一种降解西维因的菌株及其酶制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制剂领域，涉及一种降解西维因的菌株及其酶制剂。
【背景技术】
[0002] 西维因作为一种重要的氨基甲酸酯类杀虫剂，是继有机磷、有机氯之后使用非常 广泛的第三大类杀剂。西维因被广泛使用于控制玉米、马铃薯、草莓种植中的害虫。在农作 物栽培过程中，特别在种子处理上，西维因得到广泛的应用。由于其不正确的保存、生产和 使用，造成土壤和地下水的污染。
[0003] 西维因与乙酰胆碱争夺乙酰胆碱酯酶的活性部位，是胆碱酯酶的抑制剂。西维因 是神经性毒物，对大多数的哺乳动物急性毒性都很大。因此，西维因对环境和人类健康存在 潜在的威胁。
[0004] 西维因对动物表现出了不同的毒性，如对蜜蜂的毒性，由于大多数植物是依靠蜜 蜂传播花粉的，而蜜蜂对西维因的LD5tl仅为1. 5 μ g/每头蜜蜂，因此植物中高残留的西维因 会对蜜蜂有很大的影响，从而影响植物的正常繁殖。西维因也会影响动物的神经中枢，从而 损伤动物的活动能力。暴露于32. 5mg 的浓度的西维因的环境中24小时，鲶鱼的致死 率达100%，当浓度低于12. 5mg · kg4时，虽然不会导致鲶鱼死亡，但会影响其脑功能。
[0005] 同时由于西维因具有雌激素的特征，因而被列入环境激素类物质（EDs)行列。它 会干扰生物体内正常的激素分泌，破坏体内环境，对生物体产生危害。西维因影响女性颗粒 黄体细胞合成孕激素的变化，扰乱体内原环境，导致受害者心理、智力、行为等方面的错位， 并影响人类的生育能力。因此，西维因对非靶标生物的毒性引起了广泛关注，2008年联合国 环境规划署和联合国粮食及农业组织明确定西维因是一种第三类致癌物质。
[0006] 因此，为了确保人们的食品安全和身体健康，减轻农药西维因使用以后给人类带 来的危害和威胁，有必要分离筛选能够高效降解西维因的菌株，研宄其生物学特性和降解 特性，制备西维因降解菌剂，以及能够降解西维因的酶制剂，使其用于土壤中西维因的生物 修复以及水果蔬菜中农药降解处理，以保证农产品的安全生产和安全食用，保障人类的身 体健康。
[0007] 通过微生物来修复氨基甲酸酯杀虫剂的污染的环境，具有成本低、无二次污染、生 态恢复性好等优点，因此，一直受到国内外研宄人员的关注。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的西维因降解菌。
[0009] 本发明的又一目的是提供又该菌株制备的降解西维因的酶制剂。
[0010] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0011] -种西维因的降解菌XWY-3,分类命名为新鞘氨醇菌（Novosphingobium sp.)，保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2015060,保藏日期为2015年1月 22臼。
[0012] 该菌株形态学特征如下：革兰氏阴性细菌，无芽孢短杆状，无鞭毛；在LB固体培 养基上菌落呈黄色、圆形、表面湿润、边缘整齐、半透明，菌落大小为0. 5~0. 8cmXl. 5~ 2. Ocm ;生理生化检测结果如下：氧化酶阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，不能水解淀粉 和明胶，V-P反应阳性，甲基红阴性，亚硝酸盐还原阴性，苯丙氨酸脱氢酶阳性，3-酮基乳糖 阴性，脲酶阴性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为KP704262,经鉴定为新鞘氨醇菌 (Novosphingobium sp.)〇
[0013] 本发明所述的降解菌XWY-3在降解西维因和/或制备降解西维因的酶制剂中的应 用。
[0014] -种降解西维因的菌剂，由权利要求1所述的降解菌XWY-3经发酵制备。
[0015] 一种降解西维因的酶制剂，对所述的降解菌XWY-3进行发酵，发酵液经冷冻破碎 后的上清加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂；向液体酶制剂中加入灭菌 的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固体酶制剂。
[0016] 本发明所述的降解西维因的酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)将所述的降解菌XWY-3试管种置于含有培养基的摇瓶中振荡培养至对数期， 获得菌种；
[0018] (2)将上述培养好的菌种接种入含种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得 种子液；其中，种子培养基为LB培养基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%，pH为 7. 0 ~7. 2 ;
[0019] (3)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产罐发酵培养，出罐形成能对 西维因降解的液体菌剂，其中发酵培养基为：葡萄糖1. 〇%，（NH4)2SO4O. 1%，K2HPO4O. 2%， MgSO40.0 2%，NaCl 0.01%，CaCO3O. 3%，酵母粉 0.05%，蛋白胨 0· 1%，pH 值 7. 2 ~7.5 ;
[0020] (4)将获得的发酵液离心，弃上清液，重悬于磷酸盐缓冲后，经2~3次冻溶后，离 心获得的上清液加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂；
[0021] (5)将液体酶制剂中加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固 体酶制剂。
[0022] 其中，所述的种子培养基需要121°C高压湿热灭菌后冷28~32°C使用；所述的菌 种按种子罐中种子培养基体积的10%接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中发 酵培养基体积的10 %接种量接种入生产罐；在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过 程中无菌空气的通气量为1 :〇. 8~I. 0 (v/v)，搅拌速度为200~260转/分，培养温度为 28~32°C，培养时间为48~55小时，发酵结束后获得液体菌剂，液体菌剂中菌体数量至少 达到IO 9个/ml。
[0023] 所述的制备方法，优选将步骤⑶所得的液体菌剂于4°C，5000r/min,离心10min， 弃上清液，加入原液体菌剂体积1/5的pH 7. 0、0. 5M的磷酸盐缓冲重悬后放置于-20°C冷 冻，12小时候取出后室温溶解，再重复冻融1~2次，4°C，5000r/min，离心10min，获得的上 清液加入0.3% (w/v)的山梨酸钾，20%的甘油（v/v)得到降解西维因的液体酶制剂；将所 述的液体酶制剂按照1:1质量比加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后制备获得能够降解 西维因的固体酶制剂。
[0024] 本发明所述的降解西维因的酶制剂在降解水果或土壤中西维因的应用。
[0025] 所述的应用优选将所述的降解西维因的液体酶制剂稀释后喷施到含有西维因的 果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因；稀释后的液体菌剂中菌体数量至 少达到IO7个/ml ;进一步优选将所述的降解西维因的液体酶制剂按照1:50体积比加入到 清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因。
[0026] 所述的应用优选将所述的降解西维因的固体酶制剂溶解于清水中后喷施到含有 西维因的果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因；溶解后的菌剂中菌体数 量至少达到IO 7个/ml ;进一步优选将所述的降解西维因的固体酶制剂按照1:100重量/体 积比加入到清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西 维因。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] 1)本发明从生产西维因的农药厂活性污泥中筛选到一株西维因降解菌 XWY-3(CCTCC NO :M 2015060)，利用该菌株可以有效地降解农药西维因，在解决农药西维因 污染的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全；
[0029] 2)使用保藏号为CCTCC NO :M 2015060的菌株XWY-3生产降解西维因的降解菌剂， 液体降解酶制剂以及固体降解酶制剂，具有生产使用成本低，使用安全，无毒副作用；
[0030] 3)本发明的酶制剂与常规使用的清水，洗涤剂浸泡等性比，效果更好，对水果蔬菜 中西维因的降解效率达到75 %以上。
【附图说明】
[0031] 图I XWY-3液体菌剂对培养液中西维因的降解液相色谱图
[0032] 生物材料保藏信息
[0033] XWY-3,分类命名为Novosphingobium sp.XWY-3,保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M 2015060,保藏日期为2015年1月 22臼。
【具体实施方式】
[0034] 实施例 I Novosphingobium sp. XWY-3 的获得
[0035] 从生产西维因的农药厂采集的活性污泥，在实验室用西维因作为唯一碳源进行多 次传代富集培养（30°C，每7天传代一次），得到能够降解西维因的菌悬液，把菌悬液在LB 培养基上进行涂布培养（30°C，3天），在平板上挑取不同的菌落，一一验证对西维因的降 解效果，最终获得能够降解西维因的菌株，并将它命名为XWY-3,加入甘油，在-70°C冰箱保 存。
[0036] 通过测定XWY-3的生理生化特性，克隆XWY-3的16SrDNA序列并对该16SrDNA序 列进行测序，把测序结果在Genbank进行BLAST比较，确定了 XWY-3的系统发育进化地位。 通过XWY-3的生理生化特征结果和系统发育进化地位等鉴定结果，最终把XWY-3鉴定为新 鞘氨醇菌株（Novosphingobium sp.)(以下简称为XWY-3)，并于将XWY-3的16S rDNA登陆 到 Genbank，登陆号为 KP704262。
[0037] 2015年1月22日我们将XWY-3寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号 为CCTCC NO :M 2015060,主要生物学特性为革兰氏阴性细菌，无芽孢短杆状，无鞭毛；在 0908固体培养基上菌落呈黄色、圆形、表面湿润、边缘整齐、半透明，菌落大小为0.5~ 0. 8cmX I. 5~2. Ocm ;生理生化检测结果如下