专利名称：检测肝豆状核变性atp7b基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒。
背景技术：
肝豆状核变性又称Wilson’ s病(WD)，是遗传性铜代谢紊乱的常染色体隐性遗传性疾病，主要累及中枢神经系统和肝脏。WD基因已被克隆且定位于13ql4. 3-21. 1，有21个外显子和20个内含子，cDNA全长4398bp，其表达产物ATP7B蛋白为含1465个氨基酸的多肽，故本病基因又称为ATP7B基因。ATP7B基因突变形式较多，据(http://www.hgmd. org/)截止2009年12月已发现400种不同的突变，主要突变形式为错义突变，无义突变，缺失和插入等。ATP7B基因突变十分复杂，但以少数几个热点突变为主，伴有广泛存在的罕见突变 为特征，具有明显的种族和区域差异性，并且WD患者大多为复合杂合子突变，少数为纯合突变该病在世界各地广泛存在，流行病学调查显示地中海人群中每5000人中就有I人患病，每90人中就有I人是致病基因的携带者。多数研究已证实Hisl069Gln为欧洲人的一个典型突变热点，而亚洲人的突变热点为Arg778Leu，中国人群中Arg778Leu发病率为70%，因此基因检测位点的选择要有种族特异性和针对性，避免无的放失。与患者拥有相同基因型的家族成员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员，有可能是杂合子携帯者需加以关注。基因鉴定的方法不仅显著提高了不典型病例的诊断率，使肝豆状核变性发病年龄的确认被分别提前至3岁和延后至70岁，同时利用基因鉴定进行产前诊断也成为有效降低发病率的重要手段。对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，并同时避免不必要的驱铜治疗。因而寻找更经济、快捷的基因鉴定法使该项检查能够在所有高危人群中得到应用。“HRM”(High_Resolution Melt analysis)高分辨率溶解曲线。2002 年，美国 Utah大学和Idaho科技公司共同合作开发了 HRM技术，是近年来新兴的ー种核酸序列分析技木，具有极高的特异性和灵敏度。HRM与SYBRGreen染料溶解曲线功能相似，只是收集信号更多。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。HRM方法优点是检测遗传变异是高度特异且精确，低成本(无需序列特异性探针)，操作简便，快速，高通量。
发明内容
本发明的目的在干，提供一种检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，可用于检测ATP7B基因突变位点，特异性好，灵敏度高。检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，包括(i) PCR扩增反应试剂；(ii)用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物
exon 8: Forward: 5 ’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’Reverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’ Reverse: 5，AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3，。进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤⑴采集待测血液样本，提取DNA ； (ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行HRM实验；(iii ) HRM分析确定是否存在第778个碱基G — T突变位点或第952个碱基G — A
突变位点。步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min ;98°C 10s,57 °C 30s,68°C 25s, 20 个循环；最后 68°C 5min。由于中国人的WD突变主要在ATP7B基因外显子8，12上，所以从外显子8，12上设计引物为exon 8:Forward:5’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’ 296bpReverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3，主要检测Arg778Leu 错义突变(CGG — CTG)；exon 12:Forward:5’ ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’ 229bpReverse:5，AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’主要检测Arg952Lys 错义突变(AGA — AAA)。检测的具体步骤如下I、全血DNA提取向样品中抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min)，吸去上清，留下白细胞。之后按照TIANGEN生化有限公司的血液基因组提取试剂盒(货号DP318-02)说明书进行DNA抽提。2高分辨率熔解曲线法检测W)基因突变高分辨率熔解曲线分析所需野生型标准品的制备以Genebank中发布ATP7B的Exon 8及Exon 12序列为标准，委托上海英潍捷基公司合成上述两个外显子的野生型质粒，并以此作为高分辨率熔解曲线分析中的标准品。高分辨率熔解曲线分析HRM分析用引物见表I。PCR反应体系，反应体系共20ul，成分为 2*K0D PCR Buffer IOul, dNTP (200uM) 4ul，正向引物(10umol/L) lul，反向引物(10umol/L)lul,模板 lul,KOD FX (lU/ul)lul, 10*LC Green 2ul,RNase-freewaterl. 6ul。野生型标准品和待测样品的模板均稀释成同一浓度5ng/ul。检测的仪器为Illumina公司的ECO荧光定量仪，HRM分析与PCR反应同步进行。PCR反应条件为94°C预变性2min，98°C 10s，57°C 30s, 68°C 25s，共 40 个循环，最后 68°C延伸 5min。HRM 分析，从 55°C开始以
0.I0C /s的斜率采集熔解曲线，到55°C结束，用Eco Real-Time PCR System软件对采集后的曲线进行分析。每次HRM分析实验均需同时测试野生型标准品和待测样品。表IHRM分析弓丨物序列检测外显子引物序列扩增产物长度
Exon 8 Forward 5，-AAA(XCTTCACGTTCCTTGTCA-3’ 296 bpReverse 55-AAGGCAGCTCTTTTCTGAAA-3,
Exon 12 Forward 5'-ACTTGTGGTGTTTTATTTCTTCA-3' 229bp Reverse 5’-AACCACC.ATATAGCCCAAGA-3，采用HRM技术，对ATP7B基因突变进行检测。通过特异性的引物和饱和荧光LC-GREEN，检测出与Wilson’s病相关的突变基因位点。可以用于临床作为Wilson’s病的早期发现、早期诊断的辅助性指标以及Wilson’ s病人的早期筛选方法，也可以通过基因检测技术提前干预，父母在孕前就可了解到子女出现遗传性肝豆状核变性的几率，并在孕中对胎儿进行检测，看其是否存在遗传性肝豆状核变性。真正做到“早发现”、“早预防”、“早干预”。
图I是ATP7Bexon8 Arg778Leu突变型与正常基因的溶解曲线图。图2是ATP7Bexonl2 Arg925Lys突变型与正常基因的溶解曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I检测遗传性肝豆状核变性ATP7B exon8和exonl2突变试剂盒，包括(i)HRM PCR扩增反应试剂；包括dNTP、10*PCR缓冲液、Mg2+、双蒸水、Tag酶等。(ii)用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物exon 8: Forward: 5，AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3，Reverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3，；exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’Reverse: 5 ’ AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3 ’。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(i)采集待测血液样本，提取DNA ；(ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中ATP7B基因的HRM PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；进行HRM实验。通过几百例临床受检样本用所设计的ATP7B引物对ATP7B exon8和exonl2基因进行扩増，发现该引物具有较高的扩增稳定性、特异性。实施例2I)样本抽提I. I抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。I. 2加入20 ill蛋白酶K溶液，混匀。I. 3加入200 U I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短
离心以去除管盖内壁的水珠。I. 4加人200 ill无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。I. 5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13，400 X g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。I. 6向吸附柱CB3中加入500 ill缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。I. 7向吸附柱CB3中加入700 ill漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。I. 8 向吸附柱 CB3 中加入 500 ill 漂洗液 PW，12，000rpm (13，400 Xg)离心 30 秒，倒掉废液。I. 9将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。I. 10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 u I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm(13，400 X g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。2)实验过程2. I按样品数n (样品数=待测样本数+阴性对照I个+阳性对照I个)取预混PCR反应液每管20ul分装于反应管中。2. 2将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下
权利要求
1.检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，包括 (i)PCR扩增反应试剂； (ii)用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物 exon 8 Forward: 5’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’Reverse: 5’ AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’exon 12 Forward: 5’ ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’Reverse: 5’ AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤 (i)采集待测血液样本，提取DNA ； (ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行HRM实验； (iii ) HRM分析确定是否存在第778个碱基G — T突变位点或第952个碱基G — A突变位点。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min ；98°C 10s、57°C 30s,68°C 25s, 20 个循环；最后 68°C 5min。
全文摘要
本发明公开了一种检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，包括(i) PCR扩增反应试剂；(ii)用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物exon8 Forward:5’AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA3’，Reverse:5’AAGGCAGCTCTTTTCTGAAA3’；exon12 Forward:5’ACTTGTGGTGTTTTATTTCTTCA3’， Reverse:5’AACCACCATATAGCCCAAGA3’。可用于检测ATP7B基因突变位点，特异性好，灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK102719536SQ20121017942
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者孙翠莲, 徐建成, 方国伟, 王淑一, 陈亦磊 申请人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司