专利名称：一种香石竹四种病毒的同步检测方法
技术领域：
本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种香石竹四种病毒的同步检测方法。
背景技术：
在香石竹病毒的RT-PCR检测技术中，孔宝华等人(孔宝华，蔡红等.香石竹斑驳 病毒的鉴定和PT-PCR检测[J].植物保护，2002，2，观(1) :5_8)根据香石竹斑驳病毒CarMV 的RNA序列设计引物，可从RNA稀释IO4的RNA粗提液中检出香石竹斑驳的病毒。赵珊等人 (赵珊，王继华，王丽花，杨秀梅.香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测[J].西南农业学报， 2010,1 =103-106)通过设计引物能从香石竹坏死斑点病毒CNFV感病香石竹组织中检测出 CNFV病毒，灵敏性测定结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释IO6植物总RNA中检测出病经过多年不断的完善，目前PCR技术已经发展成为一种通用技术，多重RT-PCR可 以在一个反应中同时提供常规法数次反应的扩增信息，这种高效快速的优势使其在植物病 毒检测与无病毒苗快速繁育推广中具有重要意义，但利用该技术同时检测多种香石竹病毒 中尚未见报道。香石竹病毒病是香石竹上的一类重要病害，引起香石竹病毒病的病毒种类很多， 国内外已报道有10余种，但一般认为，香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus，CarMV)、 潜隐病毒(Carnation latentvirus, CLV)、环斑病毒(Carnation ring spot virus, CRSV) 和坏死斑点病毒(Carnation necrotic fleck virus，CNFV)是世界上对香石竹生产危害最 大的4种病毒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供用于香石竹四种病毒的同步检测的引 物、检测方法及其检测试剂盒。本发明的一个目的在于提供用于香石竹四种病毒同步检测引物，包括CarMV 上游引物ACGCTCACCTCGCCAATTTGCTTCarMV 下游引物TCCGCAGTCCGCACATTCCTACT ；CRSV 上游引物AATCCAAAATGGCGCTGGTGCCTCRSV 下游引物CATCAGTGAAACGCGACCGCTCA ； CLV 上游引物TGTTGGGCTGTCGCACGTTACTGCLV 下游引物GGTGGGGATTTGGCGAACAGCAT ；CNFV 上游引物TGGAGTGCGTCACCTTGAGTGGTCNFV 下游引物GTCGAAAGTGCCGCCTCCGAAAT。本发明的另一个目的在于提供香石竹四种病毒同步检测方法，包括如下步骤1)提取香石竹的总RNA ；2) RT-MPCR 将步骤1)中得到的RNA反转录后，用权利要求1所述的引物扩增反转录产物，并进行电泳检测。本发明还提供香石竹总RNA的提取方法，步骤如下1)称取0. 05 0. Ig香石竹幼叶或花瓣至研钵中，在液氮下研成极细粉末，将粉末 迅速转移至预冷的1. 5mL离心管中，加0. 8 1. 2mLTrizol后用漩涡混合器充分混勻，于室 温下静置5min，使其充分裂解；2) 13000rpm，4°C离心10 15min，吸上清，加等体积的体积比为24 1的氯仿 异戊醇，漩涡混合器充分混勻，静置2 ;3min ；3) 12000rpm，4°C离心10 15min，吸上清至新的离心管，加0. 7倍体积的异丙醇， 漩涡混合器充分混勻，_70°C静置10 30min ；4) 12000rpm，4°C离心10 15min，弃上清，加300 500 μ L 75%乙醇进行洗涤， 温和振荡离心管，悬浮沉淀，7500rpm，4°C离心5 lOmin，弃上清；5) 300 500 μ L 75 %乙醇重复洗涤一次，室温晾干或真空干燥5 lOmin，用 50 100 μ L无RNase的双蒸水溶解RNA样品，于_70°C保存备用。根据本发明，扩增香石竹反转录产物的PCR反应体系为
权利要求
1.香石竹四种病毒同步检测引物，包括 CarMV 上游引物ACGCTCACCTCGCCAATTTGCTT CarMV 下游引物TCCGCAGTCCGCACATTCCTACT ； CRSV 上游引物AATCCAAAATGGCGCTGGTGCCT CRSV 下游引物CATCAGTGAAACGCGACCGCTCA ； CLV 上游引物TGTTGGGCTGTCGCACGTTACTG CLV 下游引物GGTGGGGATTTGGCGAACAGCAT ； CNFV 上游引物TGGAGTGCGTCACCTTGAGTGGT CNFV 下游引物GTCGAAAGTGCCGCCTCCGAAAT。
2.香石竹四种病毒同步检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取香石竹的总RNA；2)RT-MPCR 将步骤1)中得到的RNA反转录后，用权利要求1所述的引物扩增反转录产 物，并进行电泳检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的提取香石竹的总RNA按如下步 骤进行1)称取0.05 0. Ig香石竹幼叶或花瓣至研钵中，在液氮下研成极细粉末，将粉末迅速 转移至预冷的1. 5mL离心管中，加0. 8 1. 2mLTrizol后用漩涡混合器充分混勻，于室温下 静置5min，使其充分裂解；2)13000rpm，4°C离心10 15min，吸上清，加等体积的体积比为M 1的氯仿异戊 醇，漩涡混合器充分混勻，静置2 ;3min ；3)12000rpm，4°C离心10 15min，吸上清至新的离心管，加0. 7倍体积的异丙醇，漩涡 混合器充分混勻，_70°C静置10 30min ；4)12000rpm，4°C离心10 15min，弃上清，加300 50% L 75%乙醇进行洗涤，温和振 荡离心管，悬浮沉淀，7500rpm，4°C离心5 lOmin，弃上清；5)300 500 μ L 75%乙醇重复洗涤一次，室温晾干或真空干燥5 lOmin，用50 100 μ L无RNase的双蒸水溶解RNA样品，于_70°C保存备用。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增反转录产物的PCR反应体系为反应组分反应的量·cDNA1. 5μ g 无 Mg2+ 的 10 X Taq PCR 缓冲液 5 μ L·25mM 的 Mg2+3 μ L·2. 5mM 的 dNTPs4 μ LTaq DNA 聚合酶1. 25U IOpmol/ μ L 的引物 CarMVl/CarMV2 各 0· 5 μ L IOpmol/ μ L 的弓丨物 CNFV1/CNFV2 各 0. 5 μ L lOpmol/μ L 的引物 CRSV1/CRSV2 各 0. 5 μ L lOpmol/μ L 的弓丨物 CLV1/CLV2 各 0. 5 μ L无菌双蒸水补足至50 μ L所述的PCR反应程序为95°C预变性:3min ；然后94°C变性30s，53°C 60°C退火30s， 72°C延伸30s，32个循环；72°C延伸5min，最后于4°C结束。
5.含有权利要求1所述引物的香石竹四种病毒同步检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包含反转录酶及其反应缓冲液、Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液、dNTPs、OligodT, RNase抑制剂和无RNase的双蒸水。
7.权利要求1所述的引物或权利要求5所述的试剂盒在香石竹四种病毒同步检测中的 应用。
全文摘要
本发明涉及一种香石竹四种病毒同步检测方法，具体涉及香石竹斑驳病毒、潜隐病毒、环斑病毒和坏死斑点病毒的同步检测方法。本发明具体公开了上述四种病毒同步检测的引物，其序列如SEQ ID No.1～8所示。本发明还公开了上述四种病毒的同步检测方法，包括1)提取香石竹的总RNA；2)RT-MPCR将步骤1)中得到的RNA反转录后，将上述四对引物在一个反应中对反转录产物进行同步扩增，同步检测上述的四种病毒。本发明提供的引物兼容性好，条带清晰易区分；本发明提供的方法降低了检测成本，提高了检测速度，实现了香石竹病毒检测的同步性、高效性和灵敏性。
文档编号C12N15/11GK102140541SQ201110038668
公开日2011年8月3日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者吕英民, 张启翔, 王舒藜, 程堂仁 申请人:北京林业大学