件，包括：缺失分析，即从启动子的5'末端或内部 缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电泳迁移 率变动分析、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹分析和其它常规分析；或通过常规序 列比较方法分析与已知顺式元件基序的序列相似性。可以通过诱变（或取代）顺式元件中 的一个或多个核苷酸，或通过其它常规方法，进一步研究所述元件的精细结构（参见例如， MethodsinPlantBiochemistryandMolecularBiology,Dashek编辑，CRCPress, 1997, 第 397-422 页；和MethodsinPlantMolecularBiology,Maliga等编辑，ColdSpring HarborPress，1995,第 233-300 页）。
[0093] 可以通过化学合成或从包含顺式元件的启动子中克隆，获得所述顺式元件。也可 以合成顺式元件，使其具有添加的包含有用限制酶位点的侧翼序列，以利于亚序列操作。在 一个实施方案中，所述启动子由多个独立的"顺式元件"组成。在一个优选的实施方案中， 使用计算机程序鉴定包含以下核酸序列的"顺式元件"的序列区：SEQIDNO:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQID NO:25和SEQIDNO:26,其中所述计算机程序包括但不限于专门设计用于鉴定序列内顺式 元件或结构域或基序的MEME或SIGNALSCAN。
[0094]本发明包括SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQID N0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25 和SEQIDN0:26 的片段或顺式元件， 或者与本发明的核酸序列具有同源性的已知影响基因调节的顺式元件的同源物。这样的核 酸片段可以包括已公开序列的任何区。如SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQ IDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25 和SEQIDN0:26 所示的本发明的启动子区或部分启动子区可以包含至少一种调节元件，所述调节元件包括 但不限于能够例如在雄性生殖组织中调节有效连接的DNA的表达的"顺式元件"或结构域。 [0095] 植物启动子也可以包括通过操作已知启动子以获得合成、嵌合或杂种启动子而 产生的启动子。这样的启动子也可以结合来自一个或多个启动子的顺式元件，例如通过 在具有其自身部分或完全调节序列的活性启动子上添加异源调节序列（Ellis等，EMB0 J. 6 :11_16,1987;Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA84 :8986_8990,1987 ; Poulsen和Chua，Mol.Gen.Genet. 214:16-23,1988;Comai等，Plant.Mol.Biol. 15: 373-381,1991)。也已经通过在无活性的截短启动子的5'上游区添加异源调节序列，发展 出嵌合启动子，所述无活性的截短启动子即仅包括核心TATA并任选包括CCAAT元件的启动 子（Fluhr等，Science232 :1106-1112,1986;Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci. USA84 :8986-8990,1987;Aryan等，Mol.Gen.Genet. 225 :65-71，1991)。
[0096] 依照本发明的嵌合或杂种启动子可以包括至少一种已知的顺式元件，如由各种 环境因子如光、热或胁迫调节的元件；由病原体或化学药品等等调节或诱导的元件。根 据所述条件，这类元件可以或者正调节或者负调节基因的表达。顺式元件的例子包括但 不限于氧效应元件（Cowen等，J.Biol.Chem.268(36) :26904，1993)、光调节元件（参见 例如，Bruce和Quail，PlantCell2:1081，1990 和Bruce等，EMB0J. 10:3015,1991)、 响应茉莉酮酸甲酯处理的顺式兀件（Beaudoin和Rothstein，PlantMol.Biol. 33:835， 1997)、水杨酸效应元件（Strange等，PlantJ. 11 :1315,1997)、热激反应元件（Pelham等， TrendsGenet. 1 :31，1985)、响应创伤和非生物性胁迫的兀件（Loace等，？1'〇(：.似1:1.4〇&(1. Sci.U.S.A. 89 :9230,1992;Mhiri等，PlantMol.Biol. 33 :257,1997)、冷效应元件（Baker 等，PlantMol.Biol. 24 :701，1994Jiang等，PlantMol.Biol. 30 :679,1996;Nordin等， PlantMol.Biol. 21 :641，1993;Zhou等，J.Biol.Chem. 267 :23515,1992)以及干旱效应元 件（Yamaguchi等，PlantCell6 :251-264,1994;Wang等，PlantMol.Biol. 28 :605,1995 ; BrayE.A.TrendsinPlantScience2:48,1997)。
[0097]在另一实施方案中，如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO: 11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQID NO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的核苷酸序列包括任何长度能 够调节有效连接的DNA序列的所述核苷酸序列。例如，如SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQ IDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、 SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29 和SEQIDNO:30 所公开的 序列可以截短或缺失部分序列，但仍然能够调节有效连接的DNA序列的转录。在一个相关 实施方案中，所公开序列的顺式元件可以赋予特定的特异性，例如赋予有效连接的DNA序 列在某些组织中的增强表达。因此，SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQID NO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQ IDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公开序列的任何序列片段、部 分或区可以用作调节序列，其中包括但不限于所公开序列的顺式元件或基序。例如，可以从 启动子序列的5'或3'末端缺失一个或多个碱基对，以产生"截短的"启动子。也可以在启 动子序列内部插入、缺失或置换一个或多个碱基对。可以通过例如将启动子片段置于最小 启动子的上游而构建启动子，以便所述启动子片段或元件有效连接。最小启动子或基础启 动子是能够募集并结合基本转录机器的DNA片段。真核细胞中基本转录机器的一个例子是 RNA聚合酶II复合物及其辅助蛋白。所述基本转录机器的酶促成份能够利用最小或基础启 动子，起始和延伸特定基因的转录。也就是说，在启动子区没有添加的能够募集和结合调节 转录（如增强转录、阻抑转录、使转录成为激素依赖型等等）的转录因子的顺式作用序列。 可以结合取代、缺失、插入或它们的任何组合以产生最终构建物。
[0098] 可以修饰本发明的启动子序列，例如以在其它植物系统内表达。在另一方法中， 可以通过多种方法设计或工程化新型杂种启动子。许多启动子包含激活、增强或确定所述 启动子强度和/或特异性的上游序列（Atchison，Ann.Rev.CellBiol. 4 :127,1988)。例 如，T-DNA基因包含确定转录起始位点的"TATA"框以及其它位于转录起始位点上游调整转 录水平的上游元件（Gelvin，TransgenicPlants,Kung，S. -D?和Us,R.编辑，SanDiego: AcademicPress,第49-87页，1988)。另一种嵌合启动子将章鱼氨酸合酶（ocs)激活剂的三 聚体结合到甘露氨酸合酶（mas)激活子加启动子上，据报道该启动子增加报道基因的表达 (MinNi等，ThePlantJournal7:661,1995)。本发明的上游调节序列可以用于构建这样 的嵌合或杂种启动子。构建本发明变异型启动子的方法包括但不限于组合不同启动子的控 制元件或重复启动子的部分或区（参见例如美国专利5, 110, 732和美国专利5, 097, 025)。 本领域内的技术人员熟悉构建、操作和分离大分子（如DNA分子、质粒等等）、产生重组 生物、筛选和分离基因的特定条件和程序（参见例如Sambrook等，MolecularCloning: ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1989;Mailga等，MethodsinPlant MolecularBiology,ColdSpringHarborPress,1995;Birren等，GenomeAnalysis:第 1 卷，分析DNA，（1997)，第2卷，检测基因，（1998)，第3卷，克隆系统，（1999)，第4卷，基因组 作图，（1999)，ColdSpringHarbor，NewYork)。
[0099] 本发明还包括设计、构建和应用包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、 SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25 和SEQIDNO: 26中一种或多种顺式元件的嵌合或杂种启动子以调整或调节有效连接的核酸序列的表达。
[0100]SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQ IDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、 SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的启动子序列、片段、区或其顺式元件能够在多种组织中转 录有效连接的DNA序列，因此能够在多种组织中选择性调节基因表达。
[0101] 对于许多农学性状，需要在多种组织中转录一个或多个目的基因以赋予所需的特 征。需要获得调节有效连接的基因在选定靶组织中转录的合适启动子，因为可能不希望在 所有组织中表达基因，而是仅在某些组织中表达基因。例如，假如人们希望选择性表达靶基 因以表达除草剂耐性基因，人们可能希望在营养性组织和生殖组织中表达所述除草剂抗性 基因。本发明的启动子序列可以用于在多种组织中调节基因表达，所述组织包括但不限于 快速生长的分生组织、雄性生殖组织（雄蕊群）如花粉、花药和花丝、雌性生殖组织（雌蕊 群）如柱头、花柱和子房、叶、萼片和花瓣。因此，本发明的启动子可用于表达除草剂耐性基 因，例如当在植物发育的多种组织和阶段需要耐性时表达。本发明的启动子序列可用于调 节任何靶基因的转录，所述靶基因包括但不限于控制下列性状的基因：育性、产量、耐虫性、 真菌耐性、除草剂耐性或任何所需性状。尤其优选的基因包括除草剂耐性基因或耐虫性基 因。
[0102] 在一个实施方案中，当需要在多种组织中表达除草剂耐性基因时，本发明的启动 子尤其可用于调节除草剂耐性基因的表达。例如，所述除草剂耐性基因可以赋予对除草剂 草甘膦的耐性。合适的草甘膦耐性基因的例子包括但不限于草甘膦抗性EPSP合酶基因或 降解草甘膦的基因产物如草甘膦氧化还原酶和膦酸N-乙酰转移酶。对于任何植物生物工 程策略而言，获得5'调节元件的广泛选择是重要的，以便获得对于所需的表达分布型最为 有效的合适调节元件。
[0103] 在另一实施方案中，本发明的启动子可用于确定基因功能。许多基因的功能是未 知的，而本发明的启动子可以用作构建物中的遗传元件，以允许对以有义或反义取向表达 的一个或多个基因进行表型评价。当需要在组成组织和生殖组织进行高水平基因表达时， 本发明的启动子可以成为开发用于高通量测定的植物表达构建物的成分。
[0104] 可以选择任何植物来鉴定基因和调节序列。用于分离基因和调节序列的合适植 物靶的例子包括但不限于苜猜、苹果、杏、拟南芥属、朝鲜蓟、芝麻菜、石习柏、鳄梨、香蕉、大 麦、豆类、甜菜、黑莓、越桔、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、canola、网纹甜瓜、胡萝卜、木 薯、篦麻籽、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽叶、柑桔、克里曼丁、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉 花、酸果蔓、黄瓜、花旗松、爺子、苣荬菜、宽叶苦苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、 葡萄柚、蜜瓜、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油 桃、坚果、燕麦、油棕、油料种子油菜（oilseedrape)、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、番 木瓜、欧芹、欧洲防风、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松、菠萝、车前、李、石榴、杨、马铃薯、南 瓜、？？、radiatapine、radiscchio、萝卜、油菜籽、树莓、水稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠 菜、笋瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、红桔、茶树、烟草、番茄、小黑麦、草皮、芜菁、 藤、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。对于鉴定调节序列尤其优选的植物是拟南芥属、玉米、小麦、 大豆和棉花。
[0105] 本发明的启动子序列分离自拟南芥（Arabidopsisthaliana)植物DNA。在一个优 选的实施方案中，构建物包括有效连接可转录序列的本发明启动子序列，以及合适的终止 子和调节元件。可以将这样的构建物转化进合适的靶植物。可以使用任何植物作为包含本 发明启动子序列的核酸构建物的合适宿主。合适靶植物的例子包括但不限于苜蓿、嫩茎花 椰菜、卷心菜、canola、花椰菜、玉米、棉花、酸果蔓、黄瓜、苦苣、豌豆、杨、松、马铃薯、洋葱、 水稻、树莓、大豆、甘蔗、甜菜、向日葵、番茄和小麦。
[0106] 启动子分离和修饰方法
[0107] 可以使用多种方法分离本文公开的启动子序列的片段。可以采用公众可得到的序 列信息，使用基于PCR的方法从植物基因组文库扩增侧翼区。本领域内的技术人员已知多 种扩增与已知序列核心区邻近的未知DNA序列的方法。方法包括但不限于反向PCR(IPCR)、 载体盒（仰(：1：(^61^6)?0?、￥型（￥-81^口6(1)?0?和基因组步查方法。对于本发明，通过可得 的序列信息通过设计PCR引物从拟南芥属分离所述核酸分子。
[0108] 也可以通过其它技术获得核酸片段，例如通过化学方法直接合成片段，正如通常 使用自动寡核苷酸合成仪所进行的实践。也可以通过应