专利名称：结核分枝杆菌Rv3120的重组蛋白、其制备方法及其在细胞免疫诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药体外诊断试剂领域，特别涉及一种新型结核病免疫标志物Rv3120的重组蛋白、其制备方法及其在细胞免疫诊断中的应用。
背景技术：
结核病由病原体——结核分枝杆菌感染机体所致，至今仍为人类重要的传染病。快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床 需要；BaCteC技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至销毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。目前广泛应用的结核病细胞免疫诊断技术仍依赖于皮试检测试剂一结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(Pro)。然而pro存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低。因而发现新的结核病细胞免疫标志物，并建立新的结核病细胞免疫诊断方法是结核病诊断所亟需的。
发明内容
为克服现有技术中的上述问题，本发明的一个目的是提供一种结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒，在Rv3120该天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签。所述Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ IDNO: I中从氨基末端第I至第153位氨基酸残基序列组成。SEQ IDNO: I中从氨基末端第154至第353位氨基酸残基序列组成天然Rv3120蛋白氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码上述的Rv3120重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rv3120重组蛋白活性的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA ；(2)扩增 Rv3120 基因;(3)Rv3120基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rv3120 ； (6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白，其中，在制备结核分枝杆菌Rv3120基因中采用的引物为Rv3120_F和Rv3120_R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rv3120_R的核苷酸序列如SEQ ID No:4 所示。本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120_R，所述Rv3120-F的核苷酸序列为如SEQ ID No:3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列为如SEQID No:4 所示。本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白、其特异性抗体或其基因引物在制备结核病检测试剂盒中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120_F的核苷酸序列为如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。本发明的另一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。本发明的目的是提供一种包含所述结核分枝杆菌Rv3120基因的重组质粒。本发明的另一个目的是提供一种新型结核诊断试剂，其含有所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。本发明的再一个目的是提供上述试剂的制备方法。本发明的一个方面，提供了一种包含所述结核分枝杆菌Rv3120基因的重组质粒，即将Rv3120基因序列插入商用表达质粒序列中。Rv3120基因NCBI登陆号为NC_000962. 2 ;蛋白号为CAB08377. I。本发明的“Rv3120基因序列”也包括对NC_000962. 2中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与NC_000962. 2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962. 2的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本发明的重组质粒，通常将Rv3120基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。本发明的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。本发明中可采用的载体有pET32a等。本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET32a。
本发明的另一方面，提供了一种结核分枝杆菌相关重组蛋白，该蛋白是将插入Rv3120基因的重组表达质粒转入宿主细胞而得到的。用作检测试剂的Rv3120重组蛋白与NCBI上的CAB08377. I蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET32a质粒时，蛋白序列前面加了 pET32a上的一段Trx · Taq和S · Taq融合标签和一段His Tag纯化标签。所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌(E. coli)。用于转化的宿主细胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本发明的一个实施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本发明的另一方面，提供了上述结核分枝杆菌相关蛋白的制备方法，包括以下步骤(I)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；(2) Rv3120 基因的扩增；(3)Rv3120基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rv3120 ；(6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白。上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。本发明的Rv3120基因序列可以用PCR扩增法获得。可根据本发明所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用本领域技术人员已知的常规方法所制备的基因组DNA为模板，扩增而得到相关序列。本发明中，重组蛋白所用的表达质粒可以是pET32a等。本发明的一个实施例中，重组蛋白Rv3120按如下方法得到设计引物(Rv3120_F(SEQ ID No:3):CAAGGTACCATGAGTCCGTCTCCATCG;Rv3120-R (SEQ ID No:4):CCTAAGCTTCTACAGTGACCGTTGGGC)以H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv3120基因，该基因的PCR产物经纯化后双酶切，克隆构建质粒。测序表明所插入的序列与GeneBank中H37Rv结核全基因组对应基因序列(Rv3120基因NCBI登陆号为NC_000962. 2;蛋白号为CAB08377. I)完全一致。将验证好的重组质粒转化到宿主细胞进行蛋白表达。
本发明中，表达Rv3120蛋白所用的宿主细胞为大肠杆菌的BL2KDE3)菌株或BL21plysS (DE3)菌株。本发明中，诱导表达Rv3120蛋白可采用多种方法，如使用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本发明中，分离纯化重组Rv3120蛋白也可采用多种方法，如亲和层析、离子交换
层析等。本发明的一个实施例中，重组Rv3120蛋白可以按如下方法获得将鉴定好的重组质粒加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置45min，42°C水浴锅中热击90秒，冰浴3min，加入500ul的不含抗生素的预热的LB培养基。37°C摇床，220rmp,培养45_60min。取一定量在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37°C温箱中培养过夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp, 37°C培养OD至O. 6左右，加入IPTG，37°C 3h，收集IPTG诱导后的菌体，重悬后超声破碎。目的蛋白含于上清中，IOOOOg离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱进行亲和纯化(2CV去离子水冲洗，5CV含5mM咪唑的washing BufferI平衡,6CV含目的蛋白上清上样，6CV含5mM咪唑的washingBuffer I 冲洗，6CV 含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 冲洗，IOCV 含 500mM 咪唑的 ElutionBuffer洗脱)，收集过柱纯化的目的蛋白，用20mM Tris-HCl，pH 8. O的溶液透析，IOkDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度。本发明的另一方面，提供了重组蛋白Rv3120在结核病诊断中的应用。Rv3120是钥辅因子生物合成蛋白E的一个成员，位于RD5区。本发明的重组蛋白用于结核病检测试剂盒的制备，可以用重组Rv3120进行免疫反应，也可以用Rv3120基因引物对患者血液抽提物进行PCR，从而达到检测目的。 本发明提供了一种检测结核病的诊断方法，它含有重组蛋白Rv3120。本发明的方法主要基于ELI SPOT检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISP0T酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果O其实施方法参考实施例3。与天然结核分枝杆菌Rv3120蛋白相比，该重组蛋白更易采用亲和层析的方法进行纯化，纯度可达90%以上，不仅大大降低了其生产成本，而且也具有更高的稳定性，该重组蛋白在不冻干的情况下4°C可保存I周，-20°C可保存3个月，_80°C至少保存I年。
本发明基于免疫组学的研究成果，首次报道了 Rv3120特异性抗原可以应用于结核病诊断，且是一个活性较强的T细胞靶抗原，用于结核病细胞免疫学诊断，具有较高的敏感性高，而且相比皮试试验，更为快速和安全可靠。
图I是重组蛋白Rv3120经进一步纯化及浓缩后的SDS-PAGE图。I是蛋白分子量标准，2是纯化浓缩后的目的蛋白(5yg)，3是纯化浓缩后的目的蛋白(2.5yg)。图2是抗原ESAT6，CFP10, Rv3120及对照组试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本方面的内容。实施例I重组质粒pET32a_Rv3120的构建(I)靶基因引物设计
Rv3120-F (SEQ ID No:3) CAAGGTACCATGAGTCCGTCTCCATCGRv3120-R (SEQ ID No:4) CCTAAGCTTCTACAGTGACCGTTGGGC酶切位点分别为Kpn I、Hind III。(2)靶基因的PCR扩增、克隆及序列测定以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模 板，Rv3120_F和Rv3120_R为引物，应用Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，通过PCR直接扩增Rv3120蛋白基因。PCR反应条件94°C预变性 5min ；(94°C,30s ；58°C,30s ；72°C,40s)35 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，后用DNA回收试剂盒(Invitrogen)回收。用Kpn I和Hind III酶切，克隆构建入pET32a质粒Kpn I和Hind III酶切位点中。测序表明所插入的序列和GeneBank中H37Rv结核全基因组相应基因序列(Rv3120基因NCBI登陆号为NC_000962. 2 ;蛋白号为CAB08377. I)完全一致。实施例2重组蛋白Rv3120的诱导表达及纯化将O. 5ul测序正确的重组pET32a-Rv3120质粒放入IOOul大肠杆菌BL21 (DE3)PhysS感受态细胞(TIANGEN)中，冰上放置45min，42°C水浴锅中，热击90s，冰上静置3min，加入500ul的不含抗生素的预热的LB培养基，37°C摇床，220rmp,培养45_60min。取一定量在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37°C温箱中培养过夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37°C培养OD至O. 6左右，加入终浓度为IOmM IPTG，37°C 3h，收集IPTG诱导后的菌体，按IOml Washing BufferI每克湿菌的比例重悬后超声破碎。结果目的蛋白含于上清中。IOOOOg离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱(Bio-Rad)进行亲和纯化(2CV去离子水冲洗，5CV含5mM咪唑的washing Buffer I平衡，6CV含目的蛋白上清上样，6CV含5mM咪唑的washing Buffer I冲洗，6CV 含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 冲洗，IOCV 含 500mM 咪唑的 Elution Buffer 洗脱)，收集过柱纯化的目的蛋白(如图I所示)，用20mM Tris-HCl，pH 8. O的溶液透析，IOkDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度，SDS-PAGE电泳分析目的蛋白纯度。本实施例的重组蛋白镍柱亲和纯化后，纯度可达90%以上，不仅大大降低了其生产成本，而且也具有更高的稳定性，该重组蛋白在不冻干的情况下4°C可保存I周，_20°C可保存3个月，_80°C至少保存I年。实施例3重组Rv3120抗原作为检测试剂对临床可疑结核病人检测。具体步骤是操作步骤I、样本采集无菌采集人外周静脉血约5ml至肝素抗凝管中，样本采集后可于室温下保存，不要放置在冷藏或冷冻室；并做好标记。2、外周血单个核淋巴细胞的分离、收集及计数a、取5ml的全血，加入等体积的RTPMI-1640无血清培养液，并混匀。b、取一支15ml离心管加入4ml的淋巴细胞分离液，并将混匀的血样缓缓加入到淋巴细胞分离液的表面，两者之间的界限要明显，不要混匀，盖紧管盖，轻拿轻放。C、将离心管放入水平离心机，IOOOg,室温，离心22min，小心取出后可见血液成分分层。
d、用一次性吸管将单个核淋巴细胞层转移到新的15ml离心管中，并加入IOmlRTPMI-1640无血清培养液进行混匀，放入离心机中600g离心洗涤lOmin，在加入无血清培养液,350g离心IOmin ；e、取出离心管弃上清，加入400 μ I的RPMI_1640含血清培养液，吹打细胞混匀，吹打时要轻柔，尽量避免细胞受外力的损伤。f、取120ul于自动计数仪(Sysmex，XT_2000i)上进行淋巴细胞计数。g、调整细胞浓度至2. 5 XlOfVml，配制500 μ I ；3、板的活化200μ I/we 11RPMI-1640 含血清培养液，5-lOmin，倾倒。4、按照实验设计安排每个检测样本需2个孔，加入不同的样本细胞100 μ I/well ο阴性对照每孔加入10 μ 1RPMI-1640含血清培养液阳性对照每孔加入10 μ IPHA测试孔a:每孔加入10 μ I结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6(根据下文的常规方法制备)5ug/ml测试孔b:每孔加入10 μ I结核分枝杆菌特异性抗原CFPlO (根据下文的常规方法制备)5ug/ml刺激抗原每孔加入IOul结核分枝杆菌重组抗原Rv312010ug/ml其中结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6和CFPlO是现有常用的诊断抗原，ESAT6和CFPlO重组蛋白的常规制备方法为以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，用蛋白的特异性引物按常规基因工程方法构建pET2 la-esat6或Pet32a_cf p 10重组质粒，转入大肠杆菌BL21 (DE3 )PhysS表达菌株，ImMIPTG 37°C诱导3h即可获得大量的重组蛋白，镍柱亲和纯化其纯度达90%以上，将重组蛋白用20mM Tris-HCl，pH 8. O透析后超滤浓缩，BCA法检测蛋白浓度，按Img/管分装,冻干保存。5、当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37°C，5%C02培养箱培养16_20hr(17h)；6、在取出培养板之前半个小时，准备好拍水纸、加样槽(洗液)、洗瓶、将50X洗液放置室温下平衡一会，配制IXWashing buffer,根据实验方案而定。7、洗板倾倒孔内液体，200 μ I/well的IXWashing buffer,洗漆5次，每次30sec，拍干，要用力拍，拍干净；PBS洗液；8、加已经稀释好的酶标抗体，50 μ l/well，4°C温箱，孵育Ihr ;—步法反应。9、洗板倾倒孔内液体，200 μ I/well的IXWashing buffer,洗漆5次，每次30sec，拍干，要用力拍，拍干净；10、显色加入配好的显色液，100 μ 1/well,室温避光保存7min ；
11、待斑点生长到适合的大小后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。拍干之后取下保护层，自然晾干。勿将板放置烤箱内，防止膜发脆破裂；也可直接用自来水直接冲洗，但不能将孔直接对着水流，而应将板子竖着用水冲洗，水流要和缓，并可将板条取下，轻轻冲洗底面后甩干，放置待自然晾干。12、ELISP0T板斑点计数,并记录斑点的各种参数，做统计分析(如图2所示)。
结果判断当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果(I)如果阴性对照孔斑点数为0-5，用测试孔A或B的斑点数减去阴性对照孔斑点数彡6 ；(2)如果阴性对照孔斑点数彡6，测试孔A或B的斑点数必须大于2倍的阴性对照孔斑点数。结果解释阳性结果提示检测样本中含有针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞；阴性结果提示检测样本中不含有针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞。表2是是重组蛋白Rv3120与现有的ESAT6，CFPlO分别刺激临床标本产生致敏T淋巴细胞实验结
果O表IELISPOT试验设计
权利要求
1.一种结核分枝杆菌RV3120重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒,在Rv3120该天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签。
2.根据权利要求I所述的Rv3120重组蛋白，其特征在于，所述Trx· Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ ID NO: I中从氨基末端第I至第153位氨基酸残基序列组成。
3.一种编码权利要求I或2的Rv3120重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c)SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； d)不同于SEQID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列； e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rv3120重组蛋白活性的核苷酸序列。
4.根据权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA； (2)扩增Rv3120基因； (3)Rv3120基因插入表达质粒； (4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞； (5)诱导表达蛋白Rv3120； (6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白， 其中，在制备结核分枝杆菌Rv3120基因中采用的引物为Rv3120-F和Rv3120_R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示，所述引物Rv3120_R的核苷酸序列如SEQID No:4 所示。
5.权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rv3120蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120-F的核苷酸序列为如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120-R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。
7.权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白、其特异性抗体或其基因引物在制备结核病检测试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120_F的核苷酸序列为如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。
9.一种结核病检测试剂盒，其特征在于，其组分中的检测抗原是权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。
全文摘要
本发明提供一种结核分枝杆菌特异性标志物Rv3120的重组蛋白，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明还提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的编码核苷酸序列、所述重组蛋白的制备方法及其用途。本发明基于免疫组学的研究成果，首次报道了一种结核分枝杆菌免疫优势抗原Rv3120。用于结核病细胞免疫学诊断，具有较高的敏感性高，而且与传统皮试试验相比，具有更为快速和安全可靠的优点。
文档编号C12Q1/68GK102718848SQ20121017966
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者余晓丽, 孙战强, 张舒林, 王洪海, 赵俊伟 申请人:上海交通大学