具有二苯亚胂酸降解能力的新微生物的制作方法

专利名称：：具有二苯亚胂酸降解能力的新微生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属、且具有二苯亚胂酸降解能力的微生物。另外，本发明涉及属于剑菌(Ensifer)属、且具有二苯亚胂酸降解能力的微生物。进一步地，本发明涉及使用至少1种上述微生物降解二苯亚胂酸的方法。
背景技术：
：2003年3月，从茨城县神栖市的饮用井水中检测到相当于水质标准450倍的高浓度的砷。之后通过调查表明此砷为有机砷化合物的一种，是以二苯亚胂酸((C6H5)2AsO(OH);结构式如式I所示)为主要成分的苯基化砷化合物。0式I:由于该苯基化砷化合物引起的污染使附近居民遭受直接的健康损害，此外还发现附近水田产出的大米中也混入砷。该地域的土壤和地下水的二苯亚胂酸引起的砷污染在广泛进行着，环境省目前也在继续进行监测调查。另外，二苯亚胂酸是作为化学武器之一的呕吐剂(喷嚏剂)使用的二苯胂基氰和二苯胂基氯的合成原料或水解生成物。如果将二苯胂基氰和二苯胂基氯弃于土壤中，则经二苯胂氢氧化物(diphenylarsinehydroxide)及氧联双二苯胂(bis-(diphenylarsine)oxide)变成二苯亚胂酸。日本国在存在60年以上的前军队相关设施的场所及其附近，发现由于含有这些有机砷化学武器的遗弃引起的土壤污染。另外，确认国外也发生由于化学武器的弃置引起的土壤和地下水的有机砷污染。有待建立这些有机砷污染土壤的修复技术。作为已有的有机砷化合物污染土壤的净化方法，提出了通过洗涤处理从污染土壤中提取除去有机砷化合物的方法(专利文献1)。这时，作为洗涤剂，使用含有氢氧化钠的水溶液、含有磷酸或其盐的水溶液、含有硫酸的水溶液、含有盐酸的水溶液、含有酒石酸或其盐的水溶液、含有柠檬酸或其盐的水溶液、或者含有草酸或其盐的水溶液的任一种。另外，作为含有有机砷化合物的水的净化方法，提出了在选自铁离子、铜离子、钴离子及锰离子构成的组中的至少1种金属离子的存在下，使过氧化氢反应，将有机砷化合物氧化降解成无机砷的有机砷化合物的处理方法(专利文献2)。或者，还提出了添加氯化铁等无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂，使形成絮状物，将此絮状物沉淀分离后，用砂滤器过滤处理沉淀处理水，该处理水再进行活性炭吸附处理，从而降低有机砷化合物的方法(专利文献3)。进一步，提出了下述方法，其特征在于对含有有机砷化合物的水照射紫外线，同时通入臭氧气体，将有机砷化合物降解成无机砷化合物(专利文献4)。进一步，提出了一种水处理方法，其特征在于在含有有机砷的水中加入絮凝剂，沉淀除去含有的有机砷的沉淀工序后，再进行用反渗透膜除去水中残留的有机砷的反渗透膜工序。并且，提出了一种水处理装置，其特征在于所述水处理装置具有处理含有有机砷的水的反渗透膜装置，在上述反渗透膜装置的上游一侧，具有在上述水中混合絮凝剂使上述有机砷沉淀的沉淀槽(专利文献5)。但是，将上述列举的有机砷化合物的净化方法应用于污染土壤时，需要进行挖掘污染土壤、汲水、提取有机砷等，需要大量的劳动力和成本。因此，希望一种更简便、在原位就能够净化的方法，作为适合这种条件的新的环境净化技术之一的生物修复引人注目。能够有效降解、除去作为对象的污染物质的微生物是实施生物修复必不可少的，对有机砷化合物引起的环境污染应用此方法时，尚未分离出有用的微生物成为课题。据报道，到目前为止，作为降解有机砷化合物的微生物，有能够降解二甲亚胂酸的微生物K8株、12M17株及7M5株，能够降解单甲基胂酸的微生物K-r株及IV-1株(专利文献6)。据报道K-1'株及IV-1株也能够降解少量苯胂酸(专利文献6)。但是到目前为止，尚不知道在上述神栖市的砷污染等中作为以最高浓度检测到的有机砷化合物二苯亚5胂酸的降解菌。专利文献1(特开2005-169162号公报)、专利文献2(特开2001-158622号公报)、专利文献3(特开2005-238184号公报)、专利文献4(特开2005-334761号公报)、专利文献5(特开2006-43616号公报)以及专利文献6(特开2005-229945号公报)中记载的内容作为本说明书记载的一部分引入。专利文献l:特开2005-169162号公报专利文献2:特开2001-158622号公报专利文献3:特开2005-238184号公报专利文献4:特开2005-334761号公报专利文献5:特开2006-43616号公报专利文献6:特开2005-229945号公报
发明内容二苯亚胂酸为有机砷化合物的一种，二苯亚胂酸本身的弃置或土壤中遗弃的化学武器(二苯胂基氰和二苯胂基氯)水解引起土壤和地下水污染。作为改善这种状况的方法，希望得到有效降解二苯亚胂酸的方法。因此，本发明的目的是提供具有降解二苯亚胂酸能力的微生物、用于通过该微生物降解二苯亚胂酸的方法、使用该微生物净化污染土壤及/或地下水的方法、含有该微生物的二苯亚胂酸的降解剂、含有该微生物的污染土壤及/或污染地下水的净化剂。本发明人等为了解决上述问题，进行了富集培养，发现二苯亚胂酸污染的水田土壤中存在有效的微生物，从这些微生物中分离出的新的剑菌(Ensifer)属细菌及新的中华根瘤菌(Sinorhizobium)属细菌具有高的二苯亚胂酸降解能力。另外，还发现通过添加硫酸亚铁等铁成分可促进该微生物对二苯亚胂酸的降解，从而完成了本发明。因此，本发明在于下述[1][13]。具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物。具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因(A)由序列编号1中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号1中记载的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的L2406株(FERMBP-10658)。具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物。具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因(A)由序列编号2中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号2中记载的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的L2413株(FERMBP-10659)。—种降解二苯亚胂酸的方法，使用[1][6]中任一项所述的微生物。—种净化土壤及/或污染地下水的方法，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[7]或[8]所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。—种二苯亚胂酸的降解剂，其中，含有[1][6]中任一项所述的微生物。如[10]所述的降解剂，其中，含有铁成分。—种污染土壤及/或污染地下水的净化剂，其中，含有[1][6]中任一项所述的微生物。如[12]所述的净化剂，其中，含有铁成分。另外，本发明还在于下述[14][18]。一种降解二苯亚胂酸制备苯胂酸的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。7[15]—种从污染土壤制备净化土壤的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。—种从污染地下水制备净化地下水的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[14][16]中任一项所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。—种挑选具有二苯亚胂酸降解能力的菌株的方法，其中，包括在湿润土的状态下采取砷污染土壤的工序；在二苯亚胂酸存在下培养该砷污染土壤，得到培养液的工序；稀释得到的培养液、制作稀释系列的工序；在二苯亚胂酸存在下，培养作为稀释系列的培养液的工序；以及从稀释系列中选择伴随培养产生二苯亚胂酸浓度降低或消失的培养液的工序。艮卩，本发明首先在于具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物。作为这种微生物，优选具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因的具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物，所述(A)和(B)为(A)由序列编号1中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号1中记载的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。上述同一性优选95%以上，更加优选96°/。以上，进一步优选97%以上，进一步优选98%以上，进一步优选99%以上，特别优选99.5%以上，特别优选99.8%以上，特别优选99.9%以上的同一性。作为这种微生物，非常优选属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的L2406株(FERMBP-10658)。另外，本发明在于具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物。作为这种微生物，优选具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因的具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物，所述(A)和(B)为(A)由序列编号2中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号2中记载的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。上述同一性优选95%以上，更加优选96%以上，进一步优选97%以上，进一步优选98%以上，进一步优选99%以上，特别优选99.5%以上，特别优选99.8%以上，特别优选99.9。/。以上的同一性。作为这种微生物，非常优选属于剑菌(Ensifer)属的L2413株(FERMBP-10659)。另外，本发明还在于使用上述微生物的至少1种以上降解二苯亚胂酸的方法、降解二苯亚胂酸制备苯胂酸的方法、净化污染土壤及/或污染地下水的方法、从污染土壤制备净化土壤的方法以及从污染的污染地下水制备净化的污染地下水的方法，还在于在这些方法中上述微生物的使用。进一步，在这些方法及使用的优选方式中，可以在铁成分存在下进行。用于与微生物一起使用而存在的铁成分的量，作为铁浓度[mg-Fe/1](每1升体积的铁的质量mg)通常为0.01[mg-Fe/l]以上，优选0.04[mg-Fe/l]以上，更加优选0.1[mg-Fe/l]以上，特别优选0.2[mg-Fe/l]以上，特别优选0.3[mg-Fe/l]以上，特别优选0.4[mg-Fe/l]以上，特别优选1[mg-Fe/l]以上，特别优选2[mg-Fe/l]以上，特别优选4[mg-Fe/l]以上，优选铁浓度高。对铁浓度的上限没有特别限制，可以是根据离子积确定的饱和浓度，通常为1000[mg-Fe/l]以下。例如可以通过添加硫酸亚铁等铁成分达到这些铁浓度。污染土壤或地下水是指主要含有二苯亚胂酸、被砷污染的土壤或地下水。被砷污染的土壤或地下水一般是指由于以有机化合物及无机化合物的形态含有砷元素而被污染的土壤或地下水，本发明中是指主要含有二苯亚胂酸、被砷污染的土壤或地下水。污染土壤或污染地下水的净化是指除去了主要含有的二苯亚胂酸的土壤或地下水。但是，这种污染土壤的净化或污染地下水的净化也包括适当除去二苯亚胂酸，结果从土壤或地下水中迅速除去成为二苯亚胂酸生成源的有机砷化合物；另外，也包括组合使用促进苯胂酸降解的已知的组合物及方法，从土壤或地下水中迅速除去全部有机砷化合物。另外，本发明还在于含有上述微生物的二苯亚胂酸的降解剂、污染土壤或污染地下水的净化剂，还在于使用上述微生物制备它们的方法。这些降解剂、土壤净化剂及地下水净化剂含有作为有效成分的上述微生物，而且，可以含有在其目的方面容许的已知的辅助成分。另外，这些降解剂、土壤净化剂及地下水净化剂的优选方式中，可以含有硫酸亚铁等铁成分。适当的铁成分的含量，优选在降解或净化时，将在土壤、地下水等中与微生物一起使用时存在的铁成分的量设定为铁浓度[mg-Fe/1](每1升体积的铁的质量mg)达到上述范围的值。另外，本发明还在于挑选具有二苯亚胂酸降解能力的菌株的方法，其中，用于挑选(筛选)具有二苯亚胂酸降解能力的微生物菌株的下述方法包括在湿润土的状态下采取砷污染土壤的工序；在二苯亚胂酸存在下培养该砷污染土壤，得到培养液的工序；稀释得到的培养液，制作稀释系列的工序；在二苯亚胂酸存在下，培养作为稀释系列的培养液的工序；以及从稀释系列中选择伴随培养产生二苯亚胂酸浓度降低或消失的培养液的工序。根据要求，可以将稀释得到的培养液制作稀释系列的工序、在二苯亚胂酸存在下培养作为稀释系列的培养液的工序、以及从稀释系列中选择伴随培养产生二苯亚胂酸浓度降低或消失的培养液的工序反复进行多次。另外，为了有效地挑选，在优选的方式中，在二苯亚胂酸存在下的培养，可以进一步添加硫酸亚铁等铁成分。从砷污染土壤中采取湿润土，可以通过从砷污染水田土壤中适当地进行采取。通过这种挑选具有二苯亚胂酸降解能力的菌株的方法，可以挑选(筛选)得到上述有用的微生物。进一步，本发明人等发现，上述微生物菌株可以降解二苯亚胂酸的代谢产物苯胂酸，生成无机砷化合物。苯胂酸为有机砷化合物的一种，上述微生物菌株降解二苯亚胂酸一10次生成苯胂酸[(C6Hs)AsO(OH)2;结构式如式II所示]。但是，为了净化土壤和地下水，希望进一步降解除去该苯胂酸。如果能够将该苯胂酸降解成无机砷化合物，则土壤和地下水的净化会变得更彻底。因此，本发明人等进行了进一步研究，发现上述微生物菌株可以降解二苯亚胂酸的代谢产物苯胂酸，生成无机砷化合物。艮P，本发明还在于下述[19][22]。一种降解苯胂酸的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[19]所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。[21]—种苯胂酸的降解剂，其中，含有[1][6]中任一项所述的微生物。如[21]所述的降解剂，其中，含有铁成分。进一步，本发明还在于下述[23][24]。—种降解苯胂酸以制备无机砷化合物的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[23]所述的方法，其中在铁成分存在下使用微生物。进一步，本发明人等发现上述微生物菌株可以降解作为家禽促生长剂使用的洛克沙胂(Roxarsone),生成无机砷化合物。洛克沙胂[(C6H3(N02)(OH"AsO(OH)2;结构式如式III所示]为作为促生长剂而给予家禽的苯基化有机砷化合物。在美国，83亿只肉鸡的约7成给予本品(2000年)，所出的厩肥中含有卯0t洛克沙胂，换算成砷相当于250t。近年来，担心因将此厩肥施用在农地等中造成发生有机砷污染土壤，正在寻求其对策。11因此，本发明人等为了弄清这次分离的降解菌对洛克沙胂的效果，在含有洛克沙胂作为唯一碳源的无机盐培养基中移植L2406株，研究培养基中的洛克沙胂是否能够得到降解。结果发现上述微生物菌株可以降解洛克沙胂，生成无机砷化合物。艮P，本发明还在于下述[25][28]。—种降解洛克沙胂的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[25]所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。—种洛克沙胂的降解剂，其中，含有[1][6]中任一项所述的微生物。如[27]所述的降解剂，其中，含有铁成分。进一步，本发明还在于下述[29][30]。—种降解洛克沙胂以制备无机砷化合物的方法，其中，使用[1][6]中任一项所述的微生物。如[29]所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。根据本发明的具有降解二苯亚胂酸能力的微生物，能够降解在某种砷污染等中以最高浓度检测到的有机砷化合物二苯亚胂酸。含有该微生物的二苯亚胂酸降解剂可以提供用于降解二苯亚胂酸的合适方法。而且，如果将这种二苯亚胂酸的降解剂作为污染土壤或污染地下水的净化剂使用，对由有机砷化合物引起的污染土壤或污染地下水实施净化的方法，则不需要挖掘污染土壤、汲水、提取有机砷等，不需要大量的劳动力和成本，能够更简便、在原位就能够净化。S卩，本发明首次使作为新的环境净化技术之一的生物修复在除去二苯亚胂酸方面成为可能。oo-——ooPoII式1图1表示回流液中二苯亚胂酸浓度变化的图。图2表示L型管的培养基中二苯亚胂酸浓度变化的图。图3表示三角烧瓶的培养基中二苯亚胂酸浓度变化的图。图4表示培养液中苯胂酸浓度变化的图。图5表示培养液中砷的形态分析结果(色谱图)图。图6表示培养液中洛克沙胂浓度变化的图。具体实施例方式下面详细说明本发明。成为本申请优先权主张的基础的日本专利申请特愿2006-238350及日本专利申请特愿2007-115920说明书等中记载的内容，作为本说明书记载的一部分引入。本发明的具有二苯亚胂酸降解能力的微生物为如下述那样从土壤中分离的细菌。二苯亚胂酸降解菌的富集培养采用土壤'木炭回流法进行。首先准备具有表1所示组成的、高压釜灭菌(120°C、20分钟)后的回流液。但是，将硫酸镁七水合物单独调制成适当浓度的溶液，另外进行高压釜灭菌后加入。表1.回流液组成培养基组成含量硝酸铵0.5g磷酸二氢钾0.5g硫酸镁七水合物0.2g硫酸亚铁七水合物5mg(相当于铁lmg)二苯亚胂酸5mg或20mg水1000ml作为微生物源，供试土壤为采自茨城县神栖市的砷污染水田土壤I及n。在湿润土的状态下称取这些土壤，其量相当于30g干土量，与少量的木炭(CharcoalA、东洋电化工业株式会社制造)混合，置于回流装13置内的规定位置。将该装置置于25。C恒温室，一边使200ml回流液进行回流，一边进行降解微生物的富集。每两周取出全部回流液，更换成相同组成的新鲜回流液。该次运转的回流装置中的供试土壤与回流液中二苯亚胂酸浓度的组合归纳于表2。表2.供试土壤与回流液中二苯亚胂酸浓度的组合回流装置~~供试土壤二苯亚胂酸浓度1I20mg/l2I20mg/l3I5mg/l4I5mg/l5_^_20mg/l_富集培养中，采取微量回流液，用设定为表3所示测定条件的高效液相色谱法(HPLC)测定二苯亚胂酸的浓度。结果如图l所示。表3.二苯亚胂酸浓度的测定条件￥1S#图1中，15表示各回流装置的编号(参照表2)，纵轴表示相对于初期二苯亚胂酸浓度的相对值，箭头符号表示回流液的更换时间。回流开始19天后，该次运转的回流装置中，回流液中的二苯亚胂酸的浓度显著降低，从认为二苯亚胂酸降解菌充分富集的回流装置3及4中，湿润状态下采取土壤各2g，分别分散到灭菌的生理盐水20ml中，调制土壤混悬液。将这些土壤混悬液0.1ml接种到6ml液体培养基中，所述液体培养基为分注入L型管的、与回流液具有相同组成的灭菌后的液体培养基，于25。C进行振荡培养。这时二苯亚胂酸的浓度设定为5mg/1，关于各土壤混悬液，分别使用4个、共计8个L型管实施本实验。用HPLC经时测定各L型管的培养基中二苯亚胂酸的浓度，结果9天后二苯亚胂ODS柱、内径3mmx长度250mm水-乙腈(i:i)混合液lmg/分钟40。C10^1UV(220nm)绝对校准曲线法相且里动速温样测旦柱流流柱进检定14酸均大致消失(参照图2)。因此，将任意选择的L型管的培养液用灭菌后的生理盐水稀释，制作稀释系列，将104及1()S倍的稀释液0.1ml接种到6ml液体培养基中，所述液体培养基为分注入另外的L型管的、与回流液具有相同组成的灭菌后的液体培养基，于25'C进行振荡培养。每个稀释系列各培养2个。用HPLC经时测定各个L型管的培养基中的二苯亚胂酸的浓度，结果培养开始17天后，任一L型管中的二苯亚胂酸均大致消失(参照图3)。同样，以接种105倍稀释液的L型管的培养液为基础，反复稀释和传代，使培养液中含有的微生物种稳定后，在表4所示组成的DPAA20VTE培养基中加入1.5%琼脂制作平板，在该平板上，接种一部分上述培养液，于3(TC静置培养。l周后，钓取出现的菌落，在R2A琼脂培养基(Difco)上划线，再于30'C静置培养，得到多个纯分离株。关于这些纯分离株，在预先分注有DPAA5VTE培养基20ml的100ml容量三角烧瓶中，分别移植l白金耳，于25'C、120rpm进行旋转培养。通过用HPLC经时测定培养基中二苯亚胂酸的浓度，挑选具有二苯亚胂酸降解能力的菌株。表4.DPAA5VTE培养基的组成及DPAA20VTE培养基的组成培养基组成含量DPAA5VTE培养基DPAA20VTE培养基硝酸铵0.5g0.5g磷酸二氢钾0.5g0.5g硫酸镁七水合物0.2g0.2g硫酸亚铁七水合物5mg(相当于铁lmg)5mg(相当于铁lmg)二苯亚胂酸5mg20mg维生素溶液+110ml10ml微量元素溶液A210ml10ml水1000ml1000ml15供试株菌落编号二苯亚胂酸降解率(％)苯胂酸生成量(mg/1)L2楊株139.40.52238.90.4837.10.44434.40.46536.40.43L2413株122.60.27212.20.17314.80.20413.40.19517.20.22表5.女1维生素溶液的组成组成成分含量—10mg素20mg"mg50mg100mg250mg苯甲酸500mg_1000ml表6.女2微量元素溶液的组成组成成分含量EDTA.2Na500mgZnS04.7H2010mgMnS04.H205mgH3B0330mgCoS04.7H2024mgCuS045H205mgNa2Mo04.2H205mgCa(OH)250mg水1000ml通过上述操作，挑选对二苯亚胂酸具有降解能力的菌株，发现L2406株及L2413株具有降解二苯亚胂酸的能力。各株用R2A琼脂培养基(Difco)再次进行单菌落分离，将每种菌株各5株接种到分注有6mlDPAA5VTE培养基的L型管中。于25'C振荡培养14天，用HPLC测定二苯亚胂酸的残存量，用LC-MS测定代谢物苯胂酸的生成量，结果如表7所示。另外，LC-MS的分析条件如表8所示。表7.L2406株及L2413株对二苯亚胂酸的降解和代谢物的生成素胺转素醇基物钴酸胺酸哆氨生氰泛硫烟吡对水16表8.LC-MS条件项目条件分离条件与表2相同离子化方法电喷雾法模式正离子增益1.0干燥气体氮气(12ml/分钟、350°C)雾化器压力45psig毛细管电压3.5kV裂解器电压80eV定量绝对校准曲线法对于按上述步骤发现的L2406株及L2413株，实施了基于16S核糖体RNA基因(16S核蛋白体RNA基因)的碱基序列的基因分类学研究。首先，将各菌株移植于R2A琼脂培养基(Difco)，于3(TC、暗处进行预培养。取1白金耳产生的菌落，分散到灭菌后的生理盐水lml中，从其中用DNeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。使用得到的DNA为模板，将已知的Dlf和Dlr作为引物进行PCR，将16S核糖体RNA基因扩增。此PCR产物用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRPurificationKit)(Qiagen)精制后，供循环测序反应，其反应物用DNA测序仪(日立制SQ-5500E)进行解析，确定碱基序列。结果L2406株确定了1,101个碱基对(序列编号1:SEQIDNo.1)，L2413株确定了1,276个碱基对(序列编号2:SEQIDNo.2)。基于确定的碱基序列，用GENETYXPDB对DNA碱基序列数据库(GenBank)进行FASTA检索，结果L2406株与莫雷兰中华根瘤菌(Sinorhizobiummorelense)有99.5%的同源性，L2413株与黏着剑菌(Ensiferadhaerens)有99.5%的同源性。然后研究了L2406株及L2413株的形态学及生理学性质，结果如表9所示。表9中的"+"表示有或阳性，"-"表示无或阴性。17表9.L2406株及L2413株的形态学及生理学性质<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(+:有或阳性，-无或阴性)另外，根据API系统(生物梅里埃公司(BioMerieuxCorporation))的API20NE的测定方法研究了两种菌株的生化性状，结果如表10所示。表10.L2406株及L2413株的生化性状<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述结果与"Brenner,D.J.,Krieg，N.R.,Staley,J.T.,Garrity，G.M.共著，伯杰氏系统细菌学手册(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)，第2版，变形细菌(TheProteobacteria)"中记载的中华根瘤菌属细菌及剑菌属细菌的特征没有矛盾。根据上述结果，发明人等将L2406株鉴定为中华根瘤菌属L2406(Sinorhizobiumsp.L2406)，在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏，保藏编号为FERMBP-10658;另外，将L2413株鉴定为剑菌属L2413(Ensifersp.L2413)，在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏，保藏编号为FERMBP-10659。分离L2406株及L2413株使用的DPAA5VTE培养基中，作为微量元素含有铁、锌、锰、硼、钴、铜、钼及钙。试验了这些元素对两菌株降解二苯亚胂酸的必要性，表明铁的添加非常重要。因此，通过改变添加的硫酸亚铁七水合物的量，准备培养基中的铁浓度为0、0.04、0.2、0.4、1、2及4mg-Fe/l的DPAA5VTE培养基，研究了培养基中的铁浓度如何影响二苯亚胂酸降解菌的降解能力。将各种培养基各6ml分注入L型管，移植L2406株或L2413株。于25'C振荡培养7天后，用HPLC测定培养液中的二苯亚胂酸的浓度，求出其降解率。结果培养基中高的铁浓度会促进L2406株及L2413株对二苯亚胂酸的降解(表11)。表11.二苯亚胂酸降解的铁浓度依赖性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例下面通过实施例对本发明进行说明，但是本发明的范围并不局限于这些实施例。富集培养中，采取微量回流液，用设定为表3所示测定条件的高效液相色谱法(HPLC)测定二苯亚胂酸的浓度。结果如图l所示。回流开始19天后，这次运转的回流装置中，回流液中的二苯亚胂酸的浓度显著降低，从认为二苯亚胂酸降解菌充分富集的回流装置3及4中，在湿润状态下采取土壤各2g，分别分散到灭菌的生理盐水20ml中，调制土壤混悬液。将这些土壤混悬液O.lml接种到6ml液体培养基中，所述液体培养基为分注入L型管的、与回流液具有相同组成的灭菌后的液体培养基，于25。C进行振荡培养。这时的二苯亚胂酸的浓度设定为5mg/1，关于各土壤混悬液，分别使用4个、共计8个L型管实施本实验。用HPLC经时测定各个L型管的培养基中的二苯亚胂酸的浓度，结果9天后二苯亚胂酸均大致消失(参照图2)。将任意选择的L型管的培养液用灭菌后的生理盐水稀释，制作稀释系列，将104及1()S倍的稀释液0.1ml接种到6ml液体培养基中，所述液体培养基为分注入另外的L型管的、与回流液具有相同组成的灭菌后的液体培养基，于25'C进行振荡培养。各个稀释系列各培养2个。用HPLC经时测定各个L型管的培养基中的二苯亚胂酸的浓度，结果培养开始17天后，任一L型管中的二苯亚胂酸均大致消失(参照图3)。同样，以接种105倍稀释液的L型管的培养液为基础，反复稀释和传代，使培养液中含有的微生物种稳定后，在表4所示组成的DPAA20VTE培养基中加入1.5%琼脂制作平板，在该平板上，接种一部分上述培养液，于30'C静置培养。l周后，钓取出现的菌落，在R2A琼脂培养基(Difco)上划线，再于3(TC静置培养，得到多个纯分离株。关于这些纯分离株，在预先分注DPAA5VTE培养基20ml的100ml容量三21角烧瓶中，分别移植l白金耳，于25r、120rpm进行旋转培养。通过用HPLC经时测定培养基中的二苯亚胂酸的浓度，挑选具有二苯亚胂酸降解能力的菌株。通过上述操作，挑选对二苯亚胂酸具有降解能力的菌株，发现L2406株及L2413株具有降解二苯亚胂酸的能力。各菌株用R2A琼脂培养基(Difco)再次进行单菌落分离，将每种菌株各5株接种到分注有6mlDPAA5VTE培养基的L型管中。于25'C振荡培养14天，用HPLC测定二苯亚胂酸的残存量，用LC-MS测定代谢物苯胂酸的生成量，结果如表7所示。另外，LC-MS的分析条件如表8所示。对于按上述步骤发现的L2406株及L2413株，实施了基于16S核糖体RNA基因的碱基序列的基因分类学研究。首先，将各菌株移植于R2A琼脂培养基(Difco)，于30。C、暗处进行预培养。取1白金耳产生的菌落，分散到灭菌后的生理盐水lml中，从其中用DNeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。使用得到的DNA为模板，将已知的Dlf和Dlr作为引物进行PCR，将16S核糖体RNA基因扩增。此PCR产物用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRPurificationKit)(Qiagen)精制后，供循环测序反应，其反应物用DNA测序仪(日立制SQ-5500E)进行解析，确定碱基序列。结果L2406株确定了1,101个碱基对(序列编号l:SEQIDNo.1)，L2413株确定了1,276个碱基对(序列编号2:SEQIDNo.2)。基于确定的碱基序列，用GENETYXPDB对DNA碱基序列数据库(GenBank)进行FASTA检索，结果L2406株与莫雷兰中华根瘤菌(Sinorhizobiummorelense)有99.5%的同源性，L2413株与黏着剑菌(Ensiferadhaerens)有99.5%的同源性。然后研究了L2406株及L2413株的形态学及生理学性质，结果如表9所示。表9中的"+"表示有或阳性，"-"表示无或阴性。另外，根据API系统(生物梅里埃公司)的API20NE的测定方法研22究了两种菌株的生化性状，结果如表10所示。上述结果与"Brenner,D.J"Krieg,N.R.,Staley,J.T"Garrity，G.M.共著，伯杰氏系统细菌学手册(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)，第2版，变形细菌(TheProteobacteria)"中记载的中华根瘤菌属细菌及剑菌属细菌的特征没有矛盾。根据上述结果，发明人等将L2406株鉴定为中华根瘤菌属L2406(Sinorhizobiumsp.L2406)，在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏，保藏编号为FERMBP-10658;另外，将L2413株鉴定为剑菌属L2413(Ensifersp.L2413)，在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏，保藏编号为FERMBP-10659。分离L2406株及L2413株使用的DPAA5VTE培养基中，作为微量元素含有铁、锌、锰、硼、钴、铜、钼及钙。试验了这些元素对两菌株降解二苯亚胂酸的必要性，表明铁的添加非常重要。因此，通过改变添加的硫酸亚铁七水合物的量，准备培养基中的铁浓度为0、0.04、0.2、0.4、1、2及4mg-Fe/1的DPAA5VTE培养基，研究了培养基中的铁浓度如何影响二苯亚胂酸降解菌的降解能力。将各种培养基各6ml分注入L型管，移植L2406株或L2413株。于25。C振荡培养7天后，用HPLC测定培养液中的二苯亚胂酸的浓度，求出其降解率。结果培养基中髙的铁浓度会促进L2406株及L2413株对二苯亚胂酸的降解(表11)。如表7所示，L2406株及L2413株降解二苯亚胂酸，生成苯胂酸[(C6H5)AsO(OH)2;结构式如式II所示]。但是，任一菌株中，检测到的苯胂酸的量以砷计只不过是被降解的二苯亚胂酸的1/3左右，由此认为这些菌株有进一步降解苯胂酸的可能性。因此，接着在含有苯胂酸作为唯一碳源的无机盐培养基中移植二苯亚胂酸降解菌，经时测定培养基中的苯胂酸的量。首先，将L2406株利用R2A琼脂培养基(Difco)(组成如表12所23示)进行预培养，刮取产生的菌落，混悬于灭菌后的生理盐水中。然后，从表4的DPAA5VTE培养基中除去二苯亚胂酸，添加苯胂酸lmg代替之，命名为PAA1VTE培养基，将PAA1VTE培养基20ml放入100ml容量三角烧瓶中。在各三角烧瓶中移植预先调制的L2406株的菌体混悬液各O.lml，于30°C、暗处进行旋转培养(120rpm)。再准备未实施移植菌的三角烧瓶作为对照。本实验以11=2进行。培养基中的苯胂酸的定量使用LC-MS，应用表8的分析条件。其结果如图4所示。图4的白圆圈(0)表示移植L2406株时培养液中苯胂酸浓度经时变化的平均值。图4的纵轴表示培养液中的苯胂酸浓度与对照的苯胂酸浓度的相对值，横轴表示培养天数。如图4所表明的那样，L2406株在含有苯胂酸作为唯一碳源的无机盐培养基中，具有降低苯胂酸浓度的能力。另外，关于14天后的培养液，使用LC-ICP/MS进行砷的形态分析。使用LC-ICP/MS分析时的分离条件如表13所示。表12.R2A琼脂培养基组成(最终pH:7.2±0.2)培养基组成含量酵母提取物0.5g月示蛋白胨(DifcoNo.3)0.5g酪蛋白氨基酸0.5g葡萄糖0.5g可溶性淀粉0.5g磷酸氢二钾0.3g硫酸镁七水合物0.05g丙酮酸钠0.3g琼脂15.0g水画Oml表13项目条件柱ODS柱、内径2mmx长度150mm流动相A液0.1%甲酸B液含有0.1%甲酸的甲醇梯度条件注入后1.5分钟后，B液的混合比例保持在1%。1.5分钟后4分钟后期间，B液的混合比例直线增加至25%。4分钟后11分钟后，B液的混合比例保持在25%。11分钟后15分钟后期间，B液的混合比例直线增加至75%。15分钟后20分钟后，B液的混合比例保持在75%。流速0.15ml/分钟柱温40°CLC-ICP/MS得到的色谱图如图5所示。纵轴表示峰强度，横轴表示流出时间。上段为标准样品的色谱图，AsIII表示亚砷酸，DMAA+MAA表示二甲亚胂酸和单甲基胂酸，AsV表示砷酸，DMPAO表示二甲苯胂化氧(dimethylphenylarsineoxide)，MPAA表示甲苯基亚月申酸(methylphenylarsinicacid)，PAA表示苯胂酸，MDPAO表示甲基二苯基胂化氧(methyldiphenylarsineoxide)，DPAA表示二苯亚胂酸的洗脱峰位置(各20mg/1)。下段表示培养28天得到的L2406株的培养液的色谱图，检测到相当于亚砷酸(图5下段(1)的峰)和砷酸(图5下段(2)的峰)的峰。进一步，还检测到未知的3种砷化合物(图5下段(3)的峰)。另外，在图5下段(4)的位置检测到没有被降解的残存的苯胂酸。另一方面，对照(没有移植菌)中只出现苯胂酸的峰。由此得出结论，L2406株具有降解苯胂酸、生成无机砷的能力。作为降解苯胂酸、生成无机砷的微生物，据报道有K-1'株及IV-1株(专利文献6)。但是它们的苯胂酸降解率(％)非常慢，培养2周时，对于K-1'株，降解率为0.63%;对于IV-1株，降解率为2.20%。而与此相反，对于L2406株，2周时的降解率达10%左右，4周时达40%，推测其生物修复的可利用性更高。洛克沙胂[(C6H3(N02)(OH"AsO(OH)2;结构式如式III所示]为作为促生长剂而给予家禽的苯基化有机砷化合物。在美国，83亿只肉鸡的约257成给予本品(2000年)，所出的厩肥中含有卯Ot洛克沙胂，换算成砷相当于250t。近年来，担心因将此厩肥施用到农地等中发生有机砷污染土壤，正在寻求其对策。因此本研究中，为了弄清这次分离的降解菌对洛克沙胂的效果，在含有洛克沙胂作为唯一碳源的无机盐培养基中移植L2406株，研究培养基中的洛克沙胂是否能够得到降解。首先，将L2406株利用R2A琼脂培养基(Difco)进行预培养，刮取产生的菌落，混悬于灭菌后的生理盐水中。然后，从表4的DPAA5VTE培养基中除去二苯亚胂酸，添加洛克沙胂6mg代替之，命名为ROX6VTE培养基，将ROX6VTE培养基20ml放入100ml容量三角烧瓶中。在各三角烧瓶中移植预先调制的L2406株的菌体混悬液各O.lml，于30°C、暗处进行旋转培养(120rpm)。再准备未实施移植菌的三角烧瓶，作为对照。本实验以n=2进行。培养基中洛克沙胂的定量使用HPLC，应用表13的分析条件。其结果如图6所示。图6的黑菱形()表示移植L2406株时的培养液中，洛克沙胂浓度经时变化的平均值。图6的纵轴表示培养液中洛克沙胂浓度与对照的洛克沙胂浓度的相对值，横轴表示培养天数。如图6所表明的那样，在含有洛克沙胂作为唯一碳源的无机盐培养基中，L2406株具有降低洛克沙胂浓度的能力。工业实用性根据本发明的具有降解二苯亚胂酸能力的微生物，能够降解某种砷污染等中作为以最高浓度检测到的有机砷化合物二苯亚胂酸。含有该微生物的二苯亚胂酸降解剂可以提供用于降解二苯亚胂酸的适宜方法。而且，如果将这种二苯亚胂酸降解剂作为污染土壤或污染地下水的净化剂使用，实施净化有机砷化合物引起的污染土壤或污染地下水的方法，则不需要挖掘污染土壤、汲水、提取有机砷等大量的劳动力和成本，能够更简便、在原位就能够净化。即，本发明在除去二苯亚胂酸方面，首次使作为新的环境净化技术之一的生物修复成为可能。因此，本发明新提供一种优良的环境净化技术，是在产业上可以有效利用的发明。26序列表的自由文字序列编号1:本发明的降解菌L2406株的16S核糖体RNA基因的1101个碱基。序列编号2:本发明的降解菌L2413株的16S核糖体RNA基因的1276个碱基。权利要求1.具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物。2.具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因(A)由序列编号1中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号1中记载的碱基序列具有95。/。以上同一性的DNA。3.具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的L2406株(FERMBP-10658)。4.具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物。5.具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖体RNA基因(A)由序列编号2中记载的碱基序列组成的DNA;(B)与序列编号2中记载的碱基序列具有95。/。以上同一性的DNA。6.具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的L2413株(FERMBP-10659)。7.—种降解二苯亚胂酸的方法，其中，使用权利要求16中任一项所述的微生物。8.—种净化土壤及/或污染地下水的方法，其中，使用权利要求16中任一项所述的微生物。9.如权利要求7或8所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。10.—种二苯亚胂酸降解剂，其中，含有权利要求16中任一项所述的微生物。11.如权利要求io所述的降解剂，其中，含有铁成分。12.—种污染土壤及/或污染地下水的净化剂，其中，含有权利要求16中任一项所述的微生物。13.如权利要求12所述的净化剂，其中，含有铁成分。14.一种降解苯胂酸的方法，其中，使用权利要求16中任一项所述的微生物。15.—种降解洛克沙胂的方法，其中，使用权利要求16中任一项所述的微生物。16.如权利要求14或15所述的方法，其中，在铁成分存在下使用微生物。17.—种苯胂酸降解剂，其中，含有权利要求16中任一项所述的微生物。18.—种洛克沙胂降解剂，其中，含有权利要求16中任一项所述的微生物。19.如权利要求17或18所述的降解剂，其中，含有铁成分。全文摘要本发明提供具有降解二苯亚胂酸能力的微生物、利用该微生物降解二苯亚胂酸的方法、利用该微生物净化污染土壤的方法、含有该微生物的二苯亚胂酸降解剂以及含有该微生物的污染土壤或污染地下水的净化剂。本发明提供具有二苯亚胂酸降解能力的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物、具有二苯亚胂酸降解能力的属于剑菌(Ensifer)属的微生物、使用该微生物净化污染土壤的方法、含有该微生物的二苯亚胂酸降解剂以及含有该微生物的污染土壤或污染地下水的净化剂。文档编号C12N1/20GK101501181SQ20078002988公开日2009年8月5日申请日期2007年8月24日优先权日2006年9月1日发明者原田直树,高木和广申请人:兴和株式会社