专利名称：用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒。
背景技术：
丙型肝炎病毒(Ifepatitis C Virus，HCV)属黄病毒科，基因组全长9. 5 Kb，它是引发慢性肝炎，肝硬化和肝癌的主要病因之一，是世界范围内亟待解决的公共卫生难题。由于 HCV的RNA聚合酶缺乏校正功能，因而其基因组序列常表现出显著异源性和高度可变性，且已被分为6个主要基因型(1-6)和70多个亚型，而NS5B是常用的HCV分型区域。此外，国内外研究发现HCV基因型不但存在地域分布差异性，其不同基因型与肝病严重程度，干扰素应答也有一定相关性。因此，HCV基因分型检测对研究丙型肝炎传播，诊断，后期治疗及疫苗研制等均有重要意义。HCV基因型具有明显的地域差异性。欧美以I型为主；4型多分布于印度、中东地区；5型局限于南非；我国主要以I型为主，2型占次席，此外某些地区3型也有报道，而6型主要流行于香港和澳门及南方边境地区，总体来看1、2、3、6型为我国常见的HCV基因型。HCV基因型的地区分布为流行病学研究提供了帮助。通过研究基因型分布可以跟踪到人群中HCV爆发的来源，种系分析和群体遗传学的联合应用也可估算出不同基因型的存在时间和传播速度。HCV基因型与肝病严重程度，干扰素应答的关系。目前不少研究发现I型HCV病毒与肝炎慢性化进程和严重的肝病有关，国内相关研究表明I型在慢性肝炎，肝硬化和肝癌中占绝大多，同时表现为谷丙转氨酶含量(ALT)血清含量升高，提示肝细胞有损伤，而3型HCV与肝脏脂肪化的关系较为密切。HCV患者主要的治疗手段是用干扰素或者与利巴韦林联合使用。大量的临床试验表明，HCV基因型被认为在临床治疗方面影响最大。当利巴韦林和干扰素联合治疗时，I型患者的治疗效果没有2、3型的效果好。联合治疗24周后，只有少量的I型患者对联合治疗有持续病毒学应答，而2、3型能达到70%。治疗48周后，I型提高至30%，2、3型仍能保持约70%。6型的治疗效果没有1，3型的明显。因此，在联合治疗前，可先对患者进行HCV分型，再进行相应的治疗，获得最佳效果的同时也减轻患者的经济负担。目前HCV分型有多种方法，如血清学分型法、核酸序列Sanger测序法、型特异性弓丨物扩增分型、型特异探针杂交分型法和限制性长度多态性分析法(RFLP)等。其中核酸序列Sanger测序法是HCV分型检测的“金标准”，但测序检测时间较长，成本高，存在样本交叉污染的风险。通过基于NS5B区域设计的4对相关引物及探针进行HCV实时荧光定量PCR检测，不仅可快速准确的检测我国常见的1、2、3、6型HCV病毒，同时简便的操作流程也降低了污染风险，为临床丙型肝炎病毒分型检测提供一种有效的方法
发明内容
鉴于现有技术中HCV分型方法的不足，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测检测丙肝病毒(HCV)基因型的试剂盒，可用于检测我国常见的1、2、3、6型HCV病毒。用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括
(1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；
(2)用于扩增样本cDNA的4对引物及相应的探针其中，
检测I型HCV病毒的引物及探针
SEQl TTCACGGAGGCTATGACYAGG ；
SEQ2 GGGTCACGGGTGAGATAGTASAC ；
SEQ3 FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ；
检测2型HCV病毒的引物及探针
SEQ4 CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ；
SEQ5 ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ；
SEQ6 FAM- ACAGGCGTTGCCGCGCCA-TAMRA ；
检测3型HCV病毒的引物及探针
SEQ7 TCACTCTGCCCGRTCGAART ；
SEQ8 ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ；
SEQ9 FAM- AGGACGTTCGCTCCTTGTCCAGCA-TAMRA ；
检测6型HCV病毒的引物及探针
SEQlO CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ；
SEQll GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ；
SEQI2 :FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。
进一步地,所述RNA提取试剂包括Trizol,氯仿,异丙醇,无水乙醇和DEPC水；所述逆转录试剂包括 5 X RT-Buffer, IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR试剂包括qPCR Mix，50 X R0X，扩增引物及探针和灭菌水。更进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤
(1)用RNA提取试剂提取血清待检样本RNA；
(2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA;
(3)使用4对引物及相应探针(SEQ1-SEQ12)对步骤⑵得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；PCR检测体系为25ul，其中包括12. 5ul qPCR Mix, 10 uM探针0. 4ul，IOuM正、反向引物各0. 8ul，正向引物为SEQ1、SEQ4、SEQ7、SEQ10，反向引物为SEQ2、SEQ5、SEQ8、SEQlI, 50XROX 0. 5ul, cDNA 2ul, ddH20 8ul ;实时荧光定量 PCR 反应程序95°C IOmin 预变性；95°C 15sec,58°C 35sec，39 个循环。进一步地，步骤(I)的具体抽取步骤如下
①向200ul血清标本加入ImlTrizol,混勻，室温静止5min ；
②向步骤①混合液中加入200ul氯仿,混勻，室温静止5min,4°C下12000g离心15min；
③吸取上清液移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静止10min，4°C下12000g 离心 IOmin ；
④弃上清，加入75%乙醇lml,4°C下12000g离心5min；
⑥弃上清，室温干燥5min后加入30ul DEPC水，_80°C保存备用。
步骤(2)的逆转录具体步骤如下向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,将混合液至于65°C，5min后，冰浴2min ；向上述混合液加入4ul 5 X RT-Buffer, 4ul DEPC水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶，混匀，37°C 60min,95°C 5min，获得 cDNA -20°C备用。步骤(3)实时荧光定量PCR检测方法中，一例样本进行4个PCR反应，即检测是否为1、2、3、6基因型，4个实时荧光定量PCR体系均一致。根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对血清样本中的HCV亚型进行鉴定。具体方法为阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最高点，且阴性质控品无扩增曲线；样本的4个实时荧光定量PCR反应体系中，如某个反应体系产生扩增曲线，且Ct值<38，则样本为该型的病毒，无明显扩增曲线的表示样本不是该4类型别的病毒。有益效果本发明的用于检测丙肝病毒(HCV)基因型的试剂盒，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可检测出我国常见的的1、2、3、6型HCV病毒。用该试剂盒 所得的结果具有高准确性，比Sanger测序法更加快速、简便、灵敏、特异，且降低了污染风险和成本。
图I是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本只有I型反应体系产生扩增曲线，因此样本A为I型HCV病毒。图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有2型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为2型HCV病毒。图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有3型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为3型HCV病毒。图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有6型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为6型HCV病毒。图5 8是样本A、B、C、D的测序图谱。目的是为验证图广4的结果，对上述A、B、C、D样本进行Sanger测序,并将测序结果输入NCBI的Genotpying模块(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/projects/genotyping/formpage. cgi),最终发现测序分型结果与实时突光定量PCR检测结果一致。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I
用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒，包括
(i)RNA提取试剂Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC水；
(ii)逆转录试剂5XRT-Buffer,IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶，DEPC水；(iii)实时荧光定量PCR试剂qPCR 1^1，50父1 ( ，用于扩增样本00嫩的4对引物及相应的探针(SEQ1-SEQ12) IOuM,灭菌水，其中
检测I型HCV病毒的引物及探针
SEQl TTCACGGAGGCTATGACYAGG ；
SEQ2 GGGTCACGGGTGAGATAGTASAC ；
SEQ3 FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ；
检测2型HCV病毒的引物及探针
SEQ4 CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ；
SEQ5 ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ；
SEQ6 FAM- ACAGGCGTTGCCGCGCCA-TAMRA ；
检测3型HCV病毒的引物及探针
SEQ7 TCACTCTGCCCGRTCGAART ；
SEQ8 ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ；
SEQ9 FAM- AGGACGTTCGCTCCTTGTCCAGCA-TAMRA ；
检测6型HCV病毒的引物及探针
SEQlO CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ；
SEQll GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ；
SEQI2 :FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。所述试剂盒的使用方法包括以下步骤
(1)用RNA提取试剂提取血清待检样本RNA；
(2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA;
(3)使用4对引物及相应探针(SEQ1-SEQ12)对步骤⑵得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；PCR检测体系为25ul，其中包括12. 5ul qPCR Mix, 10 uM探针0. 4ul，IOuM正、反向引物各0. 8ul，正向引物为SEQ1、SEQ4、SEQ7、SEQ10，反向引物为SEQ2、SEQ5、SEQ8、SEQlI, 50XROX 0. 5ul, cDNA 2ul, ddH20 8ul ;实时荧光定量 PCR 反应程序95°C IOmin 预变性；95°C 15sec,58°C 35sec，39 个循环。根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对血清样本中的HCV亚型进行鉴定。具体方法为阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最高点，且阴性质控品无扩增曲线；样本的4个实时荧光定量PCR反应体系中，如某个反应体系产生扩增曲线，且Ct值<38，则样本为该型的病毒，无明显扩增曲线的表示样本不是该4类型别的病毒。本发明基于NS5B区域设计4对引物及相应的探针用于扩增样本cDNA。通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物及探针(SEQ1-SEQ12)进行实时荧光定量PCR，发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本试剂盒具有极高的检测准确性。实施例2 :检测方法 I.丙肝HCV RNA的抽取
I. I向200ul血清标本加入Iml Trizol,混勻，室温静止5min ；
I. 2向步骤I. I混合液中加入200ul氯仿，混匀，室温静止5min，4°C下12000g离心15min ；I. 3吸取上清液移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静止10min，4°C下12000g 离心 IOmin ；
I. 4弃上清,加入75%乙醇lml,4°C下12000g离心5min ；
I.5弃上清，室温干燥5min后加入30ul DEPC水，_80°C保存备用。2.将步骤I中的所得RNA用随机引物逆转录为cDNA，再使用4对引物及探针(SEQ1-SEQ12)对得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。其中逆转录的具体方法向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,将混合液至于 65°C，5min 后，冰浴 2min。向上述混合液加入 4ul 5*RT_Buffer，4ul DEPC 水，Iul IOOU/ ul ReverTra Ace 逆转录酶，混匀，37°C 60min,95°C 5min，获得 cDNA -20°C备用。其中实时荧光定量PCR检测的具体方法一例样本需进行4个反应，即检测是否为1、2、3、6基因型。4个实时荧光定量PCR体系均一致，具体如下总体系为25ul，12. 5ulqPCR Mix，0.4ul IOuM 探针(SEQ3、SEQ6、SEQ9)，IOuM 正反向引物各 0. 8ul (正向引物:SEQU SEQ4、SEQ7、SEQlO ;反向引物SEQ2、SEQ5、SEQ8、SEQ11)，0. 5ul 50*R0X，cDNA 2ul,ddH20 8ul。实时荧光定量PCR反应程序95°C IOmin预变性；95°C 15sec，58°C 35sec，39个循环。3.结果分析，具体方法为阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最高点，且阴性质控品无扩增曲线；样本的4个实时荧光定量PCR反应体系中，如某个反应体系产生扩增曲线，且Ct值< 38，则样本为该型的病毒，无明显扩增曲线的表示样本不是该4类型别的病毒。图I是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本只有I型反应体系产生扩增曲线，因此样本A为I型HCV病毒。图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有2型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为2型HCV病毒。图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有3型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为3型HCV病毒。图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有6型反应体系产生扩增曲线，因此样本B为6型HCV病毒。图5 8是样本A、B、C、D的测序图谱。目的是为验证图广4的结果，对上述A、B、
C、D样本进行Sanger测序,并将测序结果输入NCBI的Genotpying模块(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/projects/genotyping/formpage. cgi),最终发现测序分型结果与实时突光定量PCR检测结果一致。
权利要求
1.用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 (1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂； (2)用于扩增样本cDNA的4对引物及相应的探针其中， 检测I型HCV病毒的引物及探针SEQl TTCACGGAGGCTATGACYAGG ；SEQ2 GGGTCACGGGTGAGATAGTASAC ；SEQ3 FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ； 检测2型HCV病毒的引物及探针 SEQ4 CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ；SEQ5 ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ；SEQ6 FAM- ACAGGCGTTGCCGCGCCA-TAMRA ； 检测3型HCV病毒的引物及探针SEQ7 TCACTCTGCCCGRTCGAART ；SEQ8 ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ；SEQ9 FAM- AGGACGTTCGCTCCTTGTCCAGCA-TAMRA ； 检测6型HCV病毒的引物及探针SEQlO CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ；SEQll GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ；SEQI2 :FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂包括Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇和DEPC水；所述逆转录试剂包括5XRT-Buffer，IOOuM Primer Mix, 100U/ulReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR试剂包括qPCR Mix，50XR0X，扩增弓I物及探针和灭菌水。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤 (1)用RNA提取试剂提取血清待检样本RNA； (2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA； (3)使用4对引物及相应探针(SEQ1-SEQ12)对步骤⑵得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；PCR检测体系为25ul，其中包括12. 5ul qPCR Mix, 10 uM探针0. 4ul，IOuM正、反向引物各0. 8ul，正向引物为SEQ1、SEQ4、SEQ7、SEQ10，反向引物为SEQ2、SEQ5、SEQ8、SEQlI, 50XROX 0. 5ul, cDNA 2ul, ddH20 8ul ;实时荧光定量 PCR 反应程序95°C IOmin 预变性；95°C 15sec,58°C 35sec，39 个循环。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(I)的具体抽取步骤如下 ①向200ul血清标本加入ImlTrizol,混勻，室温静止5min ； ②向步骤①混合液中加入200ul氯仿,混勻，室温静止5min,4°C下12000g离心15min； ③吸取上清液移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静止10min，4°C下.12000g 离心 IOmin ； ④弃上清，加入75%乙醇lml,4°C下12000g离心5min； ⑥弃上清，室温干燥5min后加入30ul DEPC水，_80°C保存备用。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的逆转录具体步骤如下向IOulRNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,将混合液至于65°C, 5min后，冰浴2min ;向上述混合液加入 4ul 5 X RT-Buffer, 4uI DEPC 水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶，混匀，37°C60min，95°C 5min，获得 cDNA -20°C备用。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(3)实时荧光定量PCR检测方法中，一例样本进行4个PCR反应，即检测是否为1、2、3、6基因型，4个实时荧光定量PCR体系均一致。
全文摘要
本发明公开了用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒，其特征在于它包括(1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；(2)用于扩增样本cDNA的4对引物及相应的探针。本发明的用于检测丙肝病毒(HCV)基因型的试剂盒，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可检测出我国常见的1、2、3、6型HCV病毒。用该试剂盒所得的结果具有高准确性，比Sanger测序法更加快速、简便、灵敏、特异，且降低了污染风险和成本。
文档编号C12Q1/70GK102719558SQ20121017970
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者徐建成, 方国伟, 王淑一, 陈亦磊 申请人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司