一株苹果醋杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于果醋酿造技术领域，具体涉及一株苹果醋杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 柑桔果醋是以新鲜、成熟的柑桔类水果为原料，经酒精发酵和醋酸发酵工艺生产 而成的一种营养丰富、风味优良的酸味饮料。其含有丰富的有机酸和维生素，具有消暑解 渴、消除疲劳、美容养颜、增进食欲、解酒保肝、防腐杀菌等保健功效，适用于多种疾病的食 疗，尤其对高血压、冠心病、动脉硬化等心血管疾病具有良好的治疗和预防作用，是新一代 发酵食品。优良的醋酸菌菌种是影响柑桔果醋品质的重要因素之一，其性能的优劣会对发 酵效率、产品中活性因子的含量起着决定性的作用。然而当前，我国果醋生产中，纯种培养 的醋酸发酵菌种不多，常用的仅有两株：食醋菌种ASL 41恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿 1. 01醋酸杆菌。据研究表明，醋酸菌ASL 41并不适合液体深层培养，若将其应用于果醋生 产方面，不仅产酸能力不理想，耐酒精能力也都有待提高。至于沪酿1. 01醋酸杆菌，虽然其 产酸速度快，酒精转酸率平均可达93. 84%，但它的特异性不强，而且发酵果醋形成的风味也 不佳。因此，寻找有利于果醋生产的专用醋酸菌菌株成为当前研究的热点。
[0003] 同时，柑桔中含有柠碱、柚皮苷和柠檬苦素类似物等致苦物质，在利用柑桔加工成 果醋的过程中，这些苦味物质会从果实中溶出，使其酿制的果醋因其苦味问题难以被广泛 接受。目前采取的措施主要是吸附脱苦、添加苦味抑制剂和超临界流体萃取脱苦等，虽取得 了一些效果，但工业化生产存在较大负面影响。
【发明内容】
[0004] 为了解决【背景技术】中提到的技术问题，本发明的目的在于提供一种苹果醋杆菌及 其应用的技术方案。
[0005] 本发明中的菌株苹果醋杆菌ZY. C4,保藏单位：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日：2014年01月07日，保藏号：CGMCC NO ：8692〇
[0006] 本菌株从自然发酵的桔子果醋醋液中分离获得，根据该菌的细胞形态、生理生化 特征、16S rRNA基因序列、Hsp60基因序列和tuf基因序列等结果，经由中国科学院微生物 研究所鉴定为苹果醋杆菌（
[0007] 该菌株生长于平板培养基上的菌落单个或成对排列，白色不透明，呈圆形，表面光 滑，边缘整齐，为凸起状，周围有明显的碳酸钙透明圈；菌体呈杆状或短杆状，革兰氏阳性， 无鞭毛，极端严格好氧，可将乙醇氧化成乙酸，不产生肠毒素，安全无毒。
[0008] 苹果醋杆菌ZY. C4在发酵生产果醋上的应用。
[0009] 苹果醋杆菌ZY. C4在生产柑桔果醋上的应用。
[0010] 所述的苹果醋杆菌ZY. C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于包括以下工艺步骤： 1) 制备柑桔果酒； 2) 制备苹果醋杆菌ZY. C4的种子液； 3) 将步骤2)的种子液接种到柑桔果酒中发酵，陈酿，得到柑桔果醋。
[0011] 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY. C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步 骤1)中柑桔果酒的制备步骤如下： A :制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，浙干备用；按水：糯米=2 :1的比例磨浆，用醋酸 和碳酸钠调pH至6. 2-6. 4,加入1% (重量）的液化酶，加热至90-95°C液化30min，降温至 60°C后，调pH至4. 5-5. 0,再添加1% (重量）的糖化酶，60°C糖化6-8h，得到糯米糖化液； B :制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与0. 01% (重量)的NaHSO3溶液按1 :1的体积比加 入打浆机，打浆后加入0. 04% (重量）的果胶酶于60°C酶解60min，酶解后过滤，收集滤液， 得到柑桔汁； C :将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2 :1的比例将两者混合，调整 糖度至11 %，并置于85°C热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液； D :酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达IO8个/mL的酿酒酵母按接种量为10%(体积） 接种于柑桔糯米混合液中，28°C搅拌培养16h后，28°C密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，灭 菌，得到柑桔果酒。
[0012] 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY. C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤 2)中种子液的制备方法为：先将冷冻保藏的苹果醋杆菌ZY. C4菌株接种于斜面活化培养基 上，30-32°C静止培养48h，然后挑取2-3环菌苔移入液体培养基，置于摇床，30-32°C，120r/ min培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达IO 7个/mL，按5% (体积）的接入量接入柑 桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述斜面活化斜面培养基的重量百分配比为：酵母粉 1%，葡萄糖1%，CaCO 3L 5%，琼脂2%，pH5. 5,分装试管，加入95%无水乙醇4% (体积百分比） ;所述液体培养基的重量百分配比为：酵母粉1%，葡萄糖1%，PH5. 5。
[0013] 所述的苹果醋杆菌ZY. C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤3)中发酵 条件为：取苹果醋杆菌ZY. C4种子液，按10% (体积）的接入量接种到权利要求5所述的柑 桔果酒中，在31-32°C、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。
[0014] 8.如权利要求5所述的一种利用如权利要求1所述的苹果醋杆菌ZY. C4生产 柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤D中，在搅拌培养前还加入柚苷酶，柚苷酶的加入 量为每IOOml柑桔糯米混合液中加入0. 04g。
[0015] 一种柑桔果醋，其特征在于其制备方法为： 1)制备柑桔果酒；包括如下步骤:A :制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，浙干备用；按 水：糯米=2 :1的比例磨楽,用冰醋酸和碳酸钠调pH至6. 2-6. 4,加入1% (重量)的液化酶， 加热至90-95°C液化30min，降温至60°C后，调pH至4. 5-5. 0,再添加1% (重量）的糖化酶， 60°C糖化6-8h，得到糯米糖化液； B :制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与含0. 01% (重量）NaHSO3的水溶液按1 :1的比例 加入打浆机，打浆后加入〇. 04% (重量)的果胶酶于60°C酶解60min，酶解后过滤，收集滤液， 得到柑桔汁； C :将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2 :1的比例将两者混合，调整 糖度至11 %，并置于85°C热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液； D :酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达IO8个/mL的酿酒酵母按接种量为10%(体积） 接种于柑桔糯米混合液中，加入柚苷酶，28°C振荡培养16h后，28°C密闭静置培养4d，过滤， 收集滤液，灭菌，得到柑桔果酒；所述柚苷酶的加入量为每IOOml柑桔糯米混合液中加入柚 苷酶〇.〇4g; 2) 制备苹果醋杆菌ZY. C4的种子液；挑取苹果醋杆菌ZY. C4菌苔，活化后置于液体培 养基，在30-32°C，120r/min条件下摇床培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达IO 7个 /mL，按5% (体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述液体培养基的 配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，PH5. 5; 3) 取苹果醋杆菌ZY. C4种子液，按10%(体积)的接入量接种到柑桔果酒中，在31~32°C、 搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。
[0016] 所述的苹果醋杆菌ZY. C4,其特征在于其分离纯化步骤如下： 1) 菌源制备：选择无烂果的柑桔，洗净，打浆，先进行自然酒精发酵；并每天用糖度计 测定其糖度，当糖度降至5° BX，并连续一个星期不再变化，开始过滤；收集滤液，32°C下进 行自然醋酸发酵，5d后从醋液中取菌源； 2) 增殖培养：取自然醋酸的发酵醋液10mL，放入90mL的增殖培养基中，并于恒温摇床 32°C，120r/min条件下培养2d ;所述增殖培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，0. 02%的结 晶紫0? 5%，制霉素2. 5 X IO6单位/L，pH5. 5,灭菌冷却至50-60°C后加入3% (体积）的95% 无水乙醇。
[0017] 3)钙平板分离：梯度稀释增殖培养液，用于涂布分离，涂布到分离培养基上，于 32°C的恒温箱中培养2d，挑选钙溶解圈大的，将不同菌落形态的单个菌落移入斜面培养基 中，重复3-4次，得到纯化菌株；所述分离培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO 3L 5%， 琼脂2%，pH5. 5,灭菌冷却至50-60°C后加入4% (体积）的95%无水乙醇和已干热灭菌的 CaCO3^jf述斜面培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO 31. 5%，琼脂2%，pH5. 5,灭菌后分 装试管，冷却至50-60°C后加入4% (体积）的95%无水乙醇。
[0018] 4)复筛：将钙平板分离的菌株挑取两环，移入20mL加有6%的无水乙醇的液体基 础培养基中，于恒温摇床32°C，120r/min培养7d，进行醋酸定量测定，根据酸度测定结果 筛选出产酸量高的菌株，经鉴定为苹果醋杆菌ZY. C4 ;所述液体基础培养基配方为：酵母粉 1%，葡萄糖 1%，pH5. 5。
[0019] 与常用果醋菌种沪酿I. 01相比，苹果醋杆菌ZY. C4产酸速度快，产酯量高，其产酸 量和产酯量分别为65. 3g/L和0. 951g/L，均极显著的高于对照菌株沪酿I. 01的44. 65g/L 和0. 546g/L ;而且该菌株具有较好的耐温性能和耐酒精能力，且传代5次后性能稳定，醋酸 分解速度小；此外，该菌株可产生柠檬苦素降解酶，使柑桔果汁中存在的柠檬苦素分解，从 而实现柑桔果醋脱除苦味。利用该菌株酿制的柑桔果醋酸味柔和、果香浓郁、无苦味，营养 丰富、口感佳。
【附图说明】
[0020] 图1为苹果醋杆菌ZY. C4和沪酿I. 01的产酸曲线图； 图2为苹果醋杆菌ZY. C4和沪酿I. 01耐酒精能力比较图； 图3为苹果醋杆菌ZY. C4和沪酿I. 01的耐温能力比较图； 图4为苹果醋杆菌ZY. C4和沪酿I. Ol的产酯曲线。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作更详尽的说明。
[0022] 下述实施例中，沪酿I. 01