专利名称：一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi及其制备方法
技术领域：
本发明涉及抑制FMDV(ロ蹄疫病毒)防治技术领域，由抑制FMDV复制的两对shRNA序列组成的一种用于抑制FMDV复制的RNAi，本发明还包括RNAi的制备方法。
背景技术：
ロ蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由 ロ 蹄疫病毒(foot-andnouth disease virus, FMDV)引起人畜共患的高度接触性传染病。为小RNA病毒科(Picornaviridae), ロ蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员。FMDV主要感染偶蹄类动物,在全球广泛流行，对畜牧业生产危害极大。因此，国际兽疫局(OIE)将其列为需要上报类传染病，并严格控制其传播。由于FMDV存在7个血清型(A型、O型、C型、Asia I型和南非I型、南非II型、南非III型)和70多个亚型，各型间不存在交叉保护作用，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另ー种类型病毒的感染，如果用ー个型的疫苗免疫家畜，存在很大的盲目性。为了克服目前窘迫局面，研究具有广谱抗FMDV作用的制剂有重要的实践意义。另外，由于FMDV快速传染性和强致病性的特点，给传统的疫苗快速控制ロ蹄疫的流行带来了障碍，所以仅用疫苗和传统的自然育种方法很难完全控制此病。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，是许多生物具有的对抗入侵的核酸。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入，人们发现无论体内还是体外试验，SiRNA均能够抑制多种病毒的増殖。近年来，许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究，取得了良好进展。例如在抗こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和脊髄灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服各型间不存在交叉保护作用，疫苗和传统的自然育种方法难以控制FMD，提供ー种构建靶向FMDV基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的RNA干扰技术，即ー种用于抑制ロ蹄疫病毒复制的RNAi。为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案
ー种用于抑制ロ蹄疫病毒复制的RNAi，包含siRNA序列，通过构建shRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒、用获得的慢病毒感染PK-15细胞，筛选出具有抑制ロ蹄疫病毒复制的PK-15细胞克隆。所述shRNA (short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)序列SEQ ID NO: I至SEQ ID NO:4 包括3D1: 5，一 3’
SEQ ID NO: I T CACCGCGTCATGAGGATAATTTAACCGAAGTTAAATTATCCTCATGACGC
SEQ ID NO:2: B AAAAGCGTCATGAGGATAATTTAACTTCGG
TTAAATTATCCTCATGACGC
3D2: 5，一 3，
SEQ ID NO:3 TCACCGGACCACACAGGAGAAGTTGACGAATCAACTTCTCGTGTATGGTCC
SEQ ID NO:4: B AAAAGGACGATACAGGAGAAGTTGATTCG
TCAACTACTCCTGTATGGTCC
CTCCTCGTGCAACTGGC
所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。所述复制缺陷型慢病毒的获得,包括shRNA表达质粒与Packaging Mix(包装混合物)共同转染293-FT (人胚肾细胞株)细胞，收获细胞上清，获得复制缺陷型慢病毒。所述复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染PK-15，blasticidin抗性筛选，获得抑制ロ蹄疫病毒复制的PK-15细胞克隆。所述抑制ロ蹄疫病毒复制效果的验证方法，包括流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50 (组织细胞半数感染量)及Real-time RT-PCR、。本发明还提供了 RNAi的制备及验证方法，包括以下步骤 a.设计并合成shRNA对应的DNA序列一ds oligo。b.利用T4 DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体。c.转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性。d.将上述质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架。e.获得的表达骨架与优化好的Packaging Mix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子。f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞，将ds oligo整合到宿主细胞的基因组上。g. blasticidin抗性筛选，建立稳定抑制ロ蹄疫复制的PK-15细胞克隆。h.分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID5tl (组织细胞半数感染量)及Real-time RT-PCR (实时定量-反转录-聚合酶链反应)验证shRNA抑制效果。FMDV遗传变异频率高，抗原差异大，血清学分析发现了 7种血清型和超过80种亚型，并且每个亚型都有许多基因组变异的毒，FMDV能够通过表面结构蛋白上的抗原决定簇变异逃避机体的免疫监视，即便是面对RNAi，病毒仍能够通过RNA中碱基的删除或突变进行逃逸。所以RNAi技术运用于抗病毒研究首先就要解决病毒高度遗传变异带来的逃逸这ー关键问题。解决上述问题的办法之一就是设计的shRNA靶向病毒基因组的高度保守区域。干扰靶序列的保守性越高，交叉抑制各种血清型FMDV的潜力就越大。3D基因属于FMDV非结构蛋白基因，均高度保守。3D为RNA依赖的RNA聚合酶，催化病毒RNA的合成。病毒以VPg-pU-pU作为引物，以3Dpol蛋白为RNA聚合酶，以2BC、3A及ー些宿主蛋白因子组成复制复合物，附着在细胞质内膜上合成负链RNA，再以负链RNA为模板合成正链RNA。在FMDV不同的血清型和亚型中，3D的核苷酸序列高度保守。鉴于以上分析，本研究选择了在FMDV复制过程中发挥重要作用并且具有较高保守性的3D基因区域作为干扰靶区。 按照shRNA序列选择的一般原则，利用Invitrogen公司的BLOCK-it RNAiDesigner在线设计程序初步筛选ー些shRNA序列，同时对干扰靶位序列进行了同源性分祈。从BLAST检验结果可以看出，所选shRNA干扰靶序列在较广泛流行的Asia 1、0、C、A血清型间保守性较高，而且有的靶序列在7个血清型中都有很高的保守性。当前较为常用的5种制备siRNAs的方法是体外转录法、直接化学合成法、长片段dsRNAs经RNase III类(如Dicer)降解、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达、siRNA质粒表达载体或病毒载体在细胞内表达siRNAs五种。前三种涉及到RNA操作，对实验室的要求较高。利用表达载体在细胞内表达siRNA不仅可以避开RNA操作，而且可以长效、稳定的产生RNAi效应。常用siRNA表达载体的启动子属于RNA聚合酶III (pol III)，主要·有鼠源的U6启动子、人源的U6启动子和人Hl启动子3种。各种siRNA表达载体转录出的产物是可折叠形成的shRNA，然后在细胞中被Dicer酶切割成siRNA，进而启动RNAi介导基因沉默。使用siRNA表达载体需要合成2条编码shRNA序列的DNA单链，经退火后插入对应载体的pol III启动子下游。本发明使用的PEN/U6是含有人源U6启动子的shRNA表达载体，它是由Pol III启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制子等組成。利用已经线性化载体的粘性末端的碱基特性，将合成的一对带有4个碱基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并连接到上述PEN/U6载体。这种部分具有回文结构的DNA序列在RNA pol III启动子的作用下可以在哺乳动物细胞内转录出众多的shRNA，从而启动RNA干扰过程。FMDV 3Dpol为RNA依赖的RNA聚合酶，催化病毒RNA的合成，而且高度保守，因此针对3D的RNAi可以突破血清型的壁垒，解决传统疫苗免疫血清型间不能交叉保护的问题。本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用，并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制FMDV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。
图I为表达shRNA的3D1 ds oligo与pEN/U6载体连接的重组质粒测序结果示意 图2为表达shRNA的3D1和3D2 ds oligo与pEN/U6载体连接的重组质粒测序结果示意 图3为pENU6/3DI-shRNA与plentil6/DEST表达载体重组的测序结果示意 图4为pENU6/3D2-shRNA与plentil6/DEST表达载体重组的测序结果示意 图5为间接免疫荧光验证shRNA对FMDV复制的抑制效果；
图6为TCID5tl測定shRNA抗病毒效果；
图7为real-time RT-PCR验证shRNA对FMDV复制的抑制效果；图8为流式细胞术验证shRNA对FMDV复制的抑制效果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述 实施例I
1、表达shRNA的dsoligo的生成
借助美国Invitrogen公司网上在线设计软件(BLOCK-iT RNAi Designer),确定针对PEN/U6载体要求的具体shRNA片段3D1及3D2对应的DNA插入序列，送与宝生物工程(大连)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下
3D1: 5，一 3’
SEQ ID NO:I T CACCGCGTCATGAGGATAATTTAACCGAAGTTAAATTATCCTCATGACGC
SEQ ID NO:2: B AAAAGCGTCATGAGGATAATTTAACTTCGG
TTAAATTATCCTCATGACGC
3D2: 5，一 3，
SEQ ID NO:3 TCACCGGACCACACAGGAGAAGTTGACGAATCAACTTCTCGTGTATGGTCC
SEQ ID NO:4: B AAAAGGACGATACAGGAGAAGTTGATTCGTCAACTACTCCTGTATGGTCC
2、dsoligo 与 pEN/U6 载体连接，构建 pEN/U6_shRNA 连接反应体系
2. I双链寡核苷酸(ds oligo)的生成
(1)在O. 2ml的PCR扩增管中建立下列体系
权利要求
1.一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi，其特征在于包含SiRNA序列，通过构建ShRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15细胞，筛选表达shRNA的PK-15细胞克隆并验证其对FMDV的抑制效果。
2.根据权利要求I所述的一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi，其特征在于所述shRNA 序列 SEQ ID NO: I 至 SEQ ID N0:4，包括3D1: 5，一 3’SEQ ID NO:I T CACCGGAGTTGAGCTGGACTCTTACCGAAGTAAGAGTCCAGCTCAACTCCSEQ ID NO:2 B AAAAGGAGTTGAGCTGGACTCTTACTTCGGTAAGAGTCCAGCTCAACTCC3D2: 5’ — 3’SEQ ID N0:3 T CACCGCGGTTGGTTGTAATCCTGATCGAAATCAGGATTACAACAACCGCSEQ ID NO:4 B AAAAGCGGTTGGTTGTAATCCTGATTTCGA TCAGGATTACAACCAACCGC 。
3.根据权利要求I或2所述的一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi，其特征在于所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。
4.根据权利要求I所述的一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi，其特征在于所述完整慢病毒的获得是将shRNA表达质粒与Packaging Mix共同转染293-FT细胞，收获细胞上清，获得具有感染性的慢病毒。
5.根据权利要求I所述的一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi，其特征在于所述用收获复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，采用灭瘟素blasticidin进行抗性筛选获得表达shRNA的PK-15细胞阳性克隆。
6.一种如权利要求I所述RNAi的制备方法，包括以下步骤 a.设计并合成shRNA对应的DNA序列一dsoligo ； b.利用T4DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体； c.转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性； d.将上述pEN/U63Dl和3D2两种质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架； e.获得的表达骨架与PackagingMix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子; f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞； g.blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15细胞阳性克隆； h.分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID5tl及Real-timeRT-PCR验证抑制效果。
全文摘要
一种用于抑制口蹄疫病毒复制的RNAi及其制备方法，所述包含siRNA序列、shRNA慢病毒表达载体构建、复制缺陷型慢病毒的获得、慢病毒感染PK-15细胞(猪肾细胞)以及抑制口蹄疫病毒复制效果的验证方法，该序列具有明显抑制口蹄疫病毒在敏感细胞上复制的作用。本发明对口蹄疫病毒体内外复制进行RNA干扰的探索，构建靶向口蹄疫病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术，有望构建靶向口蹄疫病毒的siRNA的转基因动物。为RNAi应用于口蹄疫病毒的基因功能研究以及口蹄疫的防治积累了必要的实验数据，为动物的抗病育种提供前期准备。
文档编号C12N15/867GK102660546SQ20121018050
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者刘永杰, 刘湘涛, 吴锦艳, 尚佑军, 尹双辉, 张克山, 杨顺利, 王光祥, 田宏, 陈妍, 靳野, 魏衍全 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所