一种链霉菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力的链霉菌菌株及其在 秸杆腐熟方面的应用。
[0002]
【背景技术】
[0003] 秸杆具有资源丰富，来源广泛，资源化利用率低，研究开发潜力大等特点，因而其 资源化问题成为科研热点之一。我国是农业大国，秸杆资源丰富，年产秸杆量在8亿吨以 上，虽然数量巨大，但是利用率低，全国每年约有60%以上的秸杆被焚烧或是废弃，这样不 仅影响交通、诱发火灾、严重污染环境、破坏生态平衡，而且又浪费了宝贵的生物资源。微 生物是自然界物质分解者，在维持生态平衡和物质转化方面发挥着其他生物无法取代的作 用。环境中的微生物具有分布广泛、种类繁多、数量巨大、功能多样等特点，应用微生物发酵 的方法对秸杆进行腐解处理是其他理化方法所不能替代的，前景非常广阔。由于秸杆主要 是由纤维素、半纤维素和木质素组成，易被利用的水溶性碳水化合物含量较低，化学结构复 杂，具有很强的抗分解能力。又因为多数作物秸杆的表面有一层蜡质层，使微生物对其降解 的难度增大。
[0004] 降解纤维素的微生物有：①细菌。虽然种类远不如真菌多，但在土壤等环境中分 布的数量却很多，如：芽孢杆菌属（你生孢食纤维菌属A§a)、假单 胞菌属纤维单胞菌属（CfeBy/offlmas)等，最适生长温度大都在30~40°C 之间。同时细菌降解木质素的能力比真菌低得多。②真菌。真菌对木质纤维素的分解起 着重要作用。在中温条件下，主要有木霉属O-ricAoofe r?a)、曲霉属（J1SpergiBw1S)和青 霉属其中木霉属真菌的纤维素酶应用最多，能加速秸杆分解进程，缩短堆 肥时间。③放线菌。目前秸杆分解微生物的大部分研究集中在真菌和细菌，关于放线菌 的研究较少。主要有：诺卡氏菌属（Abcart/ia)、链霉菌属高温放线菌属 等。由于细菌产纤维素酶量低且多为胞内酶，因此很少用来生产纤 维素酶，而且，细菌中除芽孢杆菌外其它的种类由于保存期限的问题以及相关胞外酶的诱 导表达量比较低，在实际应用中受到限制。涉及纤维素降解的真菌很多，在环境中的中温型 纤维素降解菌中大多数是真菌，但是很多都是植物病原菌且传染性强，很难将其开发为秸 杆降解剂，这就导致细菌和真菌在纤维素降解的进一步应用研究中比较困难。
[0005] 原核生物放线菌比真菌更具有抗逆性，在高温阶段木质素和纤维素的分解过程 中，放线菌起着重要的作用，并且放线菌产纤维素酶活性较高，结构简单，便于基因改造和 遗传分析，但是，放线菌繁殖慢且产酶能力没有真菌强。因此，将放射菌应用于秸杆腐熟技 术上，最关键的问题是高效接种菌剂的筛选，从而促进秸杆腐熟的过程，提高秸杆腐熟的效 率。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种新型链霉菌，属放射菌目一科，以解决现有技术中秸杆腐熟过程 缓慢、效率不高，而现有秸杆腐熟剂应用受限等问题。
[0007] 本发明提供一种链霉菌菌株，所述链霉菌菌株（5/7.)的名称为纤维 素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为CGMCC NO. 10359。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1。
[0008] 该菌株呈现典型的放线菌菌落形态，菌落为密毡状，产生灰色的孢子，基内菌丝为 白色。
[0009] 2.上述1提供的链霉囷囷株在結杆腐熟中的应用。
[0010] 3.本发明还提供一种秸杆腐熟剂，该秸杆腐熟剂包括上述1提供的链霉菌孢子。
[0011] 4.上述3提供的結杆腐熟剂，其中，腐熟剂成品中链霉囷抱子总浓度为 2 X 109CFU/mL。
[0012] 5.本发明还提供一种秸杆腐熟效果测试方法，该方法将秸杆的一端固定，另一端 连接弹簧秤，用力拉弹簧秤并记录秸杆断裂时的重量即拉力；同一时期秸杆的拉力越小，即 越易被拉断，说明秸杆腐熟程度越高。
[0013] 有益效果： 1.本研究从不同样本中分离、筛选到高效降解秸杆纤维素的优势链霉菌菌种，经过 48h后就能在秸杆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子。说明本发明提供的链霉菌 活力高，适应性强，可广泛用于秸杆的腐化处理过程中。再通过水稻秸杆的好氧堆肥中试研 究，为秸杆的综合利用提供理论参考，开发出能够应用于农业生产的微生物秸杆腐熟菌剂。
[0014] 2.通过筛选获得的纤维素分解菌F1，经过驯化成高效稳定的菌株并制成秸杆腐 熟剂，经过试验，接种分解菌Fl的秸杆10天便开始变软、腐烂，此时分解率便已经超过20%， 经过25天，秸杆已经完全降解，说明制成的秸杆腐熟剂缩短了堆肥发酵周期，提高腐解速 率。应用于秸杆腐解、还田过程，既可以增加土壤中的有机质含量，培肥地力，改善土壤结 构，有利于实现农业的可持续发展，同时减少了化肥和农药的使用量，降低了农业面源污 染，提高作物产量及品质，又减少了因秸杆焚烧引起的空气污染等环境问题。
[0015] 3.本发明创造性地提出以秸杆剪切拉力作为秸杆腐熟效果测定的一个指标，方法 简单易测，适合于农业生产应用，值得推广。
[0016]
【附图说明】
[0017]图1本发明提供的纤维素分解菌Fl的菌落形态 图2菌株Fl在CMC-Na刚果红平板上的透明圈 图3菌株对滤纸的崩解情况 图4培养时间对Fl的酶活性影响 图5 IOd后不同菌株对水稻結杆的降解率 图6纤维素降解菌对水稻秸杆堆肥效果的研究
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
[0019] 本研究采用以下4种指标作为堆肥的评价标准，即秸杆颜色、秸杆剪切拉力。
[0020] ①颜色：颜色可以用来判断堆肥腐熟的指标。一般认为秸杆颜色达到深褐色或灰 黑色为宜，并有光泽。
[0021] ②秸杆剪切拉力：是最近新提出的测定秸杆腐熟的方法，以前很少有学者用这个 指标作为评价标准，所以该方法的使用增加了本文的创新性。秸杆剪切拉力即秸杆拉力，为 秸杆最大承受力，测定方法是将秸杆的一端固定，另一端连接弹簧秤，用力拉弹簧秤并记录 秸杆断裂时的重量。同一时期秸杆的拉力越小，即越易被拉断，说明秸杆腐熟程度越高。
[0022] 实施例1 纤维素分解菌Fl的筛选与鉴定 以下试验用培养基在制备过程中均在121°C灭菌20 min。
[0023] 1)从不同地域收集的腐败树枝和秸杆样品，以蒸馏水浸泡水稻秸杆、枯枝败叶，过 夜，去除可溶性有机物，冲洗数次，烘干待用。将水稻秸杆、枯枝败叶剪成2cm左右样品，作 为接下来富集培养基的唯一碳源。
[0024] 配制富集培养基【赫奇逊（Hutchinson)秸杆培养基】:磷酸二氢钾（KH 2PO4) I. 0 g， 氯化钠（NaCl )0.1 g，氯化铁（FeCl3.640)0. 01 g，硫酸镁（MgSO4.740)0. 3 g，硝酸钠 (NaNO3) 2. 5 g，氯化钙（CaCl2 ? 6H20) 0? I g，蒸馏水 1000 mL。
[0025] 称取2cm左右样品10 g，转移至装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，180 rpm 摇床振荡20 min,静置，用移液器吸取I mL悬液转移至装有富集培养基的三角瓶中，放于 55°C水浴锅中振荡培养，待秸杆松散变软后，转接到新鲜的上述培养基中，接种量为质量分 数5%，如此转接数代，淘汰不能在培养基中生长的菌群，即没有分解纤维素能力的菌群。
[0026] 2)配制分离培养基（CMC-Na刚果固体红培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC-Na) 10. 0 g，硝酸钾（KNO3) 1.0 g，磷酸氢二钾（K2HPO4) 0.5 g，硫酸镁(MgSO4 *740)0. 5 g，氯化钠 (NaCl)L 5 g，刚果红 0.2 g，琼脂 13 g，蒸馈水 1000 mL。
[0027] 将上述转接数代后的培养基采用稀释涂布平板法在CMC-Na刚果红固体培养基上 分离，置于55°C恒温培养箱中培养获得单菌落，通过目测，选择菌落较大(较大是一个相对 概念，比较范围是整个培养基中生长的菌落)、透明圈较大的菌落(如图2所示)，以此为标准 选择在以纤维素为唯一碳源的条件下生长较好的菌株，从而得到分解纤维素能力较强的菌 株。在CMC-Na刚果红固体培养基上反复划线纯化。在CMC-Na平板用0. 02%的刚果红溶液 染色20 min，然后用I mol/L的NaCl脱色20 min，观察并记录透明圈的直径（D，cm)和菌落 直径（d，cm)，计算其比值H，即H=D/d。由于H值越大，表示该菌株分解纤维素的能力越强， 因此，选择H值大的透明圈所对应的菌株F1。按照刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小 即通过纤维素酶定性实验初步确定其产纤维素酶活性。
[0028] 采用伯杰氏细菌手册上的方法，测定分离菌株的生化特性，结果如表1 表1菌株Fl的生理生化特性
【主权项】
1. 一种链霉菌菌株，其特征在于：所述链霉菌菌株（5/7.)的名称为纤维 素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为CGMCC NO. 10359。
2. 权利要求1所述的链霉菌菌株在秸杆腐熟中的应用。
3. -种秸杆腐熟剂，其特征在于：该秸杆腐熟剂包括权利要求1所述的链霉菌孢子。
4. 权利要求3所述的秸杆腐熟剂，其特征在于：腐熟剂成品中链霉菌孢子总浓度为 2X109CFU/mL。
5. -种秸杆腐熟效果测试方法，其特征在于：将秸杆的一端固定，另一端连接弹簧秤， 用力拉弹簧秤并记录秸杆断裂时的重量即拉力；同一时期秸杆的拉力越小，即越易被拉断， 说明秸杆腐熟程度越高。
【专利摘要】本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力的链霉菌菌株及其在秸秆腐熟方面的应用。该链霉菌菌株（Streptomyces sp.）名称为纤维素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10359。本发明提供的链霉菌菌种，经过48h后就能在秸秆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于秸秆的腐化处理过程中。以该菌株孢子制成的秸秆腐熟剂，经过试验，秸秆10天便开始变软、腐烂，此时分解率已超过20%，经过25天，秸秆已经完全降解，说明制成的秸秆腐熟剂缩短了堆肥发酵周期，提高腐解速率。CGMCC No.1035920150114
【IPC分类】C12N1-20, C05F17-00, C12R1-465, G01N3-08
【公开号】CN104611270
【申请号】CN201510062311
【发明人】卢志亮, 戴文莉, 刘晓华, 刘路路
【申请人】连云港恒奥达肥料科技有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月6日