专利名称：检测丙肝病毒的方法和试剂的制作方法
本申请为中国专利申请号为92111071,5、申请日为1992年8月26日发明名称为《检测丙肝病毒的方法和试剂》的中国专利申请的分案申请。
本发明提供了用于检测丙肝病毒，即一种非甲、非乙肝炎的病原体的试剂和方法。该试剂特别包括用于病毒RNA基因组反转录以及随后的通过由此产生的cDNA的聚合酶链反应进行放大的低核苷酸引子。特定序列的低核苷酸探针被提供用来检测放大后的HCV核酸序列。引子和探针可用于检测HCV感染的诊断试验中。这种诊断试验在临床和流行病学的环境中有重要的应用。
丙肝病毒(HCV)是未知的几种引起非甲，非乙肝炎(NANBH)的因子之一。原型的HCV发现于从黑猩猩血浆中获得的以血液为载体的NANBH病毒的cDNA克隆，如在1989年的Science杂志第244期的第359-362页上Choo等人的报道。来自这种原型HCV基因的核苷酸序列在欧洲专利公开第381,216；388,232和398,748中作了描述。HCV基因组的核苷酸序列在1991年美国国家科学院学报(Pro.Natl.Acad.Sci.)上第88期第2451至2455页上由Choo.等人作了报道并与相关病毒作了比较。
在此后对其它族系的序列已有过报道。HCV基因组在分离体之间显示出很强的核酸序列异种性，从HCVRNA基因组中分离cDNA在1989年的Nuc.Acid Res.第17期第10367-10372页上由Kuboet等人报道。作者们创立了一种基于上述1989年Choo等人报道的序列的反转录引子。分离的HCV基因组片段表现出与原型HCV序列有79.8％的同种性。由类似的原始记录得到的，来自三个不同区域的序列在1990年的Gene 91期第287-291页上由Takeuchi等人作了报道。据报道，在这三个区域之一，与原型序列的序列同种性为73.5％。
来自从日本患者中分离出来的族系的HCV基因序列在1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A第87期9524-9528页上由Kato等人作了报道。该序列在整个比较区域上显示出与原型HCV基因组77.4％的同种性。在1991年的J.Virol.65期(3)第1105-1113页上由Takamizawa等人报道的HCV基因组的全编码区域的序列表现出与原型HCV菌系77％的同种性。
在日本，两个标记为K1和K2的主要族系已经在基因组的400核苷酸区域上被观察到。这些族系具有与原型HCV序列的67％的序列同种性(见1990年Biochem.Biophys.Res.Commun.170(3)期第1021-1025页上Enomoto等人的报道)。K2族还可被进一步细分为两组，标记为Ka和Kb，在两组之间具有约20％的核苷酸变异和在每一组内具有约5％的核苷酸变异。
与原型HCV序列的近似的同种性水平在1990年的J.Clin.Invest.86期第1764-1767页上Kato等人的文章中作了报道，在15位患者中，cDNA片段被放大并排序。被放大的部分，对应于原型序列中位置3525-3561的37个核苷酸表现出与原型HCV序列的68-78％的同种性。
HCV基因组的RNA可以在血清中被检测到，通过从基因RNA中产生cDNA，用聚合酶链反应放大cDNA，并且随后用特定序列的低核苷酸检测。由于在HCV族系中的序列异种性，引子和探针很可能是族系特异的，除非能够找到一个区域，在该区域内序列通过不同族系是不变的。一种这样的不变区域是在HCV基因组的5′一端。
HCV基因组的5′-端非编码序列首先在1990年的JapanJ.Exp.Med.60(3)期的第167-177页上由Okamoto等人作了报道。两个族系之间的对比表明5′-端非编码序列是不变的。HCV基因组5′-端非编码序列的这种不变特性还在1991年的Proc.Natl.Sci.U.S.A第88期1711-1715页Han等人的文章中作了报道。比较从来自五大洲的个体中收集的11个HCV分离体中获得的341核苷酸区域的部分序列，七个序列表现出与原型序列完全的同种性；剩下的四个序列表现出有1至5个碱基不符合。
在1990年的Japan J.Exp.Med.60(3)期第215-222页的Okamoto等人的文章中，描述了HCV基因组的各个不同区域，包括不变的5′非编码区域的引子。选自不变区域的引子成功地放大了来自受试的大部分族系的核酸；选自异种区域的引子放大了来自一个更小的族系亚组的核酸。然而这些引子的放大效率低。参考文献描述了一种两步PCR放大法；第二放大循环是采用嵌套在由第一组引子放大的区域中的第二组引子，在前面放大的目标区域上进行的。
一种需要两个放大循环，采用两组引子的PCR放大法在1990年Lancet 335期第1419-1422页的Garson等人的文章中也作了报道。一个对非结构蛋白质(NS5)进行编码的区域被放大。由于序列的异种性，存在不被这些引子所识别的HCV序列(见1990年Lancet 336期第878-879页Garson等人的文章)。因此，位于不变的5′非编码区域内的引子被试验，但为获得足够的灵敏性，采用多组嵌套引子的两步放大仍是必要的。利用嵌套引子，通过两步放大的5′-端区域放大在1990年Lancet 336期第245页上Kanai等人的文章中作了报道。
利用嵌套的引子通过两次放大循环的放大方法不仅效率低，而且极大地增加了污染的可能性。污染问题在本技术领域内是尽人皆知的；如果有一点可能性的话，在放大步骤中间最好避免打开反应试管更换引子和加入试剂，由于在初始的反转录步骤和随后的PCR放大中间需要改变反应条件，这就进一步加剧了污染问题。
仍然需要引子低核苷酸来放大HCV序列，每个引子选自一个不变区域，以使所有的，或几乎所有的族系能够被放大，而且放大作用足够有效以使得采用一组引子的放大就足够了。还需要探针低核苷酸来检测放大的cDNA，cDNA选自与引子杂合的两不变区域之间的一个不变区域。需要反应原始记录和试剂以便采用相同试剂即可发生反转录和PCR，从而在放大过程中不再需要打开反应试管。
而且，百分之十的NANBH病例与原型壳体和被膜抗原是不反应的，见1991年J.Clinical Microbiology 29期第2329-2330页中Chaudhary等人和1991年DNAS8期第3647-3651页中Hosein等人的文章。因此，研制基于PCR的诊断及由新的分离体编码的抗原将会改进血清诊断试验的可靠性。本发明通过提供检测HCV的引子、探针及方法来满足这些要求。
所提供的专门的引子和特定序列的低核苷酸探针可以用于同种的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以便能够放大和检测病毒RNA基因组的序列。利用本发明的引子和方法进行放大的效率消除了用嵌套的引子进行的第二个PCR放大循环的需要，而且，结果试验的高灵敏性提供了可靠的核酸检测。
本发明的一个方面涉及特定的低核苷酸引子。本发明提供了一个组合，其中包括用来放大一种HCV核酸的低核苷酸引子，其中所说的引子适于放大来自一种HCV族系或选自含有日本，美国和C9菌族组的同型体的核酸子序列。这些引子在病毒RNA基因组的反转录中和随后的利用聚合酶链反应对所产生的cDNA放大中起作用。引子与来自HCV基因组的不变区域的序列杂合，从而与各种族系键联。利用所提供的引子进行放大的效率足以不再需要采用嵌套引子的第二个PCR放大循环。
本发明的另一个方面涉及能够检测HCV基因组核酸的存在，而与族系无关的探针。该探针与对不同族系不变的区域是互补的。利用本发明的探针进行的诊断试验能够检测大量的HCV族系而不会损害其特异性。所以本发明提供的组合包括一种用于检测丙肝病毒核酸存在的低核苷酸探针，其中探针适于检测HCV族系的核酸或者选自含有日本、美国和C9原型族系的各种不同族系的核酸。
本发明的第三个方面涉及试剂盒。这些试剂盒呈各种形式并包含一种或多种反转录，放大或检测试剂，例如引子、探针、聚合酶、糖酶、绶冲剂以及核苷三磷酸盐。
在一个实施例中，本发明提供了一套专门用于肝炎病毒的C9分离体的核酸检测的试剂，该套试剂包括一个箱子，其中含有本质上与HCV-C9病毒的核酸子序列键联的核酸探针。
本发明的另一方面涉及放大和检测HCV RNA的方法。
此外，本发明涉及一种组合，包括本质上与SEQ ID.NO.29同种的病毒核酸序列。含有这样一种病毒序列、这里被称为C9分离体的cDNA克隆，pHCV-C9，pHCV-C9被存放在American Type Culture Collection中，而且存放号为NO.75265。
本发明还提供了用于专门检测C9分离体及相关的变异体的核酸序列的探针和引子。本发明的探针最好包括选自下列小组的子序列SEQ ID NO.345′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt 174-197)SEQ ID NO.355′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt 374-397)SEQ ID NO.365′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt 527-550)SEQ ID NO.37(MY160)5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′(nt 216-233)本发明还提供了专门放大C9分离体的核酸序列的低核苷酸引子。专门用于放大C9变异体及相关的分离体的本发明的引子最好包括选自下列一组上端引子的核酸序列SEQ ID NO.385′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′(nt 204-224)；SEQ ID NO.395′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′(nt 163-183)；及SEQ ID NO.405′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′(nt 360-380)；并与下列下端引子一起使用SEQ ID NO.415′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′(nt 509-529)；及SEQ ID NO.425′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′(nt 555-575).
本发明还提供了本质上与C9分离体及前面被视为丙肝分离体的序列键联的探针。这种类型的优选探针包括SEQ ID NO.43 KY150 5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.本发明还提供了用于检测非-C9HCV序列的探针。
本发明提供了用于检测丙肝基因组的核酸存在的方法，其中所说的丙肝基因组的核酸选自由日本、美国及C9原型族系组成的小组，该方法包括(a)放大核酸子序列；(b)在探针与子序列键联形成一个稳定的杂合复合体的条件下将放大的核酸与专门用于该子序列的低核苷酸探针混合；及(c)检测形成于子序列和探针之间的杂合体。
在另一个实施例中，本发明提供了一个用于检测肝炎病毒的C9分离体的方法，该方法包括以下步骤(a)让怀疑含有HCV-C9核酸序列的样品与具有一个和HCV-C9核酸序列互补的子序列的探针接触；及(b)检测探针与该序列的杂合。
该方法可以在步骤(a)之前进一步包括一个对病毒特定序列的子序列的放大步骤。放大最好通过采用聚合酶链反应法获得。上述引子和探针最好用在本发明的方法中。
本发明还提供了检测肝炎病毒的C9分离体特有的核酸的试剂盒。该试剂盒包括一个箱子，其中含有一个核酸探针，该探针本质上与核酸序列的一个核酸子序列键联。该探针最好选自上列小组。
另一种测定方法是基于免疫学反应的，如血清抗体与蛋白或C9分离体的病毒溶样产物的反应，或培养用来抗病毒抗体的免疫球蛋白与含病毒的生物样品的反应。因此，本发明提供了培养用来抗C9分离体的生物纯的免疫球蛋白。
为了理解本发明，下面定义几个术语。
“放大反应混合液”是指含有用于放大目标核酸的各种试剂的含水溶液。这些试剂包括酶，含水缓冲剂，盐，目标核酸，及脱氧核苷三磷酸盐。按照上下文，混合液既可以是完全的也可以是非完全的放大反应混合液。
“放大反应系统”是指任何放大目标核酸序列复制品的体外方法。这些方法包括，但不局限于此，聚合酶链反应放大(PCR)，DNA连接酶，QB RNA复制酶，及基于RNA转录的放大系统。这些包括多种放大试剂并在下面更充分地描述。
“放大反应试管”是指适于盛放放大试剂的容器。通常试管由惰性成分构成以使其不抑制或干扰所采用的放大系统。由于系统需要反复加热和冷却的热循环，故试管必须能够耐受这个循环过程，且一般与热循环控制装置的套管准确地配合。
“放大试剂”是指各种缓冲剂，酶，引子，脱氧核苷三磷酸盐(既有传统的也有非传统的)，和用于进行所选择的放大步骤的引子。
“放大”或“放大过程”一般是指目标核酸的“指数”增长，在此被用来描述在选择的目标核酸序列数量上线性的和指数的增长。
“实质上的键联”是指一种低核苷酸和一个目标序列的互补杂合并且含有少量的不杂合部分，这些少量的不杂合能够通过降低对杂合剂的严格性要求以获得所希望的对PCR聚合酶或杂合信息检测的引发作用而被接受。
“生物纯”一词是指实质上或本质上从在其自然状态被发现时通常伴随它的成分中游离出来的物质，例如，亲合力纯化的抗体或以一种生物纯化状态存在的单克隆抗体。
“杂合”是指两个单股核酸通过互补碱基配对键联。
“核酸”是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限定，包括能够以一种与天然产生的核苷酸类似的方式起作用的已知的天然核苷酸的类似物。
“核苷酸聚合酶”是指能够催化由核苷三磷酸盐前体合成DNA或RNA的酶。在本发明的放大反应中，聚合酶是依赖于模板的，并且一般在所形成的聚合物3′一端加入核苷酸。最优选的聚合酶是热稳定的，如美国专利4,889,818和5,079,352中所述。
术语“低核苷酸”是指一个分子，它包括两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，如引子，探针，待检测的核酸片段，及核酸控制子。低核苷酸的准确大小依赖于多种因素及低核苷酸最终的作用或应用。低核苷酸可采用任何合适的方法制备，包括，例如克隆繁殖和对适当序列的限定及采用一种方法直接进行化学合成，如在1979年的Meth.Enzymol.68期第90-99页上Narang等人的文章中所述的磷酸三酯化方法；1979年Meth.Enzymol 68期第109-151页上Brown等人的磷酸二酯化方法；1981年TetrahedronLett.22期第1859-1862页上Beaucage等人的二乙磷酰胺化方法；以及美国专利4,458,066中的固体支持物方法。
术语“引子”是指一种天然或合成的低核苷酸，在导致与一个核酸链互补的引子扩展产物的合成条件下，即存在四种不同的核苷三磷酸盐和一种处于适当的缓冲剂中的聚合剂(即DNA聚合酶或反转录酶)的条件下以及在适当的温度下，引子能够起到DNA合成的引发点的作用。引子最好是单股低脱氧核糖核苷酸。合适的引子长度依赖于引子的使用用途，但一般在15至25个核苷酸范围内。短的引子分子通常需要较低的温度以便用模板形成充分稳定的杂合的复合物。引子不需要反映准确的模板序列，但必须充分地互补以便与模板杂合。
在本发明的一个公开的实施例中，提供了特定序列的引子和探针。对本领域的普通技术人员来说显而易见的是，有了那些实施例，可以制备其它的特定序列的引子和探针，例如通过在5′或3′端加入核苷酸，其中核苷酸与目标序列互补或非互补。只要引子制品对于在目标序列上的扩展能够起到的作用，并且只要引子和探针包括至少14个包含在所列举的实施例中的连续的核苷酸，则这样的制品就在本发明的范畴内。
术语“引子”可指多于一个引子，特别是在关于被放大的目标区域的一端或两端方面的信息存在模糊的情况下。例如，如果一个区域表现出在总体中具有较高水平的多态性，则引子混合物可被制备来放大不同的序列。如果希望的话，引子可通过包括一个能够用分光、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的标记物而被标记。例如，可使用的标记物包括32P荧光染料，电子密度试剂，酶(如在ELISA中普遍采用的)，生物素，或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。标记物还可以被用于“捕获”引子，以便于将引子或引子扩展产物，如放大的DNA固定在固体支持物上。
“探针”是指通过与目标核酸子序列互补碱基配对进行键联的一种低核苷酸。对于本领域普通技术人员来说可以理解的是，探针一般可根据杂合状态的严格性和与探针序列缺乏完全的互补性的目标序列实质上地键联合。探针最好用同位素直接标记或如采用链霉抗生物素蛋白过后可与之键联的生物素间接标记。通过测定探针的存在与否，人们可以检测到目标存在与否。
“重组体”当指一个核酸探针时，意思是从通常与由细胞分离出来的探针相关的天然蛋白质和核酸中游离出来的低核苷酸，其中自然包含作为其天然基因组的一部分的探针序列。重组体探针包括通过放大方式制成的那些物质，这个放大方式如PCR法和基因的克隆繁殖方法，在后一种方法中，细菌被重组体探针所改变。
术语“反转录酶”是指一种酶，它催化脱氧核糖核苷三磷酸盐的聚合作用以形成与核糖核酸模板互补的引子扩展产物。这种酶诱发在引子3′端进行的合成反应，并继续向模板的5′端进行直到合成终止。将RNA目标序列转化为一个互补的，复制-DNA(cDNA)序列的合适的聚合剂的例子是鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶和Thermus嗜热菌DNA聚合酶，一种具有反转录酶活性的热稳定的DNA聚合酶。
术语“特定序列的低核苷酸”和“SSO”是指具有一个称为“杂合区域”的序列的低核苷酸，该序列与待检测序列精确地互补，一般具有特殊的等位基因或变异体的序列在“特定序列的，严格的杂合状态”下，只与那个严格互补的目标序列杂合。放松杂合状态的严格性，将允许有序列的不符合；允许的不符合度可通过适当调整杂合状态来控制。根据待分析的序列的不同，可以选用一种或多种特定序列的低核苷酸。术语“探针”及“SSO探针”可相互替换地与SSO一起使用。
一个特殊分离体“特有的序列”是该分离体特有的序列，即前面说明的其它分离体没有的。一个含有与一种分离体特效的序列互补的子序列的探针在严格条件下(例如在70℃用2×SSC，0.1％的SDS冲洗固体支持物)通常不与其它分离体基因组的相应部分杂合。
特殊分离体特有的抗原或抗原决定簇是该分离体特有的，且是前面说明的其它分离体所不具备的。培养用来抗该抗原或抗原决定簇的免疫球蛋白在标准测定，如ELISA中，不与前面描述的分离体上的抗原进行交叉反应。
术语“本质上等同”表示两个或多个核苷酸序列，其大部分序列是共同的。通常至少为其序列的约90％，优选地为其序列的约95％。另外还表示，如果在严格的条件下(参见例如Sambrook等人的，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1985年)，与相同的核苷酸序列杂合的话，该序列是本质上等同的。严格的条件是依赖于序列的，在不同的情况下是不同的。通常，严格的条件被选为低于特定序列的热焙点(Tm)5℃，并在规定的离子浓度和pH值下。Tm是指(在规定的离子深度和pH值下)，50％的目标序列与完全符合的探针杂合时的温度。一般地，严格的条件是指在pH值为7时盐浓缩度至少约为0.2摩尔且温度至少约为60℃情况下的那些条件。
“子序列”是指包括一个更长的核酸序列的一部分的核酸序列。
术语“目标区域”是指待分析的核酸区域并可以包括多态区域。
术语“热稳定聚合酶”是指一种对热相对稳定，并能够催化核苷三磷酸盐的聚合作用以形成与目标序列的一个核酸链互补的引子扩展产物的酶。该酶引发在引子3′端的合成反应，并继续向模板的5′端进行直到合成终止。一种纯化了的热稳定聚合酶在美国专利4,889,818中作了更充分的描述。
图1提供了新颖的变异的HCV序列C9，四种相关的变型体及原型日本、美国HCV分离体的排列表。
丙肝病毒是一种很小的RNA病毒，它包含一个长度为10,000个核苷酸的单个的正向的RNA分子。基因组含有一个据信可被转化成单个的，大聚合蛋白并随后进行处理的单个的长的开放阅读架。这个开放阅读架始于一个非转化区域(UTR)之后的核苷酸343(采用原型病毒编号系统)。5′UTR序列是相对不变的，并且在病毒的复制和调节方面是很重要的。编码区域的5′端也是不变的。本发明的某些引子和探针在HCV基因组的5′端与不变区域杂合。
下面将给出本发明的引子和探针的杂合区域的低核苷酸序列，本领域的普通技术人员将会明白，用于引子杂合区域的低核苷酸序列也可以用作探针的杂合区域。引子序列用于探针的适用性依赖于引子的杂合特性。同样，用于探针的低核苷酸可用于引子。
表1所示的低核苷酸是正向的(上端)引子或探针。表是按照与基因组核酸杂合的低核苷酸的3′端的位置顺序列出的。与最靠近基因组5′端杂合的低核苷酸被列在前面。
表1低核苷酸 序列表 序列 位置(末端数)KY65 SEQ ID NO1 5’-CCAAGCTTCACCATAGATCACT16-29KY79 SEQ ID NO2 5’-GGCGACACTCCACCATAGATCACT 6-29KY98 SEQ ID NO3 5’-CCAAGCTTAGATCACTCCCCTGTGAGGAACT 21-44KY96 SEQ ID NO4 5’-CCAAGCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT50-74KY80 SEQ ID NO5 5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT 56-79KY144 SEQ ID NO6 5’-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT54-79KY83 SEQ ID NO7 5’-CCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCA99-128KY84 SEQ ID NO8 5’-GAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACC 149-175KY85 SEQ ID NO9 5’-ACCCGCTCAATGCCTGGAGAT 194-214KY67 SEQ ID NO10 5’-CGAAGCTTGCTAGCCGAGTAGT236-250KY81 SEQ ID NO11 5’-CCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT 227-250KY88 SEQ ID NO12 5’-GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGT 251-275KY86 SEQ ID NO13 5’-GGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGT288-317KY87 SEQ ID NO14 5’-GACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCG 482-505表2列出了作为反向(下端)引子或探针的低核苷酸，采用与表1相同的内部排序。
表2低核苷酸 序列表序列位置(末端数)KY153 SEQ ID NO155’-CCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCT 232-256KY149 SEQ ID NO165’-AAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACT 245-278KY148 SEQ ID NO175’-CACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACT 248-273KY78 SEQ ID NO185’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT276-299KY145 SEQ ID NO195’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-301KY95 SEQ ID NO205′-GGGAATTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-298KY100 SEQ ID NO215’-CGAGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-505KY110 SEQ ID NO225’-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY112 SEQ ID NO235’-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY109 SEQ ID NO245’-AATGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-593KY111 SEQ ID NO255’-ATTGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-594KY99 SEQ ID NO265’-CAGAATTCATTGCCATAGAGGGGCCAAGGAT 570-592KY68 SEQ ID NO275’-CAGAATTCGCCCTCATTGCCAT 586-599KY82 SEQ ID NO285’-CCCACCCCAAGCCCTCATTGCCAT586-610
有几个低核苷酸具有被修改成包括一个向着分子的5′端的限定部位的杂合区域。当这些低核苷酸之一被用作引子时，该限定部位被引入到放大后的产物中。初始杂合条件被选择以使得限定部位周围的碱基对不符合率能被接受。一个引子的5′端附近的不符合率比引子3′端附近的不符合率被更好地接受。低核苷酸KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 98(SEQ ID NO.3)，KY 96(SEQ ID NO.4)，以及KY 67(SEQ ID NO.10)是上端的引子并含有一个Hind III部位，低核苷酸KY 95(SEQ ID NO.20)，KY 99(SEQ ID NO.26)及KY 68(SEQ ID NO.27)是下端的引子并含有一个EcoRI部位。将这种限定部位包括到放大的产物中便于放大产物的克隆繁殖。
本发明还提供了一种新的HCV分离体。大多数分离体与HCV的两个族系之一有关。第一个是在欧州专利318,216,388,232，和398,748中描述的美国原型族系。第二个是由上述Kato等人描述的日本原型族系。两个族系在假定的非结构基因区域上存在最高至30％差别，但在5′非转化区域上表现出大于98％的同种性，和在壳体或核基因的5′部分92％的同种性。
本发明的分离体，在此被称为C9，与两个族系的相关度更低。这种新的分离体与同样的5′非转化区域具有93％的相似性。与原型或日本族系在核基因区域的5′部分仅存在约85％的同种性(见下面表3)C9(SEQ ID NO.29)分离体及有关的同型体，R 45(SEQ IDNO.31)，R 43(SEQ ID NO.33)，R 110(SEQ ID NO.32)，及R 116(SEQ ID NO.30)(见图1)在从上述Stratagene购得的pBS(+)上被克隆繁殖成RI/HindIII限定部位。采用如在美国专利4,800,159中所述的纯化病毒DNA目标和PCR克隆繁殖方法对不同的病毒进行克隆繁殖。结果得到的质粒被送到E.ColiStrain DG101(ATCC存放号为47043)。
5′端非转化序列的核苷酸序列和原型C9分离体的5′端壳体基因以及四种相关的分离体被公开为C9(SEQ ID NO.29)，R 116(SEQ ID NO.30)，R 45(SEQ ID NO.31)，R 110(SEQ ID NO.32)，以及R 43(SEQ ID NO.33)并表示于下。所表示的序列不包括用来便于克隆繁殖病毒序列的引子KY 96(SEQ ID NO.4)和KY 99(SEQ ID NO.26)。C9-SEQ ID NO.291 ACTGTCTTCA CGCAGAAAGC GTCTAGCCAT GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT51 ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA GCCATAGTGG TCTGCGGAAC101 CGGTGAGTAC ACCGGAATTA CCGGAAAGAC TGGGTCCTTT CTTGGATAAA151 CCCACTCTGT GTCCGGTCAT TTGGGCGTGC CCCCGCAAGA CTGCTAGCCG201 AGTAGCGTTG GGTTGCGAAA GGCCTTGTGG TACTGCCTGA TAGGGTGCTT251 GCGAGTGCCC CGGGAGGTCT CGTAGACCGT GCATCATGAG CACAAATCCT301 AAACCTCAAA GAAAAACCAA AAGAAACACA AACCGCCGCC CACAGGACGT351 TAAGTTTCCG GGTGGCGGCC AGATCGTTGG CGGAGTTTAC TTGCTGCCGC401 GCAGGGGCCC CAGGTTGGGT GTGCGCGCGA CAAGAAAGAC TTCCGAGCGA451 TCCCAGCCGC GTGGGAGACG CCAGCCCATC CCAAAAGATC GGCGCTCCAC501 CGGCAAGTCC TGGGGAAAGC CAGGATR116-SEQ ID NO.301 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA
201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAGATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAATACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCACAACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGAAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GTAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR45-SEQ ID NO.311 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCAG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCCCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTTA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GATGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACG401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGTTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR110-SEQ ID NO.321 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATTAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG AGGCGGTCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR43-SEQ ID NO.331 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAG ACCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAACGGTC CCAGCCGCGT GGGAGGCGCC AGCCCATCCC451 AAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGAT含病毒序列的克隆体以下列方式被存放在American Type CultureCollection，Baltimore，Maryland分离体SEQ ID NO.质粒标号ATCC存放号 存放日期C929pHCV-C975265 1992年7月2日R110 30pHCV-R110 75266 1992年7月2日质粒pHCV-C9含有一种新的变异的C9序列。四种与C9序列相关的变异体表示于图1中。已知分离体的序列信息来源如下HCV-J1，HCV-J4(1990年的Japan J.Exp.Med.6(3)期第167-177页Okamoto等人的文章)；HCV-J(1990年的Mol.Biol.Med.7期第495-501页Kato等人的文章)；HCV-BK(1991年的J.Virol.65期第1105-1113页Takamizawa等人的文章)；以及HCV-1 US-PT(1991年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA88期第1711-1715页Han等人的文章)。编号是根据1990年的Proc.Natl.Acad，Sci USA87期第9524-9528页Kato等人的文章。
表3C9分离体与原型美国(PT-HCV)和日本分离体(J-HCV)的核苷酸和氨基酸序列同种性的确定。<
>因此，本发明提供了专门测定C9分离体以及区分该分离体与其它肝炎分离体的物质和方法。在一些实施例中，本发明的方法是基于采用或不采用PCR来放大目标序列的核酸的杂合。在另一些实施例中，本发明的方法采用了专门用于C9分离体的免疫球蛋白。
专用于C9的引子及探针的低核苷酸序列表示于下面的表4中。
表4探针SEQ ID NO.37MY 160 5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′ (nt216-233)SEQ ID NO.34(1)5′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt174-197)SEQ ID NO.35(2)5′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt374-397)SEQ ID NO.36(3)5′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt527-550)正向引子SEQ ID NO.38(1)5′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′ (nt204-224)SEQ ID NO.39(2)5′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′ (nt163-183)SEQ ID NO.40(3)5′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′ (nt360-380)反向引子SEQ ID NO.41(4)5′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′ (nt509-529)SEQ ID NO.42(5)5′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′ (nt555-575)用于识别核苷酸的编号系统取自上述1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.上Kato等人的文章。
一种低核苷酸KY 150(SEQ ID NO.43)可用于检测C9分离体及前面已知的HCV原型分离体。该低核苷酸具有以下序列5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.
对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是表4中所示的任何正向/反向的引子对都适用于专门放大C9分离体及相关的同型体。还显而易见的是选择一个适于杂合体为表4中所给的核苷酸位置的导引的放大了的核酸子序列的C9-专用的引子。
在一个优选实施例中，本发明的引子与目标核酸的聚合酶链反应(PCR)放大一起使用。由于HCV是一种RNA病毒，在放大过程的第一步是待放大区域的DNA复制体(cDNA)的合成。反转录可以作为一个独立的步骤进行，或如下面所述，在一个同型的反转录聚合酶反应(PT-PCR)，即用于放大RNA的聚合酶 链反应的一种变型中进行。
尽管PCR方法在本技术领域内是众所周知的(见美国专利第4,683,195；4,683,202及4,965,188号)，但是为了明确起见，并且为了那些对PCR方法不熟悉的人充分理解本发明，下面给出了一些PCR的一般性知识。
为了采用PCR方法放大样品中的目标核酸序列，该序列对于放大系统的组成来说必须是可以得到的。通常这种可得性是通过将核酸从样品中分离出来而保证的。从生物样品中提取核糖核酸的多种技术已在本领域内已知。例如，参见1989年的PCR Technology(Erliched.，Stockton Press，New York)中Rotbart等人的文章及1987年的Biochemistry 26期第1617-1625页上Han等人的文章中所描述的那些技术。另外，如果样品相当容易分解，则在采用PCR技术进行放大之前，不需要对核酸进行纯化，即，如果样品中包括细胞，特别是外周血液淋巴细胞或单核细胞，则细胞内成分的溶胞和分散只能通过让细胞悬浮在低渗的缓冲液中来完成。
每个PCR循环的第一个步骤包括核酸复合体的分离。当然，如果目标核酸是单股的，即单股RNA，则在第一个特循环中不需要初始分离步骤。一旦两股被分开，则PCR的下一步包括将分离开的股与位于目标序列两侧的引子杂合，则引子被扩展成与目标股互补的复制体。为成功进行PCR放大，引子被设计以便每个引子沿着复式序列杂合的位置就是使得一个引子合成得到的扩展产物，当从模板(补体)上分离出来时，起到另一个引子扩展的模板作用。变性、杂合及扩展循环可按需要重复多次以获得所希望数量的放大的核酸。
在PCR方法的优选实施例中，股分离是通过将反应加热到足够高的温度并持续足够长时间以引起复合体的变性但不引起聚合酶的不可逆变性来获得的(见美国专利第4,965,188号)。典型的热变性包括约80℃至105℃的温度持续几秒至几分钟的时间。然而，股分离可采用任何包括物理的，化学的或酶的方式进行。可以采用螺旋酶，例如或一种显示出螺旋活性的酶来诱发股分离。例如，在存在ATP的情况下，RecA酶就具有螺旋活性。适于采用螺旋酶进行股分离的反应条件是本技术领域内已知的。(参见1978年的CSH-Quantative Biology 43期第63-67页上Kuhn Hoffman-Berling的文章；和1982年的Ann.Rev.Genetics 16期第405-436页上Radding的文章)。
在包括适当的盐、金属阳离子及pH缓冲液系统的反应介质中存在适量的四种脱氧核苷三磷酸盐(一般为dATP，dGTP，dCTP，以及dTTP)，的情况下，PCR中的引子依赖于模板的扩展被一种聚合剂催化。适当的聚合剂是已知用来催化依赖模板的DNA合成的酶。由于丙肝是一种RNA病毒，因此，作为引子扩展的初始模板是RNA。适合于由RNA模板合成互补的复制-DNA(cDNA)序列的聚合剂是反转录酶(RT)，如鸟成髓细胞性白血病病毒RT，Moloney(莫洛尼)鼠白血病病毒RT，或Thermus嗜热菌(Tth)DNA聚合酶，一种由Perkin Elmer销售的具有反转录酶活性的一种热稳定的DNA聚合酶。一般在初始反转录步骤留下DNA链作为放大模板之后的第一个变性步骤中，基因RNA/cDNA复式模板被加热变性。与一个DNA模板一起使用的适当的聚合酶包括，例如，E.coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，T4DNA聚合酶，Tth聚合酶及Tag聚合酶，从一种由Hoffmann-LaRoche研制和生产的，并由Perkin Elmer销售的Thermus水生动植物中分离出来的一种热稳定的DNA聚合酶。后一种酶被广泛用于核酸的放大和排序。采用Taq聚合酶的反应条件在本领域内是已知的并且在上述1989年PCR Technology上Gelfand的文章中作了描述。
当RNA被放大时，进行一个初始反转录(RT)步骤以产生RNA的一个DNA复制体(cDNA)。1991年7月11日出版的国际专利第WO91/09944号中描述了采用一种在PCR放大中也起作用的热稳定聚合酶进行高温反转录。高温RT得到了更强的引子特异性并改进了效率。在“同种的RT-PCR”中，相同的引子和聚合酶足以满足反转录和PCR放大步骤两者的要求，并且优选反应条件以使得不需改变试剂即可发生两种反应。Thermus嗜热菌DNA聚合酶，一种可以起到反转录酶作用的热稳定的DNA聚合酶被用于所有的引子扩展步骤中，而无论模板如何。两个过程无需打开试管更换或加入试剂即可完成；只有温度模式在第一个循环(RNA模板)和其余的放大循环(DNA模板)之间要进行调整。
预计HCV基因组的5′终端具有重要的二级结构，该结构可能通过干扰与引子的杂合，利用反转录酶，如Moloney鼠白血病病毒RT，来阻止反转录的进行。不幸的是，提高反应温度使二级结构变性的方法同时也使得大多数反转录酶失去活性。而利用重组的Thermus嗜热菌(rTth)DNA聚合酶的反转录活性则允许cDNA合成在高温下进行而不会使酶灭活。本发明的引子在这种高反转录温度下保持与RNA模板杂合。
PCR方法可以一种在每个步骤之后加入新的试剂的分段方式进行，或以一种所有试剂都同时加入的方式，或以一种在给定数目的步骤之后加入新鲜的或不同试剂的部分分段方式进行。例如，如果通过加热诱发股分离，且聚合酶是对热敏感的，则必须在每一个股分离循环之后加入聚合酶。但如果，例如，采用螺旋酶来变性，或如果采用一种热稳定聚合酶来扩展，则所有试剂都可以在一开始时加入，或可替换地，如果试剂的克分子比对于反应很重要的话，则由于合成反应的消耗，需周期性地补充试剂。
对于本领域普通技术人员已知的是，PCR过程极普遍的是采用热稳定酶以自动操作过程的方式进行的。在该过程中，反应混合物的温度通过变性区域，引子缓冷区域，及扩展反应区域进行循环。或者缓冷和扩展温度可以是相同的。在实例中所述RT-PCR采用了这种两步温度循环。专门适于与热稳定酶一起使用的设备可以买到。
对于本领域内的普通技术人员来说还应知道，由前述反应和非特定的放大作用而产生的放大后的核酸导致的PCR的污染问题。一个减少这些问题的方法就是允许由前述反应产生的任何放大后的DNA的酶的降解并减少非特定放大。PCR放大是在替代dTTP的dUTP存在的情况下进行的。所产生的双股的含尿嘧啶的产物将被尿嘧啶N-糖基酶(UNG)降解，而正常的含胸腺嘧啶的DNA不会被UNG降解。在放大作用开始之前向放大反应混合物中加入UNG，降解了所有可能作为目标的含尿嘧啶的DNA。由于前面反应中的放大了的产物是含尿嘧啶DNA的唯一来源，则这一方法有效地对反应混合物作了消毒，消除了来自前面反应的污染问题(携带)。UNG本身由于加热而暂时不起作用，这样，在放大过程中变性步骤也用作使UNG失活。因此，尽管包含尿嘧啶，新的放大产物是在有效的，无UNG环境下形成的，并不会被降解。
本发明的一个优选实施例使用了一种包含一个消毒步骤的同种RT/PCR方法。这种一个试管不添加反应起到了消毒RT/PCR反应，防止携带污染的作用并提供了放大了的，可从含RNA目标的样品中检测到的PCR产物。该方法在实施例6中举例说明。
虽然优选的实施例包括有RT-PCR放大作用，但样品中目标序列的放大可采用任何已知的方法来完成，如连接酶链反应(LCR)，转录放大，和自持序列复制，其中每一种方法都提供了充分的放大以使得目标序列可通过核酸与一个SSO探针的杂合被检测到。或者，能够将探针放大到可检测水平的多种方法都可被采用，例如，Qβ-复制酶放大方法。术语“探针”包含了用于上述过程中的特定序列的低核苷酸；例如，用于LCR的两个或多个低核苷酸就是为本发明目的而采用的“探针”，尽管某些LCR实施例仅需用探针的连接来表示等位基因的存在。
特定序列探针的杂合是成功地完成本发明的一个重要步骤。本发明的特定序列的低核苷酸探针专门与HCV基因组的特定片段杂合，并具有与来自其它生物体的序列的不稳定失配。在充分严格的杂合条件下，探针只是专门与精确互补的序列杂合。杂合条件的严格性可被放松，从而允许不同数量的序列不符合。放大后的产物的检测使用了这种特定序列的杂合以确保检测到唯一准确放大的目标，因此，减少了由于来自相关生物体的同种序列的存在而引起的假阳性的机会。
检测在SSO探针和核酸序列之间形成的杂合体的测定方法是需要的，因为除杂合区域以外探针还具有其它特征。例如，如果探针首先被固定，如以下面所述的“反”点斑式固定，则探针还包含较长范围的，能够采用扩散法，一种在国际专利第89/11548号中更详细描述的技术，被固定在一个尼龙支持物上的多-dT。在点斑格式中，固定的目标与含有用于检测过程的化合物的探针杂合，如下所述。
本发明的探针可以利用上述合成低核苷酸的技术合成和标记。通过用32P-ATP和激酶培养探针的方法将探针在5′端用32P标记。一种合适SSO探针的非放射性标记是辣根过氧化物酶(HRP)。制备和检测含有该标记的探针的方法在下面的实施例中以及美国专利4,914,210和4,962,029中作了描述。关于这种被标记探针的使用方面的其它信息参见美国专利第4,789,630号；1988年度N.Eng.J.Med.319其第537-541页Saiki等人的文章；以及1988年的Bio/Technology 6期第943-947页上Bugawan等人的文章。有用的色原包括红的褪色染料和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。
通过测定SSO探针是否与存在于样品中的病毒序列键联，本发明的探针可被用于确定样品中是否存在病毒序列。为本发明目的而检测在SSO探针和样品中的核酸序列之间形成的杂合体的检测方法已为本领域公知。例如，可采用点斑方式来完成检测，如在实施例中所描述的。在点斑方式中，未标记的放大了的样品被键联在一个固体支持物上，如一种薄膜上，在适当的杂合条件下，用标记的探针对膜进行培养，通过冲洗除去未杂合探针，并用过滤器监测键联的探针的存在。当用一个探针分析多种样品时，点斑方式是十分有用的。多种样品被固定在同一膜的分散位置上，并通过将膜渗入探针溶液使它们同时杂合。
当使用多种不同的探针时，另一种十分有用的方法是“反”点斑方式，其中放大了的序列含有标记，且探针被键联在固体支持物上。如果本发明的试验被用作同步进行的一组试验之一的话，这种方式将是有用的。在该方式中，未标记的SSO探针被键联在膜上并在适当严格的杂合条件下暴露给标记的样品。然后通过在适当严格条件下冲洗除去未杂合的标记样品，过滤器则监测键联序列的存在。
正向和反向的点斑测定方法都可以在微量滴定盘中方便地进行。例如，探针可与粘接在微量滴定盘中的牛血清白蛋白(BSA)相连合，从而固定探针。
在另一种适合的测定系统中，在PCR放大过程中加入标记的探针。在每一个合成步骤中与目标DNA杂合的任何SSO探针都被聚合酶如Taq聚合酯，5′至3′端的核酸外切酶活性所降解，然后检测由探针得到的降解产物。因此，分解产物的存在表示在SSO探针和目标DNA之间产生了杂合。
上面给出的核苷酸序列是本发明的一个重要方面。尽管只表示出序列的一股，但对于本领域普通技术人员来说应认识到序列的另一股可从上述信息中推断出来。这些信息能够构成本发明的其它探针和引子。
本发明还涉及试剂盒，包含对于实施本发明方法有用的组分的多容器装置。一种有用的试剂盒含有用来检测丙肝病毒核酸的SSO探针。在某些情况下，SSO探针可被固定在一个适当的支持膜上。试剂盒还可包含用于RT-PCR的引子，如在本发明优选实施例中有用的引子。试剂盒其它优选组分包括，例如，反转录酶或聚合酶，核苷三磷酸盐的酶解物，用于标记的装置(例如，如果标记物是生物素的话，抗生物素蛋白-酶结合物，酶解物及色原)，及用于反转录，PCR或杂合反应的适当的缓冲剂。除上述组分外，试剂盒还可包含实施本发明方法的教导。
除PCR和核酸探针的使用外，本发明还提供了用来培养对特殊的HCV分离体特效的免疫球蛋白的方法。该方法的完成通常是首先表达病毒核酸序列，然后用被表达的蛋白质培养对所需分离体特效的抗体。
肝炎分离体的核苷酸序列可用于各种重组表达系统。在该方式中，所需基因，如壳体基因可被表达。原核或真核生物宿主中的核苷酸序列的重组表达在本领域内是众所周知的(见上述Sambrook等人文章)。被表达的蛋白质可被用于培养对分离体特效的免疫球蛋白。然后将免疫球蛋白用于检测病毒存在的测定方法中，如下面所述。蛋白质也可用于检测感染病毒的患者体内抗体的存在。
所希望的病毒序列在采用标准技术转化为用来表达的哺乳动物、酵母菌或昆虫细胞系之前方便地插入到一种媒介物中。原核生物被优选用于中间的克隆繁殖步骤。
为表达病毒序列而用于将转化的基因物质引入到宿主细胞中的特殊方法不是要求特别严格的。可以采用熟知的，将外来核苷酸序列引入到宿主细胞中的任何方法。这些方法包括采用磷酸钙转染，聚凝胺(Polybrene)，原生质体融合，electroporation，脂质体，微量注射，质粒媒介物，病毒媒介物，以及任何其它的将克隆繁殖的基因DNA，cDNA，合成DNA或其它外来基因物质引入到宿主细胞的熟知的方法(见上述Sambrook等人的文章)。唯一必要的是所采用的特殊基因工程方法能够成功地将至少一个能够表达所需的病毒蛋白质的基因引入到宿主细胞中。
用来将基因信息传输到细胞中的特殊的媒介物也不是特别严格的。可以采用任何表达真核细胞中重组蛋白质的适宜的媒介物。
表达媒介物包含一个真核生物转录单元或表达盒，其中含有表达真核细胞中的病毒核酸序列所需的全部要素。一个典型的表达盒包含一个可操纵地与DNA序列相连对病毒蛋白质进行编码的启动基因及转录体有效地进行多腺苷酸化所需的信息。
媒介物通常包括可选择的标记，如钠，钾ATP酶，胸苷激酶，氨基苷磷酸转移酶，潮霉素B磷酸转移酶，黄嘌呤-鸟嘌哈磷酸核糖转移酶，CAD(氨基甲酰磷酸合成酶，天冬氨酸盐氨甲酰基转移酶和二氢乳清酶)，腺嘌呤脱氨酶，DHFR，及天冬酰胺合成酶和乌本苷选择。
本发明的表达媒介物一般含有便于细菌中的媒介物克隆繁殖的原核生物序列和一种或多种仅在真核生物细胞，如哺乳动物细胞中被表达的真核生物转录单元。媒介物可包含或不包含一个真核生物复制子。如果存在一个真核生物复制子，则媒介物通过适当的可选择标记在真核生物细胞中是可放大的。如果媒介物不包括真核生物复制子，则不可能产生附着放大。取而代之的是，转染的DNA并入转染细胞基因中，而启动基因引导所需基因的表达。表达媒介物一般是由取自不同的，充分特性化的病毒或哺乳动物基因的成分构成的。对于在培养的哺乳动物细胞中克隆繁殖的基因的表达的一般性讨论参见上述Sambrook等人Ch.16。
表达之后，媒介物被引入到细胞中，转染的细胞在有利于病毒蛋白表达的条件下被培养，并利用标准技术将蛋白从培养物中复原。可以采用提纯蛋白的多种标准方法，例如，硫酸铵沉淀反应，凝胶电泳，离子交换色谱法，大小排斥色谱法或亲合色谱法。总的参见ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)上Scopes，R.的文章。
除采用被所希望的病毒基因组编码的蛋白质外，还可以采用复制对病毒特效的抗原决定簇的肽来培养专门对于该病毒的抗体。该技术对于本领域的普通技术人员来说是熟知的，并在，例如，Geysen等人Multipin Peptide Synthesis-A Review，Coselco Mimotypes，PTY Ltd。中作了描述。
上面讨论的多肽则被用于采用标准技术培养抗体当中。免疫球蛋白可用于多种用途。例如，它们可被用来测定在一种生物样品中病毒的存在或者提纯病毒抗原，例如采用亲合色谱法。它们也可被用来使相应的蛋白无效，包括抑制全部病毒的传染性。因此对于本领域的普通技术人员来说可获得的大量有关生产和制造各种免疫球蛋白分子的技术可以很容易地被用于产生对于特殊分离体的诊断和检测有用的分子。
如在此使用的术语“免疫球蛋白”，是指由一种或多种实质上被免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽构成的蛋白质。已知的免疫球蛋白基因包括K，λ，α，γ，δ，ε和μ不变区域基因，还有无数的免疫球蛋白可变区域基因。免疫球蛋白可以以除抗体之外的任何形式存在，包括例如Fv，Fab，和F(ab)2，还有以单链形式存在(例如，1988年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA85期第5879-5883页上Huston等人的文章；1988年的Science 242期第423-426页上Bird等人的文章；和1986年Nature 323期第15-16页上Hunkapiller和Hood的文章)。对于免疫球蛋白的结构和功能的一般性评述参见Fundamental Immunology，2d Ed；W.E.Pauled.，Ravens Press，U.Y.，(1989)。
可以采用各种方式生成使等位基因专门与所希望的分离体键联的抗体。非人类单克隆抗体，例如鼠的，复齿目的，马的等抗体的生成是熟知的并可通过例如用含有病毒或其中的一个片段的制剂使动物免疫的方式完成。由免疫的动物体获得的抗体-生成细胞被采用标准技术使其不灭并进行筛选。关于单克隆抗体生成的一般性方法的讨论参见Havlow和Lane的Antibodi es，A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Publications，N.Y，(1988)。
在某些情况下，希望采用重组DNA技术将非人类抗体的抗原键联区域，例如F(ab′)2或多可变区域，转变为人类不变区域(Fc)或构架组织区域以便从本质上生成人类分子。这种方法一般为本领域内已知并在例如，美国专利4,816,397，欧洲专利173,494和239,400中作了描述。另外，人们可以采用根据1986年Science 246期第1275-1281页上Huse等人概括的总的原始记录中的从人类B细胞中筛选DNA集合的方式分离对于专门与病毒键联的人类单克隆抗体或其中一部分进行编码的DNA序列，然后克隆繁殖并放大对具有所希望的特异性的抗体(或键联片段)编码的序列。
然后如上述方式产生的免疫球蛋白被用在许多确定肝炎分离体存在的诊断方法中。例如，对C9病毒特效的标记了的免疫球蛋白可被用于包括让免疫球蛋白与预计含有该病毒的样品接触并检测复合体是否形成的测定方法中。标记物可以按照本领域内熟知的方法直接或间接地与免疫球蛋白结合。如上面讨论的在标记的低核苷酸上下文中，可以采用很多种标记物。成分可采用几种方法中的任何一种被标记。一种普遍的检测方法是采用3H，125I，35S，14C，或32P标记的复合物或类似物的放射自显影照片。放射性同位素体的选择依赖于预计研究中便于合成的选择，变化的稳定性以及所选择的同位素的半寿命。非放射性标记物包括与标记的抗体键联的配体，荧光剂，化学发光剂和酶。标记物的选择依赖于所需灵敏性，与复合物结合的便利性，稳定性要求和可得到的测试设备。
非放射性标记物经常是采用间接方式连接的。一般地，一个配体分子(例如生物素)与分子共价地键联，然后配体与一个抗配体分子(例如链霉抗生物素蛋白)键联，该抗配体分子既是固有地可检测的，也是被共价地键联在一信号系统，如可检测到的酶，荧光复合物，或化学发光复合物上。配体和抗配体可以在很大范围内变化。由于配体具有天然的抗配体，例如生物索，甲状腺素，皮质醇，则全可被用于与标记的天然产生的抗配体的结合。或者，任何半抗原或抗原复合物均可被用于与一种抗体结合。
分子还可被直接用于信号发生复合物，例如通过与一种酶或荧光基团结合。具有标记物意义的酶基本上是水解酶，特别是磷酸酶，酯酶及糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光复合物包括荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮等。化学发光复合物包括虫荧光素和2，3-二氢基二氮杂萘二酮，例如，卢米诺。对于可被采用的各种信号产生系统的评述，见美国专利第4,391,904号。
为了检测本发明的复合物，一般将混合物与能够键联免疫球蛋白Fc区域的蛋白质接触，如第二抗体，蛋白质A或蛋白质G。蛋白质最好被固定在一个固体表面上，且该固体表面被冲洗以除去对所需病毒特效的非键联免疫球蛋白。将生物分子固定在固体表面上的许多种方法已为本领域已知。例如，固体表面可以是一种膜(例如，硝化纤维素)，一种微滴定盘(例如PVC或聚苯乙烯)或一个颗粒。所希望的成分可以共价键联或非共价地通过非特异性结合进行连接。利用适合于所使用的特殊标记物的标准技术则可检测到标记物。
上面讨论的重组表达的蛋白质或病毒溶解产物也可被用在诊断过程中。这些过程一般包括让怀疑含有抗体的生物样品(如血清)与病毒接触，并检测免疫学反应。反应的检测最好采用上述标记的蛋白质。适合于这个过程的方法在美国专利第5,055,391号中作了详细描述。
给出下面列举的本发明的实施例，只是为了说明本发明目的而不是对本发明范畴进行限定。通过阅读前面的内容并根据实例，对那些本专业普通技术人员显而易见的是，在权利要求范围内包含了本发明大量的实施例。
实例1在同种RT-PCR中，同一种聚合酶起到了反转录酶和DNA聚合酶两者的作用。这就使得HCV基因组的RNA的初始反转录和其后的cDNA放大在同一试管中进行，而不需要在两个步骤之间打开试管更换试剂。
利用产自Micro Probe的Iso QuickTM核酸提取试剂盒将核酸从血清或血浆中分离出来。所有的放大作用都是利用产自PerkinElmer的Tc9600 ThermocyclerTM和Micro AmpTM试管，以20微升的总的反应容量进行的。每20微升反应的试剂列在下面表5中。
表5RT-PCR反应混合液H2O6.3μl10xRT反应缓冲剂(100mM Tris-HCl(pH8.3)，900mM. HCl)2.0μlMncl2(10mM，0.85mM最后浓度 1.7μldNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP各2mM在H2O，pH7.0中)2.0μl引子KY78(SEQ ID NO.18)(1.5μm在H2O中，3微克克分子/反应最终浓度)2.0μl引子KY80(SEQ ID NO.5)(1.5μm在H2O
中，3微克克分子/反应最终浓度) 2.0μlrTth DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT.USA；0.18μM或2.5单位/μl在1X酶贮存缓冲剂(20μm Tris-Hcl(pH7.5)，100mM KCl，0.1μM EDTA，1μM DTT0.2％20 Tween 20(Pierce Surfactants)，50％甘油[v/v]) 2.0μl模板核酸(在d H2O中总量＜250ng) 2.0μl对TC9600进行编程以提供如下分布的反应温度。在70℃下预热1分钟后，程序暂停一段足以插入反应试管的时间，程序重新启动。反应维持在70℃，历时15分钟，以便进行反转录。然后反应温度升至95℃，维持1分钟，以便使RNA-cDNA复合体变性。下一步，反应温度要经历两个95℃持续15秒和60℃持续20秒以循环，接着是38个90℃持续15秒的60℃持续20秒的循环。最后，反应温度维持在60℃维持4分钟，以进行最后的扩展步骤，冷却到15℃，维持这一温度直到放大了的样品分析得以完成。
实例2采用点斑式检测方法，将一小部分放大了的DNA进行变性并用到一个尼龙过滤器上，而后，该过滤器与一个标记的探针杂合。探针杂合区域是KY88(SEQ ID NO.12)，并用32P进行放射标记。或者，探针可共价地结合到辣根过氧化物酶(HRP)上，以便在有色原或化学发光基底物存在的情况下，提供一种非同位素的检测手段。
放大反应通常按照实例1所述的方法进行。而后PCR放大的产物经碱处理予以变性。5μl的PCR产物加入5μl，0.5M的EDTA，pH8.0，8μl 5N的NaOH，和82μl的H2O。混合物在室温下维持10分钟以完成变性。
Bio DyneTMB尼龙过滤器(Pall Corp，Glen Cove，NY，USA)的制备是采用在H2O中浸泡5到10分钟，在点斑复制(Bio-DotTMfrom Bio Rad，Richmond，CA，USA)已经形成之后，用200μl的H2O进一步漂洗。变性之后，在真空条件下，利用点斑装置，将100μl的样品混合液施于尼龙薄膜上，而后，每个凹室均用200μl 0.4N的NaOH漂洗，而整个过滤器则简单地用2×SSC漂洗，并进行空气干燥，直至无积水留在上面。DNA被固定并交联在尼龙过滤器上，这是利用StratalinkerTM(Stratagene，La Jolla，CA，USA)UV光箱(“自动交联”装置)，通过1200mJ/cm2的光通量的紫外线照射来实现的。
过滤器的“预杂合”是通过将其浸泡在隔热袋中的杂合缓冲液内(5XSSPE，5XDenhardt的溶液，0.1％SDS，50μg/ml鲱鱼精液DNA)，在50℃(空气振荡器)下保持至少30分钟。而后，缓冲剂用同样数量的含有1-2×105cpm/ml探针的相同溶液置换，过滤器可以在2小时至一整夜的时间内在50℃下进行杂合。
杂合后，将过滤器在2XSSPE/0.1％SDS中冲洗三遍；两次是在室温下持续20分钟，另一次是在严格的60℃高温下冲洗20分钟。而后将过滤器吸干，包以塑料包皮，用一或二个增光屏，在-70℃下对X-光底片暴光。
一个替换的目视观测方法是将过滤器与结合有低核苷酸探针的辣根过氧化物酶杂合，其配制方法如Levenson和Chang 1989年在PCR Protocols中的A Guide to Method and Application(Innis等eds.Academic Press，San Diego)第92-112页上和Saiki等人1988年的N.Eng.J.Med.319期第537-541页上所描述的，每篇文献都收编于此作为参考。杂合作用是采用每5ml杂合溶液2pmoles的HRP-SSO探针来进行的。
清洗后，有待用色原染色基底显影的过滤器应在pH5.0的100μM柠檬酸钠中漂洗，然后放入含有每毫升(Fluka)0.1mg/ml的3，3′5，5′-四甲基联苯胺和百分之0.0015的过氧化氢的pH5.0的100μM柠檬酸钠中，在室温下轻轻搅动培养10到30分钟。在水中漂洗显影后的过滤器，并立即被拍照。准备好TMB检测系统，并基本上按照Perkin Elmer销售的AmpliTypeTMDQα DNA定型试剂盒中所描述的方法使用。在另一个实施例中，过滤器是采用化学发光检测系统(ECL；Amersham ArlingtonHeights，IL，USA)进行显影的。过滤器在PBS中漂洗5分钟，并置入ECL溶液，轻轻搅动持续1分钟。而后过滤器在室温下在X-线底片上暴光1至5分钟。
实例3在本发明的这一实施例中，使用了反点斑方式。探针的杂合区是KY88(SEQ ID NO.12)，KY150(SEQ ID NO.43)，或MY160(SEQID NO.37)而且探针是固定在一个薄膜上的。放大了的目标DNA与结合在薄膜上的探针杂合，如在尚未批准的序号为197,000和347,495的申请中；1989年的Proc.Natl.Acad.Sci.86期第6230-6234页上Saiki等人的文章中；及由PerkinElmer销售的Ampli TypcDQα DNA定型试剂盒内的产品插页中所描述的。每份文献都收编于此作为参考。放大的引子被生物素基化，如上述Levenson和Chang 1989年所介绍的那样，因此，与结合在膜上的探针杂合的任何放大的DNA都可以很容易地被检测到。
在一个实施例中，检测是靠结合有链霉抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶(SA-HRP)与任一种生物素基化了的，放大的与结合在膜上的探针杂合的DNA进行反应来实现的。于是，通过SA-生物素的相互作用，HRP变成可与放大的DNA结合，并可被用来产生一个信号，这可以采用多种熟知的方式实现，如利用四甲基联苯胺的氧化作用生成一种带色的化合物(见美国专利第4,789,630号)。
尽管探针可用任意一种方法固定在薄膜上，一种优选的方法是用一个很长的多-dT序列接在探针杂合区域末端。于是，所得到的多-dT“尾巴”可与尼龙薄膜上的胺基基团起反应。将探针共价地固定在薄膜上，可以利用UV辐射使这种反应变得更加容易。
末端的脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT，Ratliff Biochemicals；为进行如下反应，假定浓度约为120单位/μl，这相当于100pmole/μl)可用来在探针上生成一个多-dT尾巴，虽然也可以在市场上买得到的DNA合成装置上合成带尾巴的探针。当采用DNA合成装置制造带尾巴的探针时，仍应将尾巴置于探针的5′-末端上，因此，在尾巴区，首先发生不希望的过早的链终止。
TdT反应需在容积约为100μl的含有1XTdT盐，200pmole低核苷酸，800μMdTT和60单位TdT的溶液中进行。10XTdT盐是1.000mM K-二甲胂酸盐，10mM CoCl2，2mM-二硫苏糖醇，250mM的Tris-d，pH7.6，并按收编于此作为参考的Meth.Enzymol 65期第43-62页上Roychoudhury和Wu，Meth所述的方法制备的。为方便起见，可配制出8 mM dTTP的10X贮备溶液(用NaOH中和到pH7.0)。
TdT反应需在37℃下进行2小时，然后，通过加入100μl10mM的EDTA，pH8予以停止。带尾巴的低核苷酸的最终浓度为1μM(1pmole/μl)，而均聚物尾巴的长度为400个残基。可以通过调节dTTP与低核苷酸的克分子比来改变尾巴的长度。加了尾巴的探针可在-20℃下贮存直至使用。
对于反点斑式优选的薄膜是由Pall制造并由ICN以BioTransTM尼龙薄膜出售的一种BiodyneTMB尼龙薄膜，微孔大小为0.45微米。可用Bio Rad生产的Bio-DotTM点斑装置很方便地将探针点式固定在薄膜上。每一种探针都被均匀，离散地点式固定于薄膜上。在用于点斑装置之前，约2到10微微克分子的每一种带尾巴的探针与50到100μl的TE缓冲剂预先混合。点斑固定后，将薄膜简单地放在吸纸上，吸去过多的液体。然后将薄膜放入UV光箱内，如Stratagene生产的StratalinkerTM光箱，并在光通量为，50到60微焦耳/cm2下用254nm曝光，以使加尾巴的探针固定在尼龙薄膜上。在杂合溶液中简单漂洗约15分钟以除去粘结的探针之后，准备将薄膜与生物素基化了的PCR产物杂合。
通过加热至95℃，并保持3到10分钟，以使放大了的PCR产物变性。将40μl变性后的PCR产物加在探针板上以进行杂合。杂合作用是在57℃下在装有杂合缓冲液的摇动的水槽中进行的，历时20分钟，杂合缓冲液是由0.5XSSPE，0.25％SDS，和5XDenhardt溶液(20XSSPE，含有0.02MEDTA，0.2MNaH2PO4，3.6MNaCl；0.11MNaOH，调整到pH7.4)组成的。用3ml的在3.1ml杂合缓冲液中含有25μl的SA-HRP溶液去置换杂合缓冲液，并在57℃下在一个摇动的水槽中持续培养20分钟。
清洗是在2×SSPE和0.1％的SDS清洗缓冲液中进行的。薄膜在10ml清洗缓冲液中经简单漂洗后，历时12分钟的严格的清洗在57℃下在10ml的清洗缓冲液中进行。在10ml，0.1M的柠檬酸钠，pH5.0中清洗5分钟之后，进行室温下历时5分钟的另一次清洗。
色原的结合是在5ml的色原溶液中进行的，室温下历时25-30分钟，该溶液包含5ml 0.1 M的柠檬酸钠，5μl 3％的过氧化氢和0.25ml的色原(Perkin Elmer生产的TMB)。在室温下进行三次在蒸溜水中历时10分钟的清洗。用1XPBS在室温下历时30分钟的后清洗可以提高信号的质量。在这些包括着色的步骤中，薄膜应该用铝箔包裹以避光，显影后的薄膜应被拍照下来以作为永久性记录。
实例4在本发明的这一实施例中采用了微滴定盘方式。探针被固定在微滴定盘上的凹室内。如上所述，放大了的目标DNA与已经键联在上面的探针杂合。如在前述实施例中所述，起放大作用的引子被生物素基化以使其能检测出与键联的探针杂合的放大的DNA。
首先，所需的与BSA键联的探针可以吸附到每个凹室的塑性表面上，然后，用蛋白质，如牛血清白蛋白将凹室封闭。优选地，采用可由Corning得到的96个凹室的盘。
放大一旦完成，PCR试管被从热循环控制器(可由PerkinElmer得到)上取下。在每个PCR试管中加注100微升变性溶液。在每个试管上使用一种新的带吸管的顶端。在一个实施例中，检测工作不是马上进行的。在那种情况下，PCR试管在2℃至8℃下存放了一晚上。变性放大反应剂在2℃至8℃存贮情况下变得粘稠了。试管在打开之前在25℃至30℃之间粗略加热以便于吸出。
适当数量的8凹室微滴定盘条带(最少为2个条带)被取出并放于微滴定盘框架中。微滴定盘中每一个凹室吸入100μl的杂合缓冲液。
变性溶液含有0.4MNaOH；80mM的EDTA和0.005％的麝香草酚兰。杂合/中和缓冲液含有2.5M的NaSCN；80mM的NaH2PO4；10mM的NaH2PO4；和0.125％的TweenTM20。使用前核实pH值为5.0+/-0.2。
使用带有多通道吸管的堵住的顶端，将25μl的变性放大反应剂由支架上的PCR试管中吸到微滴定盘中相应的凹室位置上。该盘用微滴定盘盖覆盖，并在侧面轻轻敲击10到15下，在吸入适量试剂后，凹室将变成浅黄色。如果未观察到改变，或仅仅是单一的改变为兰色，加入了过量的amplicon。试验持续下去，直到正OD值增加而负OD值不受影响。将该盘在37℃下恒温培养60分钟。
在恒温培养之后，用清洗液将盘清洗5次，盘的清洗可以人工方式完成，或采用适当编程的自动微滴定盘清洗器完成。为进行清洗，采用了一种1XPCR清洗缓冲剂。一种10X浓缩的PCR清洗缓冲液是按如下方法配制的9.94克/升的磷酸二氢钠；4.41克/升的磷酸钠(单元基)；3.722克/升的EDTA；87.66克/升的氯化钠；13.7克/升的TweenTM20；和10克/升的ProClin 300(Rohm和Haas，Philadelphia，PA)。溶液用磷酸调节的pH值(优选的pH值为6.5-7.1)。
用于手工清洗时，盘内的东西被倒空并拍干。在待试验盘中的每个凹室中加入300μl的清洗液，并且让该盘干燥15到30秒钟。将盘再次倒空并拍干。这种清洗过程应再重复四次。
对于一个自动微滴定盘清洗器，采用以下方法，凹室中的东西被吸出来，清洗器依程控在即将试验盘的每一个凹室内加入350微升的正在使用的清洗液，浸泡30秒钟并吸出，这些步骤应再重复四次，然后将盘拍干。
在即将试验的盘内每个凹室中加入100μl的结合液，抗生物素蛋白-HRP结合液是按如下方法配制的。稀释液含有0.1克分子浓度；0.25％Emulist 25(DKS International，Inc.，Tokyo，Japan)，0.1％的Kathon CG(Rohm和Haas，Philadelphia，PA)；0.1％的酚；1.0％的牛γ球蛋白。溶液具有达7.3用浓HCl调节的pH值。在该稀释液中加入10nM的结合的抗生物素蛋白(Vector Labs，Burlingame，CA)。于是盘被覆盖，并在37℃下恒温培养50分钟，并按上述方法再次清洗。工作基质是采用将2.0ml基质A和0.5ml基质B混合配制而成的，这是用于两个8凹室微滴定盘条带(16个试验)的每一联的用量。基质A含有3mM过氧化氢；6.5mM的柠檬酸盐；和0.1％的Kathon CG。基质B含有4.2mM的3，3′5，5′-四甲基联苯胺和40％的二甲基甲酸盐。工作基质的配制不能超过使用前三小时，或者在无阳光直射下贮存。
100μl的工作基质(基质A和基质B混合物)被加入到待试验的盘内的每个凹室中，而后盘被覆盖，并在室温下(20℃至25℃)在暗处培养10分钟，将100μl Stop Reagent(5％的H2SO4)加入准备试验的每个凹室中。记录下在450mM每个的凹室在加入Stop Reagent一小时内的吸收率。吸收率值被记录下来作为样本和对照。
实例5本发明的低核苷酸提供了大量的引子和探针的组合，它们可用于放大HCV基因组序列和检测放大后的产物。试验了大量的低核苷酸为证实其在RT-PCR放大过程中作为引子的有效性。
采用实例1中所述方法，不同的低核苷酸对均可进行PCR放大反应。放大后的产物用琼脂凝胶电泳分离并着色的标准方法(见上述Sambrook等)进行检测。在HCV序列的放大过程中，每一个上端引子KY 65(SEQ ID NP.1)和KY 98(SEQ ID NO.3)与每一个下端引子KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 95(SEQ ID NO.20)和KY99(SEQ ID NO.26)有效地起着作用。KY 67(SEQ ID NO.10)与KY 68(SEQ ID NO.27)和KY 99(SEQ ID NO.26)一起有效地起作用，每一个上端引子KY 80(SEQ ID NO.5)，KY 83(SEQ IDNO.7)，KY84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)和KY 144(SEQ ID NO.6)与每一个下端引子KY 78(SEQ ID NO.18)，KY95(SEQ ID NO.20)，KY 145(SEQ ID NO.19)，KY 148(SEQ IDNO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)一起有效地起作用。最后，每一个上端引子KY 80(SEQ ID NO.5)和KY 81(SEQ ID NO.11)与KY 100(SEQ ID NO.21)一起有效地起作用。
用KY 78(SEQ ID NO.18)和KY 80(SEQ ID NO.5)作为引子，经过PCR放大得到的放大产物，利用如上述实例2中所述方法，以KY88(SEQ ID NO.12)，KY 84(SEQ ID NO.8)和KY85(SEQ ID NO.9)中的每一个作为探针，即可被检测出。
引子KY 153(SEQ ID NO.15)，KY 149(SEQ ID NO.16)和KY 148(SEQ ID NO.17)不能和KY 85下端的任何上端引子一起使用。KY 78(SEQ ID NO.18)的3′-端与KY 88(SEQ ID NO.12)的3′-端相邻，因此，尽管这两个引子可以起到一个引子对的作用，由于缺少交错序列，使独立的探测成为不可能。引子KY86(SEQID NO.13)只能与KY 100(SEQ ID NO.21)，KY 99(SEQ ID NO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配对。引子KY 87(SEQ ID NO.14)只能与KY 99(SEQ ID NO.26)，KY109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配对。
以上讨论的KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY87(SEQ ID NO.14)和KY 148(SEQ ID NO.17)对于检测已知的HCV分离体而不是C9分离体是有用的。表4中所列出的探针和引子对于放大和检测HCV-C9和相关的变异体是特别有效的，而日本、美国HCV原型体除外。
KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY 148(SEQ OD NO.17)和KY 87(SEQ ID NO.14)是对于放大日本和美国HCV原型体特别有效，而对HCV-C9则例外的引子的例证。用于放大日本，美国和C9HCV原型体的引子包括KY 67(SEQID NO.10)，KY 78(SEQ ID NO.18)，KY 80(SEQ ID NO.5)，KY81(SEQ ID NO.11)，KY 83(SEQ ID NO.7)，KY 86(SEQ IDNO.13)，KY 88(SEQ ID NO.12)，KY 95(SEQ ID NO.20)，KY100(SEQ ID NO.21)，KY 144(SEQ ID NO.6)，KY 145(SEQ IDNO.19)和KY 153(SEQ ID NO.15)。引子KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 98(SEQ ID NO.3)，KY 99(SEQ IDNO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)，KY 111(SEQ ID NO.25)和KY 149(SEQ ID NO.16)适于放大日本和美国HCV原型体和相关的变异分离体并也可适用于检测HCV-C9及相关的同型体。
KY 67(SEQ ID NO.10)，KY 78(SEQ ID NO.18)，KY 81(SEQ ID NO.11)，KY 86(SEQ ID NO.13)，KY 95(SEQ ID NO.20)，KY 150(SEQ ID NO.43)和KY 145(SEQ ID NO.19)被证明是检测日本、美国和C9HCV原型体和相关的变异体的探针。用于检测日本和美国HCV原型体和相关的变异体而不能检测HCV-C9原型体的探针包括KY 83(SEQ ID NO.7)，KY 87(SEQ ID NO.14)，KY 84(SEQ ID NO.8)，KY 88(SEQ ID NO.12)，KY 85(SEQ ID NO.9)，KY 100(SEQ ID NO.21)，KY 148(SEQ ID NO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)。探针KY 65(SEQ ID NO.1)，KY 68(SEQ ID NO.27)，KY 82(SEQ ID NO.28)，KY 99(SEQ IDNO.26)，KY 109(SEQ ID NO.24)，KY 111(SEQ ID NO.25)，KY80(SEQ ID NO.5)，KY 144(SEQ ID NO.6)和KY 153(SEQ IDNO.15)适于检测日本和美国HCV原型体和相关的变异分离体并且可以同时适用于检测HCV-C9和相关的变异体。
实例6在有UNG存在的情况下，HCV RNA的同种RT/PCR放大是一种优选的方法。实例1中所说的同质RT/PCR放大方法被修改成包括一个消毒步骤。下述原始记录表明，RT和PCR反应包含了dUTP。消毒是在RT步骤之前，在50℃下进行的。在被提高了的RT-PCR反应温度下，UNG是没有活性的，且含dU的产物不会被降解。两个单位的UNG(Perkin Elmer)成功地对100μl用10,000个HCV RNA复制体构成的放大液中相当于0.25μl的携带体进行了消灭。更高剂量的UNG，例如，达到每100μl反应液6个单位，仍是适宜的。
反应混合物成分按以下顺序加入μl/RX50％甘油16.0016.0010X RT Rxn.缓冲剂(100mM Tris-HCl(pH8.3)，900mM HCl) 10.00dGTP(10mM)；200μM终值 2.00dATP(10mM)；200μM终值 2.00dUTP(20mM)；200μM终值 1.00dCTP(10mM)；200μM终值 2.00
KY80(SEQ ID NO.5)在15μM(15pmoles each/rxn终值)；(+)生物素基化了的链引子 1.00KY78(SEQ ID NO.18)在15μM(15pmoles each/rxn终值；生物素基(-)链，RT引子 1.00UNG1单位/μl 2.00rTth DNA聚合酶在1X酶存贮缓冲剂*中2.5U/μl4.00MnCl2(10mM)；0.9mM终值 9.00每支试管的Master Mix50.00RNA(连同在H2O中的载体基底**)50.00反应剂总体积100.00*1X酶存贮缓冲剂＝(20mM Tris-HCl[pH7.5]，100 mMHCl，0.1 mM EDTA，1 mN DTT，0.5％TweenTM20[Pierce Surfactamps]，50％甘油[v/v]。
**1毫克来自Pharmacia的聚rA均聚合RNA(No.27-聚合tA具有平均值8.8(范围在6-13)的S20，W或在降温下的一些非特定产物)是在每份反应剂低于200ng的输入值下使用的。牛胸腺DNA，PBLDNA，人胎盘DNA和来自细胞系K562的DNA均已检测过且其效果相同。
步骤1.打开TC9600热循环控制器，预热表层。
2.在室温下制备反应混合液。
3.将试管放入热循环控制器，按下“RUN”重新启动热循环控制器。
4.在文件(file)8处启动机器。
5.建议的热循环控制器条件为文件1保持 2分钟， 50℃(UNG消毒步骤)文件2保持 15分钟，70℃(反转录步骤)文件3保持 1分钟， 95℃文件4两种温度的PCR95℃，15秒和60℃10-30秒两个循环文件5两种温度PCR90℃15秒和60℃10-30秒38个循环文件6保持 72℃1小时文件7保持 15℃不限定文件8连接文件1，2，3，4，5，6，和7在第五步文件2中，15分钟的反应时间可以降低到5分钟，而不会降低反应效率。在第五步文件5中，对于高G+C模板，可以优选地提高变性温度到95℃。用微滴定盘测定方式分析反应产物，通常导致在阳性样品情况下大于0.8的吸收率值，和对阴性样品情况下≤0.5的吸收率值。
权利要求
1.一种检测在怀疑含有丙型肝炎病毒核酸的样品中的丙型肝炎病毒核酸存在的方法，该方法包括(a)将在样品中的核酸与一种寡核苷酸探针相接触，该寡核苷酸探针包括一个其长度至少为14个核苷酸的核酸苷序列，而且该寡核苷酸探针特异地适合于检测C9同型族系的一种HCV，而且其中所说的核酸序列包含于选自以下序列及其互补序列的一个序列中或者由选自以下的序列及其互补序列的一个序列所组成SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，和SEQID NO.33，以及(b)检测在丙型肝炎病毒核酸和该探针之间形成的稳定杂种。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的核酸序列包含于由下列序列及其互补序列中选出的一个序列中或者由选自下列序列的及其互补序列的一个序列所组成SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41和SEQID NO.42。
3.根据权利要求1或2的方法，该方法还包括在步骤(a)之前在能够放大在样品中的HCV核酸的条件下处理该样品的步骤，从而该放大作用是应用聚合酶链反应来完成的。
4.一种放大来自丙型肝炎病毒(HCV)族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，该丙型肝炎病毒(HCV)族系来自在样品中怀疑含有该病毒核酸的C9同型族系，该方法包括(a)将其长度至少为14个核苷酸并适合于放大来自丙型肝炎病毒(HCV)的一种族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的寡核苷酸引物与在该样品中的核酸相接触，该丙型肝炎病毒(HCV)族系来自C9同型族系的一种丙型肝炎病毒(HCV)的族系，以及其中所说的核酸序列包含于由下列序列及其互补序列中选出的一个序列中或者由选自下列序列及其互补序列的一个序列所组成SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32和SEQID NO.33；(b)用核酸聚合酶延长该引物；以及(c)重复步骤(a)和(b)直至得到可检测到的数目的丙型肝炎病毒核酸的复制品。
5.根据权利要求4的方法，其中该寡核苷酸引物适宜于放大来自C9同型族系的丙型肝炎病毒(HCV)的一种族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸，而所说的核酸序列包含于由下列序列及其互补序列中选出的一个序列中或者由选自下列序列及其互补序列的一个序列所组成SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，和SEQID NO.42。
6.用于检测丙型肝炎病毒核酸的一套试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一隔层，在该隔层中包含权利要求1至3的任一项权利要求所限定的一种寡核苷酸探针。
7.用于检测丙型肝炎病毒核酸的一套试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一隔层，在该隔层中包含权利要求4至5的任一项权利要求所限定的一种寡核苷酸引物。
全文摘要
本发明为放大和检测HCV－C同型核酸提供了试剂,方法和一套试剂盒,在包括病毒基因组DNA反转录生成cDNA以及随后的利用聚合酶链反应放大cDNA的过程中。低核苷酸引子可被用来放大和检测丙肝病毒核酸。通过杂合作用,低核苷酸探针可被用于检测放大后的DNA的存在。
文档编号C12N7/00GK1259670SQ9812379
公开日2000年7月12日 申请日期1998年10月31日 优先权日1991年8月27日
发明者R·M·雷斯尼克, K·K·Y·杨 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司