这些生物 植入物如实施例8中所述植入到动物中。在各个时间段，宰杀动物并切出植入物部位。然 后对切出的组织称重，放射性的量使用Y计数器进行测定。
[0205] 为了确定计数是否与蛋白质相关，组织在0.5ml PBS+0. 5% BSA中均匀化。两ml 冰冷的10%三氯乙酸加入匀浆中，然后在4°C保持至少1小时。然后，离心匀浆，并移除上 层清液。然后，沉淀物的放射性使用Y计数器进行测量。
[0206] 与植入物相关的放射性对衰减进行校正，估计保持在植入物中的BMP的总量。
[0207] 实施例10 :具有短持续释放樽式的载体的制各
[0208] 本实施例描述了制备以短持续释放模式来释放生长因子的载体的手段。
[0209] 材料和方法
[0210] 大孔双相磷酸I丐（BCP)颗粒（Eclipse)购自Citagenix (Laval, Qc,加拿大）。重 组的人类 BMP_2(rhBMP-2，Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂（I. 5mg/ml，pH 4. 5 ;5mm 谷氨酸，2. 5%甘氨酸，0. 5%蔗糖和0. 01% TWeenTM80与ddH20)中进行制备。
[0211] 无菌的rhBMP-2溶液在摇动下以9. 1 μ g每5mg或4. 55 μ g每5mg (BMP每BCP)的 比例与无菌BCP颗粒一起培养15分钟。然后，样品进行冷冻并无菌冻干。
[0212] 冻干之后，载体称为5mg的等分部分，并置于无菌的Eppindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45. 5 μ 1)。然后，BMP释放模式如实施例6中所述进行测定。
[0213] 益果
[0214] 未用F127包覆的载体（BCP)显示突然释放模式，其中在第一天释放大量ΒΜΡ，然后 在每一之后的时间点释放减少量的BMP。在F127内混合BCP (BCP-Pol)产生短期的持续释 放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (图7)。
[0215] 实施例11 :改夺载体的持续释放樽式
[0216] 本实施例描述改变载体的释放模式的手段。
[0217] 材料和方法
[0218] 具有不同比浓对数黏度和分子量的PLGA购自Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL)。然后，载体如实施例1所述使用这些PLGA来制造。这些载体的BMP释 放模式根据实施例6的方法进行测定。
[0219] 益果
[0220] 所有载体产生持续释放模式。然而，释放的BMP的量根据所用PLGA的黏度/分子 量而不同。以低黏度PLGA(Pol-I)制造的载体在研究期间的12周内比使用高黏度（Pol-2) PLGA的那些释放更多的rhBMP-2 (图8)。
[0221] 实施例12 :在冻干期间改夺结合蛋白质和未结合蛋白质的分布
[0222] 本实施例描述了一种通过改变冻干溶液的体积但是保持总的蛋白质和载体含量 固定来改变蛋白质在与载体颗粒结合的冻干物和未结合的冻干物之间的分布的手段。该手 段允许在递送载剂之后添加到冻干容器中时蛋白质在载体关联的蛋白质和递送载剂关联 的蛋白质之间分布。
[0223] 材料和方法
[0224] 实验设计：为了测试改变在冻干之前添加到载体的蛋白质缓冲液的体积对冻干材 料的分布的影响，改变载体与液体蛋白质的体积比，而蛋白质（牛血清蛋白，"BSA"）的量和 载体的量分别固定在Img和400mg。
[0225] 基于以上标准，研究设计为如表1中所述，其中改变添加的蛋白质溶液的体积（即 2. Oml/瓶、I. 5ml/瓶、I. Oml/瓶、0· 75ml/瓶和0· 5ml/瓶）和添加的蛋白质的浓度（0· 5mg/ ml、0. 67mg/ml、l. 0mg/ml、l. 33mg/ml 和 2. Omg/ml) 〇
[0226] 表I :实验设计
[0227]
【权利要求】
1. 一种用于在处理部位释放至少一种生长因子的体系，所述体系包含： a) 包含至少一种生长因子的载体，其中所述载体适合于以持续释放模式释放所述至少 一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，所述颗粒在其表面上包含所述至少一种生长 因子，并且其中所述多个颗粒包含二水合硫酸钙；和 b) 递送载剂。
2. 根据权利要求1所述的体系，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
3. 根据权利要求2所述的体系，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约1:1 或 2:1。
4. 根据权利要求1所述的体系，其中，所述递送载剂包含聚合物。
5. 根据权利要求4所述的体系，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
6. 根据权利要求5所述的体系，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
7. 根据权利要求6所述的体系，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为：骨形态 生成蛋白（BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、 血小板衍生生长因子（PDGF)或血管内皮生长因子（VEGF)。
9. 根据权利要求8所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为BMP。
10. 根据权利要求9所述的体系，其中，所述至少一种生长因子为BMP-2或BMP-7。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的体系，其中， i) 所述递送载剂适合于在第一时间段以持续释放模式释放至少一种第一生长因子； 和 ii) 所述载体适合于在第二时间段以最初释放模式释放至少一种第二生长因子。
12. 根据权利要求11所述的体系，其中，所述第一时间段包括数小时或数日。
13. 根据权利要求11或12所述的体系，其中，所述第二时间段包括数日或数周。
14. 根据权利要求11至13中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是相同的。
15. 根据权利要求11至13中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是不同的。
16. 根据权利要求11至15中任一项所述的体系，其中，所述第一生长因子和所述第 二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白 (BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
17. 根据权利要求16所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP。
18. 根据权利要求17所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP-2或BMP-7。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的体系，其中，所述载体递送所述至少一种生长 因子的总量的100%。
20. 根据权利要求1至18中任一项所述的体系，其中，所述载体递送所述至少一种生 长因子的总量的至少70%，而所述递送载剂递送所述至少一种生长因子的总量的至少约 10%。
21. 根据权利要求1至18中任一项或权利要求20所述的体系，其中，所述载体递送所 述至少一种生长因子的总量的约70%，而所述递送载剂递送所述至少一种生长因子的总量 的约30%。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为约 0· 5:1 至 4:1。
23. 根据权利要求22所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
24. 根据权利要求23所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约I. 0ml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
25. 根据权利要求1至24中任一项所述的体系，其中，与所述载体相关联的所述至少一 种生长因子是以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上的。
26. 根据权利要求25所述的体系，其中，与所述载体相关联的所述至少一种生长因子、 液体和载体的比例为约1:1: 〇. 5。
27. 根据权利要求26所述的体系，其中，I. Omg的与所述载体相关联的所述至少一种生 长因子被添加到I. Oml的所述液体中，它们一起冻干到约0. 5cc的所述载体上。
28. -种包含根据权利要求1至27中任一项所述的生长因子释放体系的生物植入物。
29. -种释放至少一种生长因子的方法，所述方法包括： -通过载体递送至少一种生长因子，其中所述载体适合于以持续释放模式释放所述至 少一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，并且其中所述多个颗粒包含二水合硫酸钙； 和 -利用递送载剂递送所述载体。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约 1:1 或 2:1。
32. 根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为：血 小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白（BMP)、转化生长因 子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为BMP。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中，所述至少一种生长因子为BMP-2或BMP-7。
35. 根据权利要求29至34中任一项所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为 约 0. 5:1 至 4:1。
36. 根据权利要求35所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
37. 根据权利要求36所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约1.0ml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
38. 根据权利要求29至37中任一项所述的体系，其中，将所述至少一种生长因子以液 体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上。
39. 根据权利要求38所述的体系，其中，所述至少一种生长因子、液体和载体的比例为 约 1:1:0.5。
40. 根据权利要求39所述的体系，其中，将LOmg的所述至少一种生长因子添加到 I. Oml的所述液体中，将它们一起冻干到0. 5cm3的所述载体上。
41. 一种多相释放生长因子的方法，所述方法包括： -通过递送载剂以最初释放模式递送至少一种第一生长因子； -通过载体以持续释放模式递送至少一种第二生长因子，其中所述载体适合于以持续 释放模式释放至少一种生长因子，其中所述载体包含多个颗粒，并且其中所述多个颗粒包 含二水合硫酸钙。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述载体还包含磷酸钙颗粒。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为约 1:1 或 2:1。
44. 根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是相同的。
45. 根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子是不同的。
46. 根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和 所述至少一种第二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、 骨形态生成蛋白（BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子 (FGF)。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中，所述至少一种第一生长因子和所述至少一种 第二生长因子中的至少一者为BMP-2或BMP-7。
49. 根据权利要求41至48中任一项所述的方法，其中，所述载体递送所述生长因子的 总量的100%。
50. 根据权利要求41至48中任一项所述的方法，其中，所述递送载剂递送所述生长因 子的总量的至少10%，而所述载体递送所述生长因子的总量的至少50%。
51. 根据权利要求41至50中任一项所述的方法，其中，所述递送载剂与载体的比例为 约 0. 5:1 至 4:1。
52. 根据权利要求51所述的方法，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中，所述递送载剂的量为约I. Oml，而所述载体的 量为约0. 5cm3。
54. 根据权利要求41至53中任一项所述的方法，其中，将与所述载体相关联的所述至 少一种生长因子以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中，与所述载体相关联的所述至少一种生长因子、 液体和载体的比例为约1:1: 〇. 5cm3。
56. 根据权利要求55所述的方法，其中，将I. Omg的与所述载体相关联的所述至少一种 生长因子添加到I. Oml的所述液体中，将它们一起冻干到0. 5cm3的所述载体上。
57. -种用于递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括： -递送载剂组分； -包含多个二水合硫酸钙颗粒的载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种生长因子。
58. 根据权利要求57所述的试剂盒，其中，所述载体组分还包含磷酸钙颗粒。
59. 根据权利要求58所述的试剂盒，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为 约 1:1 或 2:1。
60. 根据权利要求57至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂组分和所述载 体组分在分开的容器中。
61. 根据权利要求57至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述载体和所述至少一种生 长因子在单个容器中组合，并且其中，所述至少一种生长因子负载或包覆在所述载体组分 上。
62. 根据权利要求57至61中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂包含聚合物。
63. 根据权利要求62所述的试剂盒，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
64. 根据权利要求63所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
65. 根据权利要求64所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
66. -种用于多相递送生长因子的试剂盒，所述试剂盒包括： -递送载剂组分； -与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子； -包含多个二水合硫酸钙颗粒的载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
67. 根据权利要求66所述的试剂盒，其中，所述载体组分还包含磷酸钙颗粒。
68. 根据权利要求67所述的试剂盒，其中，二水合硫酸钙颗粒与磷酸钙颗粒的比例为 约 1:1 或 2:1。
69. 根据权利要求66至68中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂组分和所述载 体组分在分开的容器中。
70. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中，所述递送载剂和所述至少一种第一生长因 子在分开的容器中提供。
71. 根据权利要求66至70中任一项所述的试剂盒，其中，所述载体和所述至少一种第 二生长因子在单个容器中组合，并且其中，所述至少一种第二生长因子负载或包覆在所述 载体组分上。
72. 根据权利要求71所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子与所述载体组 分一起提供。
73. 根据权利要求66至72中任一项所述的试剂盒，其中，所述递送载剂包含聚合物。
74. 根据权利要求73所述的试剂盒，其中，所述聚合物为反相聚合物或嵌段共聚物。
75. 根据权利要求74所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆。
76. 根据权利要求75所述的试剂盒，其中，所述聚合物为泊洛沙姆407。
77. 根据权利要求66至76中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 和所述至少一种第二生长因子是相同的。
78. 根据权利要求66至76中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 和所述至少一种第二生长因子是不同的。
79. 根据权利要求66至78中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第 二生长因子为：血小板衍生生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、骨形态生成蛋白 (BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子（IGF)或成纤维细胞生长因子（FGF)。
80. 根据权利要求79所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第二生长因子中 的至少一者为BMP。
81. 根据权利要求80所述的试剂盒，其中，所述第一生长因子和所述第二生长因子中 的至少一者为BMP-2或BMP-7。
82. 根据权利要求66至81中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一生长因子 占在所述试剂盒中提供的生长因子的总量的至少10%，而所述至少一种第二生长因子占在 所述试剂盒中提供的生长因子的总量的至少50%。
83. -种用于在处理部位多相释放生长因子的体系，所述体系包含： -包含至少一种第一生长因子的递送载剂；和 -包含至少一种第二生长因子的载体； _其中： -所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放所述至少一种第一生长因 子； -所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放所述至少一种第二生长因子。
84. 根据权利要求83所述的体系，其中，所述递送载剂与载体的比例为约0.5:1至 4:1。
85. 根据权利要求84所述的体系，其中，所述递送载剂的量为约0. 5ml至10. 0ml。
86. 根据权利要求85所述的体系，其中，所述递送载剂的量为1.0ml，而所述载体的量 为约 0· 5cm3。
87. 根据权利要求83至86中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第二生长因子是 以液体施加到所述载体，然后冻干到所述载体上的。
88. 根据权利要求87所述的体系，其中，所述至少一种第二生长因子、液体和载体的比 例为约1:1:0. 5。
89. 根据权利要求88所述的体系，其中，I. Omg的所述至少一种第二生长因子被添加到 I. Oml的所述液体中，它们一起冻干到约0. 5cm3的所述载体上。
90. 根据权利要求83至89中任一项所述的体系，其中，所述至少一种第一生长因子是 在所述载体的存在下被添加到所述递送载剂的。
【文档编号】A61K47/34GK104220046SQ201280072332
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2012年4月11日
【发明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申请人:感应生物制品股份有限公司
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