专利名称：无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因操作系统及其应用，特别涉及一种新型的无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用。属于生物技术领域。
背景技术：
乳酸菌作为人和动物肠道主要的益生菌群之一，在食品和发酵工业中的长期应用早已证明其安全级特性，其具有许多健康功效，乳酸菌能非特异性提高人和动物的免疫力，特别是在提高人和动物的胃肠道粘膜免疫功能方面，乳酸菌产生的乳酸菌素、细菌素、乳酸和其它多种有机酸类均具有抑菌、抗腹泻作用，在调节肠道菌群失调，增强肠道粘膜免疫功能，预防肠道传染性疾病中发挥重要作用；乳酸菌本身对黏膜有良好的黏附和肠道定植功能，并且乳酸菌细胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐剂作用等。乳酸菌的这些益生特点，使其作为良好的表达外源抗原的动物生态活载体在探索特异性抗原传递和诱导黏膜免疫应答 方面有其独特的优势和潜在的应用价值。通过乳酸菌携带的质粒插入外源基因转化乳酸菌作为抗原传递系统进行人和动物的粘膜免疫已在某些方面取得了可喜进展，许多研究揭示了乳酸菌质粒传递系统可表达外源抗原并能诱导特异性的局部黏膜和系统免疫应答，为利用乳酸菌的益生功能和特异性的疾病预防奠定了重要的理论和实践基础。但利用质粒系统进行外源抗原的表达存在很多缺陷，如乳酸菌质粒表达系统对外源抗原的表达量明显低于大肠杆菌表达系统；质粒表达存在不稳定性；质粒在细菌增殖过程中可发生丢失现象；质粒在细菌间的传递尤其是质粒中存在抗性基因使乳酸菌作为人和动物疫苗存在着重大生物安全隐患。因此，如何实现乳酸菌对外源基因的稳定、高效表达以及重组乳酸菌绝对不能携带有包括抗性基因在内的任何选择标记和多余碱基，完全符合生物制品生物安全评价标准，又能达到真正意义上的食品安全级乳酸菌活载体标准的要求，并能有效递呈目的抗原、增强抗原特异性的黏膜免疫应答，是当前需要进一步攻克的基础科学问题，显然乳酸菌的基因组的插入和缺失操作，尤其是无任何选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统就具有十分重大的现实意义。随着现代生物技术的巨大进步，已发展了多种基因操作技术在乳酸菌染色体水平上进行基因的缺失和插入操作。随着乳酸菌分子遗传学理论研究的深入，多种益生性乳酸菌的全基因组序列的测定、乳酸菌相关基因的结构与功能有了清晰的认识，为进一步实现乳酸菌染色体基因敲除和外源基因的插入及其稳定表达奠定了基础。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种新型无任何选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于包括一个辅助质粒、一个用于构建基因打靶主质粒的中间质粒和一个作为基因操作基础的乳酸菌菌株；其中所述辅助质粒含有一个宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因和一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的pWVOl复制子；其中所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒含有一个宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因、一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整PWVOl复制子和一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyl transferase, UPP)基因的宽宿主范围穿梭型表达盒;其中所述的基因操作基础乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)的任意乳酸菌菌株。在本发明中，优选的，所述辅助质粒依次含有大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型红霉素抗性基因Emr、温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子。
本发明中，优选的，所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒依次含有大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一个温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整PWV01复制子、一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围表达盒p32upp。本发明中，优选的，所述的乳酸菌菌株为缺失upp基因的完整开放阅读框，但保留了 upp基因的原始启动子和终止子的乳酸菌菌株。本发明中，在所述的辅助质粒中，大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr依次由ermC启动子、ermC基因、ermC终止子构成,优选的所述的大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr为962bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的 PWV01复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、RepA基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。在本发明的一个具体实施例中，所述的辅助质粒为pGBHE，其完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 6 所示。本发明中，在所述的用于构建基因打靶主质粒的中间质粒中，大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr依次由ermC启动子、Cmr基因、ermC终止子构成，优选的所述的大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr为896bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、R印A基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示；表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围p32upp表达盒，依次由p32-启动子、upp基因、prt-终止子构成，在p32upp表达盒的上游依次含有三个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点 Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)，优选的所述的p32upp表达盒为1086bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。在本发明的一个具体实施例中，所述的的用于构建基因打靶主质粒的中间质粒为pGBHC32upp，该质粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。利用本发明的乳酸菌基因组修饰操作系统通过基因重组操作即可实现对该中间质粒多种改造，进而实现对乳酸菌特定位点的删除及外源基因的插入。在本发明的具体实施例中利用该中间质粒构建得到的基因打靶主质粒pGBHC32uppTl可用于构建删除upp基因并精确插入Pac I (TTAATTAA)的基因操作基础乳酸菌菌株(Aupp)。本发明中，所述的作为基因操作基础的乳酸菌菌株，为乳酸菌染色体中缺失了630bp碱基的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的开放阅读框，并替换插入了一个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点Pac I (TTAATTAA)作为菌株标识，优选的，所述的乳酸菌菌株，命名为Aupp-L. casei 393,分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 5842，保藏日期为2012年3月2日。进一步的，本发明还提供了所述的新型无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统在制备转基因乳酸菌或基因工程重组乳酸菌中的用途，其特征在于包括将基因打靶主、质粒转入含有辅助质粒的基础乳酸菌菌株中通过同源重组筛选得到转基因乳酸菌或基因工程重组乳酸菌，其中所述的基因打靶主质粒是在中间质粒的基础上插入同源重组片段并缺失PWVOl复制子的部分序列后得到的含有pWVOl复制缺陷型复制子Ar印ApWVOl的重组质粒。优选的，pWVOl复制缺陷型复制子Ar印ApWVOl依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、ORF D基因构成。更优选的，所述的复制缺陷型复制子Ar印ApWVOl为1056bp，其核苷酸序列如SEQID NO. 5 所示。本发明利用提供的温度敏感型辅助质粒及通过中间质粒构建的主质粒构成的A upp-Based-system快速双质粒整合型基因打祀系统,首先定向敲除乳酸杆菌非必需基因upp基因，利用反选择标记upp基因，经5-氟尿嘧啶筛选获得upp基因缺失的乳酸菌作为基因操作基础菌株，获得的基础菌株是无任何选择标记的转基因乳酸菌株；在此基础之上，再次利用本发明提供的辅助质粒和基因打靶主质粒，同样利用温度敏感及5-氟尿嘧啶筛选，实现对乳酸菌染色体基因组任何必需和非必需位点，即任意位点的精确删除和准确插入，最终获得的转基因乳酸杆菌不携带包括抗性基因在内的任何选择标记，无任何质粒残留，完全符合生物安全要求的基因工程重组乳酸菌。利用本发明的无痕迹基因操作系统，结合乳酸菌的天然生物安全和益生特点，预计本发明产生的转基因乳酸菌和基因工程重组乳酸菌在益生乳酸菌的开发、研究以及改良工业化乳酸菌基因工程菌株中有广阔的应用前景；并且在乳酸菌免疫制剂和乳酸菌活载体的生物医学发面的研究和应用中也有更广阔的应用前景。
图I是辅助质粒pGBHE的构建示意图，其中大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因由962bp组成,基因依次由ermC promotor、ermC gene、ermCterminator构成；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWVOl 复制子由 1751bp 碱基组成，复制子依次由 single-strand replication origin reporigin^Double-strand replication origin rep origin、0RF B gene^ORF C gene^RepAgene、ORF D gene 构成；
图2是pGBHC的构建示意图，大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因，896bp,基因依次由 ermC promotor> Cmr gene、ermC terminator 构成；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子由1751bp碱基组成，复制子依次由 single-strand replication origin rep origin、Double-strandreplication origin rep origin、0RF B gene>ORF C gene>RepA gene>ORF D gene 构成；图3是中间载体pGBHC32upp的构建示意图,其中含有反选择标记基因p32upp序列，1086bp，含有大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因表达盒，896bp,基因依次由ermC promotor、Cmr gene、ermC terminator构成；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子由1751bp碱基组成，复制子依次由 single-strand replication origin rep or i gin > Doub I e-strand replicationorigin rep origin、ORF B gene、ORF C gene、RepA gene、ORF D gene 构成；图4是中间载体pGBHC32uppT0的构建示意图，其中含有反选择标记基因p32upp序列，1086bp，含有大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因，896bp，基因依次由ermC promotor>Cmr gene、ermC terminator构成；温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子由1751bp碱基组成，复制子依次由
single-strand replication origin rep origin、Double-strand replication originrep origin、ORF B gene、ORF C gene、RepA gene、ORF D gene 构成；含有 A arm 1474bp,两侧携带限制性内切酶位点Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA);含有B arm 1821bp，两侧携带限制性内切酶位点Pac I (TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)；图5是基因打靶主质粒pGBHC32uppTl的构建示意图，其中含有反选择标记基因p32upp序列，1086bp，含有大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因，896bp,基因依次由ermC promotor>Cmr gene、ermC terminator构成；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型复制缺陷型PWVOl复制子由1056bp碱基组成，复制子依次由 single-strand replication origin rep or i gin > Doub I e-strand replicationorigin rep origin、ORF B gene、ORF C gene、ORF D gene 构成，缺失 RepA gene ;含有 Aarm 1474bp，两侧携带限制性内切酶位点Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA);含有Barm 1821bp，两侧携带限制性内切酶位点 Pac I (TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)；图6是乳酸菌基因组缺失upp基因后的测序的比对，箭头所指方框中的TTAATTAA就是目标染色体基因组经扩增后连接T载体后的测序结果检测到的预期基因组标识；图7是乳酸菌基因组缺失upp基因后的PCR鉴定结果；图8是中间载体pGBHC32T A xpt的构建示意图；图9是基因打靶主质粒pGBHC32uppT A xpt的构建示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I、辅助质粒的构建
I、以大肠杆菌一乳酸菌穿梭型温度敏感型质粒pWVOl (GenBank登录号NC_002192)为操作对象，设计引物扩增制备温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子，其由1751bp碱基组成，复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、R印A基因、ORF D基因构成，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；扩增pWVOl复制子所用的引物如下所示上游5，TCGTGCACGGTTCTGTTGCGAAGTT3，下游5，GTGCACGACGTCTTTCTAAAAGTTCGCTAGATA 3，2、扩增制备大肠杆菌一乳酸菌穿梭型红霉素抗性标记基因Erythromycin (Emr)元件，扩增得到的Emr基因由962bp组成,基因依次由ermC启动子、ermC基因、ermC终止子构成，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；扩增穿梭性抗性基因Emr引物如下所示
上游5，CGTGCACGACGTCCTATCTAGCGAACT3，下游5，CGTGCACGACCGAATTCGAT3，3、两片段经ApaL I酶切后拼接完成辅助质粒pGBHE的构建。pGBHE质粒图谱参见图I所示。整个辅助质粒pGBHE的完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。实施例2、基因打靶主质粒的构建I、中间载体pGBHC的构建以构建的辅助质粒pGBHE为模板，设计上下游引物ori-upper :5’ -AAAAGCTTACCCTCTTTAATTTGGTTATA-3，；ori-lower :5，-AAACTCGAGTTAAGGGATGCATAAACTGCAT-3，，PCR 扩增有ermC promotor> ermC terminator元件及温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型PWV01完整复制子的2414bp碱基的片段，该片段两侧携带HindIII和Xho I限制性酶切位点；然后以质粒PNZ8112 (购自荷兰NIZO研究所)为模板，以上游引物Cm-upper :5，-AACTCGAGTCTCATATTATAAAAGCCAGTCA-3，和下游引物 Cm-Iower :5，-AAGCTTTATAATGAACTTTAATAAAATTGATTT-3’扩增氯霉素抗性基因Cmr，该片段长度670bp碱基，其两侧含有两侧携带HindIII和Xho I限制性酶切位点；两个PCR片段经HindIII和Xho I限制性酶切后，连接，连接产物涂布在氯霉素抗性LB平板上获得阳性克隆，经鉴定获得含有温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型PWVOl完整复制子以及氯霉素抗性基因的中间载体PGBHC。pGBHC质粒图谱参见图2所示。2、中间载体pGBHC32upp的构建将中间载体pGBHC经EcoR I酶切，获得的片段经T4DNA聚合酶平滑化；用引物(上游引物p32-UPP-upper-3 5’ -AAAGGCGCGCCTTAATTAAGCGGCCGCTGTCAATATATTCAAGGCAATCT-3’，下游引物p32-UPP-lower-Nl :5’ -AACCGITTCTACTCAATGAACTATAAG-3’)和超保真 DNA 聚合酶(NEB，Phusion聚合酶)扩增p32upp表达盒(SEQ ID NO. I所示)，上游含有(Asc I -Pac I -NotI )限制性酶切位点，PCR产物长度为1162bp碱基，扩增产物为平末端。将以上两个平末端的片段经T4DNA连接酶连接获得携带p32upp表达盒的上游依次含有三个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点 Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)、携带温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型pWVOl完整复制子以及氯霉素抗性基因的中间载体pGBHC32upp。pGBHC32upp质粒图谱参见图3所示。其完整核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
以下根据具体情况，对获得的中间载体pGBHC32upp进行改造，以获得基因打靶主质粒，进而获得缺失靶基因或是转入外源基因的乳酸杆菌。3、中间载体pGBHC32uppT0的构建按常规方法提取乳酸杆菌(Lactobacillus, casei 393)(购自美国模式培养物集存库(American type culture collection, ATCC)的基因组DNA为模板，以乳酸杆菌Lactobacillus, casei BL23 (GenBan k Accession number :NC_010999)为参考序列设计如下两对引物TlA-upper-4 :5’ -AAAGCGGCCGCAGAGCCTTTGTGAGTTGGT-3’ ；TlA-Lower I :5’ -ACATTAATTAACTCCTCCTAAACGCATTC-3’ ；TIB-upper I :5’ -CCATTAATTAAATTCTTTGGCATGTGTAAAA-3’ ；TlB-Lower I : 5 ’ -AAAGGCGCGCCAGCCAACACCGATGAACA-3’。扩增获得片段A arm 1474bp，两侧携带限制性内切酶位点Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA);扩增获得片段B arm 1821bp，两侧携带限制性内切酶位点Pac I(TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)。两个片段经Pac I酶切后定向连接，获得携带A arm1474bp和B arm 1821bp整合同源臂。该整合同源臂经Asc I和Not I进行双酶切后与同样酶切后的中间质粒pGBHC32upp片段进行连接，获得携带整合同源臂，并且携带温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型PWVOl完整复制子以及氯霉素抗性基因的中间载体pGBHC32uppT0。pGBHC32uppT0质粒图谱参见图4。4、基因打靶主质粒pGBHC32uppTl的构建以中间载体pGBHC32uppT0为模板，设计一对引物，上游引物I-Dele-repA-up-new :5， -ATGACAAACAAAGAAAAAGAGTTATT-3’ 下游引物I-Dele-repA-low-new :5’ -GATATAATTACCTTATCAAAAACAAGTAGCGA-3’，用超保真 DNA 聚合酶(NEB，Phusion聚合酶)扩增621 Ibp长度的载体片段，超保真DNA聚合酶(NEB，Phusion聚合酶)扩增的片段全部为平末端，将此6211bp长度的载体片段自连，连接体系电转入含有辅助质粒PGBHE的大肠杆菌，获得的6211bp长度的载体质粒就是基因打靶主质粒pGBHC32uppTl。基因打靶主质粒pGBHC32uppTl因为缺失复制基因repA，所以不能复制，该质粒只能在含有辅助质粒PGBHE的大肠杆菌中或含有辅助质粒pGBHE的乳酸菌中才能复制。参见图5实施例3、任意位点基因操作乳酸菌基础菌株的构建I、按常规方法制备乳酸杆菌(Lactobacillus, casei 393)的电转感受态，首先将从大肠杆菌中提取的辅助质粒pGBHE电转入乳酸杆菌(Lactobacillus, casei 393),获得阳性克隆后，再用此阳性菌株制备电转感受态，将从大肠杆菌中提取的基因打靶主质粒pGBHC32uppTl电转入已含有辅助质粒pGBHE的乳酸杆菌(Lactobacillus, casei 393,电压2500V、电击时间3ms)，涂布于含Emr抗性和Cmr的MRS平板培养基，挑取单个菌落，接种含Emr抗性和Cmr的MRS液体培养基，提取质粒，经酶切电泳、PCR和测序鉴定，获得阳性菌株。2、对获得的含有主质粒pGBHC32uppTl和辅助质粒pGBHE的阳性菌株，按1:100比例转接MRS培养基，升温到shut-off温度43°C、单独Cmr抗性筛选过夜。再按1:100比例转接MRS培养基，保持shut-off温度43 °C，再经43°C、Cmr抗性连续3次转接筛选，获得完全丢失辅助质粒和主质粒的稳定整合型重组菌株，该菌株具有Cmr抗性。
3、将菌液涂布Cmr抗性平板，获取单克隆，挑取单菌落MRS培养过夜。4、培养菌液按I : 100比例转接无任何抗性MRS培养基，37°C培养12小时。5、按同样的方法转接3到5次。6、制备含lOOiig/mL的5-FU (5_氟尿嘧啶)的SDM培养基，将培养的菌液按I 1000到I 100000的比例涂布5-FU-SDM培养基，37°C培养48到72小时。7、获取在5-FU (5-氟尿嘧啶)的SDM培养基上生长的单克隆。8、挑取单克隆，用无抗MRS培养基培养过夜，鉴定。 9、经基因组测序鉴定，最终获取缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的基因操作基础乳酸菌菌株(Aupp-L. casei 393)。参见图6。PCR鉴定结果如图7所示。所述的基因操作基础乳酸菌菌株(Aupp-L. casei 393)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 5842。10、利用该基础菌株和辅助质粒，利用特定目的位点区域构建的基因打靶主质粒，按照以上方法，可实现对任意位点的插入和缺失操作。实施例4、精确删除非必需基因(xpt基因)和精确插入Pac I (TTAATTAA)位点的乳酸菌菌株的构建I)中间载体pGBHC32T A xpt的构建按常规方法提取乳酸杆菌(Lactobacillus, casei 393)的基因组DNA为模板，以乳酸杆菌 Lactobacillus, casei BL23 (GenBankAccession number :NC_010999)为参考序列设计如下两对引物TxA-upper :5，-AAAGCGGCCGCAGACTGTGCCGGTTGGCGTG-3，；TxA-Lower :5，-ACATTAATTAATGCATGGCCTGTGCTGTCGG-3，；TxB-upper :5，-AAATTAATTAATTGCCAACGGTCAGGCGGTC-3，；TxB-Lower :5’ -AAAGGCGCGCCCGCCAAGCACCGTACCAGCA-3’。扩增获得片段A arm 1226bp，两侧携带限制性内切酶位点Asc I (GGCGCGCC)、Pac I (TTAATTAA);扩增获得片段B arm 838bp，两侧携带限制性内切酶位点Pac I(TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)。两个片段经Pac I酶切后定向连接，获得携带Aarm1226bp和B arm 838bp整合同源臂，该整合同源臂经Asc I和Not I进行双酶切后与同样酶切后的中间质粒pGBHC32upp片段进行连接，获得携带整合同源臂，并且携带温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型PWVOl完整复制子以及氯霉素抗性基因的中间载体PGBHC32T Axpt。pGBHC32T A xpt质粒图谱参见图8。2)基因打靶主质粒pGBHC32uppT A xpt的构建以中间载体pGBHC32T A xpt为模板，设计一对引物上游引物I-Dele-repA-up-new:5，-ATGACAAACAAAGAAAAAGAGTTATT-3’下游引物I-Dele-repA-low_new 5，-GATATAATTACCTTATCAAAAACAAGTAGCGA-3，，用超保真DNA聚合酶(NEB，Phusion聚合酶)扩增5338bp长度的载体片段，超保真DNA聚合酶(NEB，Phusion聚合酶)扩增的片段全部为平末端，将此5338bp长度的载体片段自连，连接体系电转入含有辅助质粒pGBHE的大肠杆菌，获得的5338bp长度的载体质粒就是基因打靶主质粒pGBHC32uppT A xpt。基因打靶主质粒pGBHC32uppT A xpt因为缺失复制基因repA，所以不能复制，该质粒只能在含有辅助质粒pGBHE的大肠杆菌中或含有辅助质粒pGBHE的乳酸菌中才能复制。参见图9。3)精确删除非必需基因upp基因及xpt基因乳酸菌菌株的构建a按常规方法制备缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的作为基因操作基础的乳酸菌株(Aupp-L. casei 393，保藏编号为CGMCC NO. 5842。)的电转感受态，首先将从大肠杆菌中提取的辅助质粒PGBHE电转入该Aupp的基因操作基础菌株种，获得阳性克隆后，再用此阳性菌株制备电转感受态，将从大肠杆菌中提取的基因打靶主质粒pGBHC32uppTAXpt电转入已含有辅助质粒pGBHE的Aupp的基因操作基础菌株(电压2500V、电击时间3ms)，涂布于含Emr抗性和Cmr的MRS平板培养基，挑取单个菌落，接种含Emr抗性和Cmr的MRS液体培养基，提取质粒，经酶切电泳、PCR和测序鉴定，获得阳性菌株。b对获得的含有主质粒pGBHC32uppT A xpt和辅助质粒pGBHE的阳性菌株，按 1:100比例转接MRS培养基，升温到shut-off温度43°C、单独Cmr抗性筛选过夜。再按1:100比例转接MRS培养基，保持shut-off温度43°C，再经43°C、Cmr抗性连续3次转接筛选，获得完全丢失辅助质粒和主质粒的稳定整合型重组菌株，该菌株具有Cmr抗性。c将菌液涂布Cmr抗性平板，获取单克隆，挑取单菌落MRS培养过夜。d培养菌液按I : 100比例转接无任何抗性MRS培养基，37°C培养12小时。e按同样的方法转接3到5次。f制备含IOOii g/mL的5_FU( 5-氟尿嘧唆)的SDM培养基，将培养的菌液按I : 1000到I 100000的比例涂布5-FU-SDM培养基，37°C培养48到72小时。g获取在5-FU (5-氟尿嘧啶)的SDM培养基上生长的单克隆。h挑取单克隆，用无抗MRS培养基培养过夜，鉴定。i经基因组测序鉴定，最终获得的菌株即为精确删除非必需基因upp基因及xpt基因并精确插入Pac I (TTAATTAA)的乳酸菌菌株。需要说明的是，将本实施例中插入的Pac I (TTAATTAA)位点进行替换，即可制备得到删除非必需基因upp基因及xpt基因且插入其他标记位点或外源片段的重组乳酸菌菌株，而该操作是本领域技术人员能够在不进行任何创造性劳动的前提下完成的。此外本领域技术人员还能够根据本发明的实施例的记载，结合要删除的基因的具体序列，设计同源重组臂，从而实现对任意位点的删除，获得任意位点缺失及/或插入任意位点或外源片段的重组乳酸菌菌株，而该操作是本领域技术人员能够在不进行任何创造性劳动的前提下完成的。
权利要求
1.一种无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于包括一个辅助质粒、一个用于构建基因打靶主质粒的中间质粒和一个作为基因操作基础的乳酸菌菌株， 其中所述辅助质粒含有一个宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因和一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子； 其中所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒含有一个宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因、一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子和一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPP)的宽宿主范围穿梭型表达盒； 其中所述的乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的任意乳酸菌菌株。
2.如权利要求I所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述辅助质粒依次含有大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型红霉素抗性基 因Emr、温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWVOl复制子。
3.如权利要求I所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒依次含有大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一个温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整PWVOl复制子、一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围表达盒p32upp0
4.如权利要求I所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的完整开放阅读框，但保留了 upp基因的原始启动子和终止子的乳酸菌菌株。
5.如权利要求2所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的辅助质粒中，大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr依次由ermC启动子、ermC基因、ermC终止子构成，优选的所述的大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr为962bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、R印A基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
6.如权利要求5所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的辅助质粒为PGBHE，其完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
7.如权利要求3所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于在所述的中间质粒中，大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr依次由ermC启动子、Cmr基因、ermC终止子构成，优选的所述的大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr为896bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWVOl复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORFB基因、ORF C基因、R印A基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌一革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的PWV01复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围p32upp表达盒，依次由p32-启动子、upp基因、prt-终止子构成，在p32upp表达盒的上游依次含有三个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点Asc I (GGCGCGCC)、Pac I(TTAATTAA)、Not I (GCGGCCGC)，优选的所述的p32upp表达盒为1086bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
8.如权利要求7所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于在所述的中间质粒为pGBHC32upp，该质粒的完整核苷酸序列如SEQ IDN0. 7所示。
9.如权利要求4所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的乳酸菌菌株，为乳酸菌染色体中缺失了 630bp碱基的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的开放阅读框，并替换插入了一个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点Pac I (TTAATTAA)作为菌株标识，优选的，所述的乳酸菌菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 5842。
10.权利要求1-9任一项所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统在制备转基因乳酸菌或基因工程重组乳酸菌中的用途，其特征在于包括将基因打靶主质粒转入含有辅助质粒的基础乳酸菌菌株中通过同源重组筛选得到转基因乳酸菌或基因工程重组乳酸菌，其中所述的基因打靶主质粒是在中间质粒的基础上插入同源重组片段并缺失PWVOl 复制子的部分序列后得到的含有PWVOl复制缺陷型复制子Ar印ApWVOl的重组质粒，优选的，pWVOl复制缺陷型复制子ArepApWVOl依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、ORF D基因构成，更优选的，所述的复制缺陷型复制子Ar印ApWVOl为1056bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
全文摘要
本发明公开了一种无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统及其应用，属于生物技术领域。具体地，本发明提供的载体系统包括一个温度敏感型、大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型辅助质粒；一个用于构建温度敏感型、大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型基因打靶主质粒的中间质粒；一个经过以上二者所构建的用于任意位点基因修饰操作的基础乳酸菌菌株。本发明所提供的无选择标记残留的快速双质粒基因打靶载体系统可以获取任意位点基因缺失或插入的转基因重组乳酸菌，所产生的转基因乳酸菌或重组基因工程乳酸菌在益生菌开发和基因工程益生菌制剂的研究和应用中具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/09GK102732502SQ20121018072
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者崔红玉, 李一经, 葛俊伟 申请人:东北农业大学