专利名称：一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法
技术领域：
本发明涉及抑制猪瘟病毒复制的方法，具体说是由三对ShRNA序列组成的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，本发明还包括RNAi的制备方法。
背景技术：
猪瘟(Classical swine fever, CSF)是世界范围内严重危害养猪业的传染病之一。为了区别于非洲猪痕，欧洲人称其为“古典猪痕(Classical swine fever, CSF) ”。其病原是猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。CSFV是RNA病毒,属黄病毒科(Flaviridae)、痕病毒属(Pestivirus)的成员，与同属的牛病毒性腹 写病毒(Bovine viraldiarrhea virus, BVDV)和绵羊边界病病毒(Border disease virus, BDV)在抗原性和结构上关系密切。CSFV是具有囊膜的正链RNA (核糖核酸)病毒，具有感染性。CSFV基因组共编码4种结构蛋白、8种非结构蛋白。结构蛋白编码区占据病毒基因组Y端的1/3，非结构蛋白编码区除Νρι·ο编码序列位于基因组5'端外，其余均位于病毒基因组3'端的2/3。一般认为病毒侵染细胞是通过囊膜蛋白与细胞表面受体相互作用形成Infecosome (感染复合体)后进入宿主细胞。然而对CSFV感染细胞的细节尚不甚明了。而传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对猪瘟的暴发和流行，RNAi (核糖核酸干扰)现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展，为猪瘟的防制研究开辟了一个新的探索领域。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过内、夕卜源双链RNA触发的，由19_23bp小分子干扰RNA片段(SiRNA)诱导的同源性mRNA (信使RNA)的降解，从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程。它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默，是生物体在进化过程中，抵御病毒感染及因重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制，同时也是一种真核生物体内的基因调控机制。分子生物学研究的早期，人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的。近年来，反向遗传学技术广泛应用于基因功能的研究，使人们对基因功能的研究取得了飞跃式的发展，但该技术在基因重组方面耗时费力。在如今的后基因组时代，RNAi技术以其独特的优势成为分析基因功能的又一种方法，得到了广泛的认同。近年来，许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究，取得了良好进展。例如在抗乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以控制猪瘟的不足，构建靶向猪瘟病 毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导稳定整合的RNA干扰技术，本发明还提供该技术的制备方法。为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案
一种用于抑制猪痕病毒复制的RNAi,包含siRNA序列,通过构建shRNA(short hairpinRNA即短发夹脱氧核糖核酸)慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用获得的慢病毒感染PK-15细胞，筛选出具有抑制猪瘟病毒复制的PK-15细胞克隆。所述序列SEQ ID NO: I 至 SEQ ID NO:6 包括
Nprol15: 5’ — 3’
SEQ ID NO:I T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGAATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC
SEQ ID NO:2 B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA
ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC
Npro207: 5， — 3，
SEQ ID NO:3 T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGAATATACTAGCCTAATAGTGGGC
SEQ ID NO:4 B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG
TATACTAGCCTAATAGTGGGC
NS5B303: 5’ — 3’
SEQ ID NO:5 T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAAGATTGTGGTTGTATTTCTCCC
SEQ ID NO:6 B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCGGATTGTGGTTGTATTTCTCCC
所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。所述复制缺陷型慢病毒的获得,包括shRNA表达质粒与Packaging Mix (包装混合物)共同转染293-FT (人胚肾细胞株)细胞，收获细胞上清，获得复制缺陷型慢病毒。所述复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染PK-15，blasticidin抗性筛选，获得抑制猪瘟病毒复制的PK-15细胞克隆。所述抑制猪瘟病毒复制效果的验证方法，包括流式细胞术、间接免疫荧光及Real-time RT-PCR、
本发明还提供了 RNAi的制备及验证方法，包括以下步骤 a.设计并合成shRNA对应的DNA序列一ds oligo。b.利用T4 DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体。c.转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性。d.将上述 pEN/U6-Nproll5，pEN/U6-Npro207，pEN/U6-NS5B303 三种质粒分别与PDEST载体进行LR重组，获得表达骨架。e.获得的表达骨架与优化好的Packaging Mix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子。f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞，将ds oligo整合到宿主细胞的基因组上。g. blasticidin抗性筛选，建立稳定抑制猪瘟复制的PK-15细胞克隆。
h.分别用Real-time RT-PCR (实时定量-反转录-聚合酶链反应)、间接免疫荧光及流式细胞术验证抑制效果。CSFV的抗原性呈多样性而且比较复杂，具有不同的血清变种。另外CSFV基因组为单股正链RNA，相当于mRNA，为单顺反子结构。基因组RNA没有单一准确的核酸序列，呈现类群分布，这种特性使得CSFV在变异及适应性方面具有很大的灵活性，即便是面对RNAi，病毒仍能够通过RNA中碱基的删除或突变进行逃逸。所以RNAi技术运用于抗病毒研究首先就要解决病毒高度遗传变异带来的逃逸这一关键问题。解决上述问题的办法之一就是设计的shRNA靶向病毒基因组的高度保守区域。干扰靶序列的保守性越高，抑制CSFV的潜力就越大。Npro是CSFV的非结构蛋白，也是CSFV基因组大ORF编码的第一个蛋白，Npro蛋白具有蛋白酶自身催化活性，可自动从正在合成的病毒多聚蛋白中裂解下来，又因为其位于CSFV病毒多聚蛋白序列的N端，故得名Νρι·ο。另外，CSFV的另外一个非结构蛋白NS5B由728个氨基酸组成，分子量82kDa，N端为Ser3181，C端为Val3898，为呈碱性亲水性蛋白。因氨基酸序列中含有RNA聚合酶的典型活性基序(Gly-Asp-Asp)，是病毒RNA复制酶。通过对上述非结构蛋白的分析发现，Npro和NS5B基因序列高度保守。鉴于此，本发明针对猪瘟病毒基因组中高度保守的NpiO和NS5B区域作为靶序列。按照shRNA序列选择的一般原贝U,利用Invitrogen公司的BLOCK-it RNAiDesigner在线设计程序初步筛选一些shRNA序列，同时对干扰靶位序列进行了同源性分析。当前较为常用的5种制备siRNAs的方法是体外转录法、直接化学合成法、长片段dsRNAs经RNase III类(如Dicer)降解、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达、siRNA质粒表 达载体或病毒载体在细胞内表达siRNAs五种。前三种涉及到RNA操作，对实验室的要求较高。利用表达载体在细胞内表达siRNA不仅可以避开RNA操作，而且可以长效、稳定的产生RNAi效应。常用siRNA表达载体的启动子属于RNA聚合酶III (pol III)，主要有鼠源的U6启动子、人源的U6启动子和人Hl启动子3种。各种siRNA表达载体转录出的产物是可折叠形成的shRNA，然后在细胞中被Dicer酶切割成siRNA，进而启动RNAi介导基因沉默。使用siRNA表达载体需要合成2条编码shRNA序列的DNA单链，经退火后插入对应载体的pol III启动子下游。本发明使用的PEN/U6是含有人源U6启动子的shRNA表达载体，它是由Pol III启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制子等组成。利用已经线性化载体的粘性末端的碱基特性，将合成的一对带有4个碱基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并连接到上述PEN/U6载体。这种部分具有回文结构的DNA序列在RNA pol III启动子的作用下可以在哺乳动物细胞内转录出众多的shRNA，从而启动RNA干扰过程。本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用，并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制FMDV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。
图I为pENU6/115_shRNA重组质粒测序结果示意 图2为pENU6/207-shRNA重组质粒测序结果示意3为pENU6/303-shRNA重组质粒测序结果示意图 图4为pLenti6EX/115-shRNA表达质粒测序结果示意图 图5为pLenti6EX/207-shRNA表达质粒测序结果示意图 图6为pLenti6EX/303-shRNA表达质粒测序结果示意图 图7为real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟脾脏病毒复制的抑制效果 图8为间接免疫荧光验证shRNA对猪瘟全血病毒复制的抑制效果 图9为real-time RT-PCR验证shRNA对猪瘟全血病毒复制的抑制效果 图10为流式细胞术验证shRNA对猪瘟病毒复制的抑制效果。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述 实施例I
1、表达shRNA的dsoligo的生成
借助美国Invitrogen公司网上在线设计软件(BLOCK-iT RNAi Designer),确定针对PEN/U6载体要求的具体shRNA片段115、207及303对应的DNA插入序列，送与宝生物工程(大连)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下
Nprol15: 5’ — 3’
SEQ ID NO:I T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGAATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC
SEQ ID NO:2 B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA
ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC
Npro207: 5， — 3，
SEQ ID N0:3 T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGAATATACTAGCCTAATAGTGGGC
SEQ ID N0:4 B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG
TATACTAGCCTAATAGTGGGC
NS5B303: 5’ — 3’
SEQ ID N0:5 T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAAGATTGTGGTTGTATTTCTCCC
SEQ ID NO:6 B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCGGATTGTGGTTGTATTTCTCCC
2、dsoligo 与 pEN/U6 载体连接，构建 pEN/U6_shRNA 2. I双链寡核苷酸(ds oligo)的生成
(I)在O. 2ml的PCR扩增管中建立下列体系
权利要求
1.一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于包含SiRNA序列、通过构建ShRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15细胞，筛选表达shRNA的PK-15细胞克隆并验证其对CSFV的抑制效果。
2.根据权利要求I所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述具有抑制效果的shRNA序列SEQ ID NO: I至SEQ ID N0:6，包括Nprol15: 5’ — 3’SEQ ID NO:I T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGAATAAGGTGTGTCTTGGGCATGCSEQ ID NO:2 B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGAATAAGGTGTGTCTTGGGCATGCNpro207: 5， — 3，SEQ ID N0:3 T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGATATACTAGCCTAATAGTGGGCSEQ ID NO:4 B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCGATATACTAGCCTAATAGTGGGCNS5B303: 5’ — 3’SEQ ID NO:5 T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAAGATTGTGGTTGTATTTCTCCCSEQ ID NO:6 B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCGGATTGTGGTTGTATTTCTCCC。
3.根据权利要求I所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。
4.根据权利要求I所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述完整假病毒的获得是将shRNA表达质粒与Packaging Mix共同转染293-FT细胞，收获细胞上清，获得具有感染性的慢病毒。
5.根据权利要求I所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述用收获复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，采用灭瘟素blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15阳性细胞克隆。
6.一种如权利要求I所述RNAi的制备方法，包括以下步骤 a.设计并合成shRNA对应的DNA序列一dsoligo ； b.利用T4DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体； c.转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性； d.将上述pEN/U6-Nproll5，pEN/U6-Npro207，pEN/U6-NS5B303 三种质粒分别与 pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架； e.获得的表达骨架与PackagingMix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子; f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞； g.blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15细胞阳性克隆； h.分别用Real-timeRT-PCR、间接免疫荧光及流式细胞术验证抑制效果。
全文摘要
一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法，所述包含siRNA序列，shRNA慢病毒表达载体构建，复制缺陷型慢病毒的获得、慢病毒感染PK-15细胞(猪肾细胞)以及抑制猪瘟病毒复制效果的验证方法，该序列具有明显抑制猪瘟病毒在敏感细胞上复制的作用。本发明对猪瘟病毒体内外复制进行RNA干扰的探索，构建靶向猪瘟病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术，有望构建靶向猪瘟病毒的siRNA的转基因动物。为RNAi应用于猪瘟病毒的基因功能研究以及猪瘟的防治积累了必要的实验数据，为动物的抗病育种提供前期准备。
文档编号C12N15/10GK102660544SQ20121018032
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者刘永杰, 刘湘涛, 吴锦艳, 尚佑军, 尹双辉, 张克山, 杨顺利, 王光祥, 田宏, 陈妍, 靳野 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所