专利名称：一种酿酒酵母工程菌及其在生产乙醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母工程菌及其在生产乙醇中的应用。
背景技术：
随着当前能源的日渐枯竭，石油价格的不断上涨以及温室效应所带来的全球变暖，迫使人们越来越重视对于可持续能源的开发和利用。当前，木质素资源成为全球较丰富的可再生资源，如果木质素资源能够充分利用，并实现清洁能源的转化，必将成为石油的最有利替代品。以燃料乙醇为主的生物燃料作为一种洁净和可再生的交通燃料，是目前最可行、·使用量最大的生物运输燃料之一，更是减少化石燃油消耗和温室气体排放最有效的方法之一。纤维素燃料乙醇技术不需要消耗粮食资源，也不占用耕地，原料来源广泛，价格低廉，是一项环境友好、可持续发展的技术。酿酒酵母在酒精发酵工业中具有上百年的应用历史，具有乙醇产量高，抗逆性强等特点，是当前酒精生产行业必不可少的生产菌株。所有植物来源的木质纤维素资源都包含有丰富的纤维素，半纤维素，木质素等。通过预处理及酶解后，得到的大多是葡萄糖，同时还含有一定量的五碳糖(主要为木糖)。要想利用木质纤维素资源发酵生产酒精行业，就要求菌株必须同时可利用葡萄糖和木糖来转化生成酒精。天然的酿酒酵母不能利用木糖生长发酵，但却可以将木酮糖转化成乙醇，具备从木酮糖到乙醇的代谢途径。与天然可以利用木糖酵母相比较，酿酒酵母缺乏了从木糖到木酮糖的代谢途径。目前国内外许多实验室已经从事了关于构建可利用木糖的酿酒酵母工程菌株的研究，但大多数的酿酒酵母工程菌株只能在好氧及限氧条件下进行木糖发酵，而且由于副产物木糖醇的生成量较大，其木糖对于乙醇的糖醇转化率相对较低，不能够有效的代谢木糖(Kuype等，FMES Yeast Research,2004 ；Mervi H. T.等，Metabolic Engineering, 2001)。纤维素水解液是理想的乙醇生产原料，由于在其水解成糖液的过程中需要经过酸碱的处理，因此含有高浓度的乙酸，糠醛等抑制物，限制了菌株对于乙醇的发酵。当前国际上对于利用木糖工程菌株发酵纤维素水解液的报道很少，主要是由于菌株本身对于水解液抑制物的耐受性较差。普度大学Nancy Ho.团队构建的一株酿酒酵母工程菌株是目前可利用纤维素水解液发酵生产乙醇的菌株，该菌株在水解液中能共利用葡萄糖及木糖发酵乙醇，且乙醇得率相对较高，但是该菌株在发酵时需要较高的接种量通常水解液发酵接种量为IOg dry wt/L (Ming W. Lau等，PNAS，2009)。这些因素都极大的限制了纤维素乙醇产业化的进程。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株酿酒酵母。本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55,其保藏号为CGMCCNO. 6090。上述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55CGMCC NO. 6090在制备乙醇中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种生产乙醇的方法。本发明提供的方法，是液体发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55CGMCC NO. 6090，收集发酵产物，即得到乙 醇。上述方法中，所述液体发酵采用的培养基为发酵培养基或玉米秸杆纤维素酶水解液；所述发酵培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、木糖和水混合，得到发酵培养基；所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为l_20g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的浓度均为5-100g/L ；所述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖总含量为50_200g/L，所述玉米秸杆水解液中的葡萄糖和木糖的质量比为1:1-10: I。上述玉米秸杆纤维素酶水解液按照如下方法的制备将玉米秸杆先采用气爆的方法得到气爆产物，其中气爆条件为2. 3Mpa，3min，50%含水量；再将气爆产物采用纤维素酶进行酶解96h(纤维素酶购自山东隆大生物工程有限公司，100000U/ml)，得到玉米秸杆纤维素酶水解液。上述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖的比例(质量比)为3:1，葡萄糖和木糖的总糖含量约为200g/L。上述方法中，所述液体发酵包括如下步骤I)先将所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiac) W32N55CGMCC NO. 6090接种于种子培养基中培养，得到种子培养液；再将所述种子培养液离心收集菌体；2)将所述菌体按照3g干重/L的量接种到所述发酵培养基或所述玉米秸杆纤维素酶水解液中发酵，收集发酵产物。上述方法中，步骤I)中，所述培养的条件为30°C、250rpm培养18h小时；离心为4500rpm,离心7min,离心半径3cm ；步骤2)中，所述发酵的时间为30h_72h ;所述发酵的温度为30°C _40°C，所述发酵
为厌氧发酵。上述方法中，步骤I)中，所述种子培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和水混合，得到种子培养基；所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述种子培养基中的浓度为l_20g/L，所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度均为 l-20g/L。上述方法中，在所述步骤2)后还包括如下步骤将所述发酵产物离心收集上清液得到乙醇。上述离心的转速为13000rpm,离心(离心半径为3cm)时间为2min。因此上述菌株W32N55，已于2012年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJias :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 6090，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。本发明的实验证明，本发明提供的工程菌W32N55是通过在出发菌株中导入木糖还原酶基因(XYLl)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)，并使之表达出活性；同时提高木酮糖激酶(XK)的活性，得到酿酒酵母工程菌；进而将含有木糖还原酶基因(XYLl)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和木酮糖激酶(XK)基因的工程菌进行适应性驯化而得到的。本发明所构建的酿酒酵母工程菌W32N55在厌氧条件下，发酵57h可完全消耗45g/L木糖，产生16g/L乙醇；采用发酵-膜分离耦合工艺，在利用含总糖为200g/L的玉米秸杆水解液发酵时，发酵72h总糖利用率可达88%，产乙醇74g/L，总糖糖醇转化率在0. 42g/g左右。
图I为质粒pXYLl_2u (LEU2) -XYL2-XK的结构示意2为工程菌株W32N55木糖发酵示意3为工程菌株W32N55纤维素水解液发酵示意图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、重组菌株W32N55的获得一、重组工程菌的构建I、质粒的构建I)质粒 pXYLl-2 U (LEU2)质粒pXYLl_2li(LEU2)为将xyll 基因(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/X59465. I)插入载体 plasmid-2 u (LEU2)(载体 plasmid-2 u (LEU2)为将 pYES2 载体 ura筛选标记换成Ieu筛选标记，GALl启动子换成GPD启动子得到，其中pYES2载体购自Invitrogen 公司 Catalog no. V825-20,载体plasmid-2 u (LEU2)的序列见序列表 I)的 BamH I酶切位点间得到的载体。具体构建方法如下从树干毕赤酵母DNA中克隆木糖还原酶基因(xyll)，两端添加BamH I位点，将载体plasmid-2 u (LEU2)用BamH I酶切后，与基因xyll连接，得到质粒 pXYLl-2u (LEU2)。2)pXYL2-2u (LEU2)质粒pXYL2_2u(LEU2)为将 xyl2 基 |3 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/3262 report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=W65ST4K501S)插入plasmid-2 u (LEU2)载体的BamH I酶切位点间得到的载体。具体构建方法也可以如下从树干毕赤酵母DNA中克隆得到xyl2基因(两端是BamH I位点)，替换掉质粒pXYLl_2u (LEU2)中的xyll基因，构建成质粒pXYL2_2u (LEU2)。3)pXK-2u (LEU2)质粒pXK-2u(LEU2)为将 xk 基 |3 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/296145226 report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=W6615HT601N)插入plasmid-2 u (LEU2)载体的BamH I酶切位点间得到的载体。具体构建方法也可以如下从酿酒酵母DNA中克隆得到xk基因(两端是BamHl位点)，替换掉质粒pXYLl-2u(LEU2)中的xyll基因，构建成质粒pXK_2u(LEU2)。4 ) pXYLI-2u(LEU2)-XYL2-XK
以质粒pXYL2-2u (LEU2)为模板，以 F_5’CGAGCTCAGCTCAGITTATCATTA 3’，R-5’ CGAGCTCCAGCTTGCAAATTAAAGC 3’为引物(引物带有sac I酶切位点)，进行PCR扩增，得到2085bp产物(含有xyl2基因、启动子及终止子的表达框)；将上述2085bp产物通过SacI酶切与经过同样酶切的pXYLl-2ii (LEU2)连接，得到质粒pXYL12_2u (LEU2)；以质粒pXK-2u (LEU2)为模板，以 F_5’ AITTGCGGCCGCAGCTCAGITTATCATTA3’ R-5’ ATTTGCGGCCGCCAGCTTGCAAATTAAAGC 3’为引物(引物带有NotI酶切位点)，进行PCR扩增，得到2735bp产物(含有xk基因、启动子及终止子的表达框);将上述2735bp经NotI酶切与经过同样酶切的pXYL12-2u(LEU2)连接，得到质粒pXYLl_2u(LEU2)-XYL2-XK，结构示意图如图I所示。经过测序，质粒pXYLl-2u(LEU2)-XYL2-XK为将序列表中的序列2插入plasmid-2 u (LEU2)的SacI和NotI酶切位点间得到的载体。上述序列2依次由xyl2表达框、xyll表达框和xk表达框组成； xyl2表达框由xyl2启动子、xyl2基因和xyl2终止子组成，其中xyl2启动子为序列表中序列2自5’端第1971-2647位核苷酸所示的双链DNA片段，xyl2基因为序列表中序列2自5’末端第2654-3745位核苷酸所示的双链DNA片段，xyl2终止子为序列表中序列2自5’末端第3752-4006位核苷酸所示的双链DNA片段；xyll表达框由xyll启动子、xyll基因和xyll终止子组成,其中xyll启动子为序列表中序列2自5’末端第1284-1960位核苷酸所示的双链DNA片段，xyll基因为序列表中序列2自5’末端第319-1272位核苷酸所示的双链DNA片段，xyll终止子为序列表中序列2自5’端第1-255位核苷酸所示的双链DNA片段；xk表达框由xk启动子、xk基因和xk终止子组成，其中xk启动子为序列表中序列2自5’端第4013-4689位核苷酸所示的双链DNA片段，xk基因为序列表中序列2自5’端第4690-6492位核苷酸所示的双链DNA片段，xk终止子为序列表中序列2自5’末端第6493-6747位核苷酸所示的双链DNA片段。2、酿酒酵母感受态细胞的制备从平板上挑取I个酿酒酵母W303-1B (2N)(购自欧洲酿酒酵母菌种库，EUROpeanSaccharomyces Cerevisiae 编号 20000D 菌株 BMA64,网址为 http://web. uni-frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf/data/w303. html)单菌落的受体菌株，接种于 3ml YPD 培养基中，30°C摇床培养16h，转接过夜菌于50mlYPD中，按2%的接种比例接种。30°C摇床培养至OD600=L O。离心，4500rpm,5min,收集菌体,并洗漆三次。第一次和第二次用预冷的无菌水，第三次用预冷的山梨醇，最后溶到冰冷的山梨醇中，得到酿酒酵母感受态细胞。3、重组酿酒酵母工程菌的获得I)酿酒酵母转化及转化子的鉴定约50ng质粒pXYLl_2u (LEU2) -XYL2-XK与80ul酿酒酵母感受态细胞混合，转入预冷的0. 2cm电转杯中。采用美国BIO-RAD公司电转化仪，根据所使用电转化仪预设的酿酒酵母参数进行电击。电击结束后立即加入Iml预冷的IM山梨醇至电击杯中，然后将电击杯中的溶液全部转移至一无菌离心管中，30°C孵育2h，取不同浓度涂布SC选择平板(酵母氮碱0. 67%，2%葡萄糖，添加尿嘧啶，组氨酸，色氨酸)于30°C倒置培养4天直至菌落出现，得到转化子。
提取转化子的质粒，经过测序，该质粒为pXYLl-2u (LEU2) -XYL2-XK，含有pXYLl-2u(LEU2)-XYL2-XK的转化子为阳性重组工程菌。2)重组酿酒酵母工程菌的鉴定将上述阳性重组工程菌和对照菌株W303-1B (2N)分别接种于SC培养基中(培养基含0. 67%酵母氮碱，2%葡萄糖，添加了必须的氨基酸)30°C，220rpm培养过夜(12h)，离心收集菌体并采用玻璃珠震荡破碎法裂解细胞(《酵母遗传学方法指南》，87-88)，高速离心并收集蛋白上清，低温保存测酶活。以木糖为底物，NADPH做为辅酶在A34(lnm条件下测定木糖还原酶活性，以木糖醇为底物，NAD+为辅酶在A34(lnm条件下测定木糖脱氢酶活性。并通过考马斯亮蓝方法测定蛋白浓度。木糖还原酶比酶活(U/mg)用每毫克总蛋白每分钟内氧化NADH生成NAD+的微摩尔数表示。 木糖醇脱氢酶比酶活(U/mg)用每毫克总蛋白每分钟内还原NAD+生成NADH的微摩尔数表示结果阳性重组工程菌的发酵得到的木糖还原酶活性为0. 528±0. llU/mg，木糖醇脱氢酶活性为0. 32 ±0. 09U/mg。二、重组工程菌的木糖适应性驯化将上述验证具有表达酶活的阳性重组工程菌菌株在木糖培养基(酵母氮碱0. 67%，2%木糖，添加尿嘧啶、组氨酸、色氨酸)上不停地转接，起始生长在完全通氧状态下，摇床转数220rpm，经过几次转接后，菌株利用木糖生长速率明显加快，逐步降低摇床转数继续驯化，经过近210天的驯化，最终筛选得到工程菌株W32N55，在限氧条件下(摇床转数为IOOrpm)木糖唯一碳源培养基(上述木糖培养基)培养48h，0D_可以达到4左右。该菌株利用木糖生长的性能在不停的驯化过程中得到显著提高，其生长对于氧的需求也在不短降低。因此上述菌株W32N55 为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),已于 2012 年 5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 6090，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。实施例2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W32N55 CGMCC NO. 6090 在生产乙醇中的应用一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W32N55 CGMCC NO. 6090发酵木糖生产乙醇I、种子培养液的获得将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) W32N55CGMCC NO. 6090 接种于 5mlYPD培养基中，300C，250rpm培养过夜至饱和，按2%的接种量，接入装有250ml摇瓶的IOOmlYPD培养基中(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C，250rpm (旋转半径3cm)培养18h，作为种子培养液。2、发酵将上述I得到的种子培养液4500rpm,离心7min,离心半径3cm,上述种子培养液收集菌体，将菌体按照接种量为3g干重/L重悬于装有IOOml的YPX培养基中(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L，木糖45g/L)，厌氧条件下30°C发酵，每隔一段时间取发酵液，将发酵液进行离心，13000rpm,常温(25°C )离心(离心半径3cm) 2min, 0. 22 u m滤膜过滤后上样检测,用HPLC来分析发酵液组分，流动相为0. 5mM稀硫酸，采用Bio-rad HPX-87H柱子，流动相流速为0. 55ml/min,每个样品过柱时间为30min。根据常规木糖发酵产物，配置标准样品过柱，标准品包括葡萄糖，木糖，木糖醇，乙酸，甘油，乙醇混合物，样品均为色谱纯，每种物质含量为10g/L，根据标准品出峰时间，发酵产物中主要产物为乙醇和木糖醇，出峰时间分别为22. 6min和13. 3min。结果如图2所示，可以看出，发酵24h和48h分别产乙醇llg/1和15. 2g/l ;经过57h发酵，用掉全部木糖，产乙醇16g/L，产木糖醇9. 37g/L，木糖对乙醇的产率为0. 36g/g。二、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W32N55CGMCC NO. 6090 发酵纤维素水解液生产乙醇 I、种子培养液的获得与上述一相同。2、玉米秸杆水解液(纤维素水解液)的制备由于酿酒酵母本身不具备独特的木糖转运蛋白，需要依靠六碳糖的转运蛋白来转运木糖，当培养基中葡萄糖和木糖共存时，由于转运蛋白对葡萄糖的亲和力远大于对木糖的亲和力因此优先利用葡萄糖。玉米秸杆水解液(纤维素水解液)的制备玉米秸杆先采用气爆的方法得到气爆产物，其中气爆条件为2. 3Mpa，3min，50%含水量；再将气爆产物采用纤维素酶进行酶解96h(纤维素酶购自山东隆大生物工程有限公司，为100000U/ml)，得到玉米秸杆水解液，主要含有葡萄糖和木糖，其中葡萄糖和木糖的比例(质量比)为3:1，葡萄糖和木糖的总糖含量约为200g/L。3、发酵将上述I得到的种子培养液4500rpm,离心7min,离心半径3cm,上述种子培养液收集菌体，将菌体按照接种量为3g干重/L接种到上述2得到的玉米秸杆水解液中，采用发酵分离耦合的工艺，在发酵罐的一端接入乙醇渗透气化膜，利用真空泵对发酵罐中液体进行抽取分离，将除掉乙醇的发酵液重新泵回发酵罐中，而乙醇则由收入装置收集，发酵的温度为30°C，厌氧发酵，每隔一段时间取发酵液，将发酵液进行离心，13000rpm,常温(25°C)离心2min，0. 22 y m滤膜过滤后上样检测，用HPLC来检测乙醇及发酵罐中其他副产物，条件同上。根据常规木糖发酵产物，配置标准样品过柱，标准品包括葡萄糖，木糖，木糖醇，乙酸，甘油，乙醇混合物，样品均为色谱纯，每种物质含量为10g/L，根据标准品出峰时间，发酵产物中主要产物为乙醇和木糖醇，出峰时间分别为22. 6min和13. 3min。结果如图3所示，可以看出，菌株发酵72h对总糖利用率可达到88%，乙醇的产量为74g/L ;总糖糖醇转化率(乙醇/消耗的总糖)在0. 42g/g。
权利要求
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55,其保藏号为 CGMCC NO. 6090。
2.权利要求I 所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W32N55 CGMCC NO. 6090在制备乙醇中的应用。
3.一种生产乙醇的方法，是液体发酵权利要求I所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55 CGMCC NO. 6090，收集发酵产物，即得到乙醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述液体发酵采用的培养基为发酵培养基或玉米秸杆纤维素酶水解液； 所述发酵培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、木糖和水混合，得到发酵培养基；所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中 的浓度为l_20g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的浓度均为5-.100g/L ； 所述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖总含量为50-200g/L，所述玉米秸杆水解液中的葡萄糖和木糖的质量比为1:1-10:1。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于 所述液体发酵包括如下步骤 . 1)先将所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55 CGMCC NO. 6090 接种于种子培养基中培养，得到种子培养液；再将所述种子培养液离心收集菌体； . 2)将所述菌体按照3g干重/L的量接种到所述发酵培养基或所述玉米秸杆纤维素酶水解液中发酵，收集发酵产物。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于 所述液体发酵的步骤I)中，所述培养的条件为30°C、250rpm培养18h小时； 步骤2)中，所述发酵的时间为30h-72h ;所述发酵的温度为30°C -40°C，所述发酵为厌氧发酵。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于 步骤I)中，所述种子培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和水混合，得到种子培养基；所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述种子培养基中的浓度为l_20g/L，所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度均为l-20g/L。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法,其特征在于 在所述步骤2)后还包括如下步骤将所述发酵产物离心收集上清液得到乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种酿酒酵母工程菌及其在生产乙醇中的应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55，其保藏号为CGMCC NO.6090。还提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55CGMCC NO.6090在制备乙醇中的应用。本发明的实验证明，本发明提供的工程菌W32N55是通过在出发菌株中导入木糖还原酶基因(XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)；同时提高木酮糖激酶(XK)的活性，得到酿酒酵母工程菌；进而将含有木糖还原酶基因(XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和木酮糖激酶(XK)基因的工程菌进行适应性驯化而得到的。
文档编号C12P7/06GK102732437SQ20121018099
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者孙红兵, 张博, 张延平, 张海峰, 李寅, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所