专利名称：Fr-008聚酮抗生素生物合成相关的基因簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种聚酮抗生素及其生物合成基因，特别是一种链霉菌FR-008 中多烯聚酮合酶基因簇，属于生物技术基因领域。
背景技术：
抗生素是由微生物、植物和动物等产生的，能够在很低浓度下就可以杀死或抑 制其它生物生长的次级代谢产物。如微生物所产生的青霉素、作为抗癌药物的紫杉醇 (taxol)等。抗生素通过干扰靶细胞的一个或多个生理代谢过程而发挥作用。聚酮是一类 自然产物，很多聚酮类抗生素已应用于医用，兽用及农用，包括红霉素(抗菌)，制霉菌 素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)，纳巴霉素(免疫抑制剂)和道诺红菌素(抗肿瘤)。 革兰氏阳性菌链霉菌是聚酮抗生素的主要产生菌。聚酮的合成与脂肪酸的合成类似，都 是经由聚酮合酶介导的简单羧酸单位的缩合过程，而且与聚酮抗生素合成相关的合成基 因，调节基因及抗性基因在细菌基因组中往往紧密连锁，成簇排列。负责红霉素大环内 酯形成的DEBS聚酮合酶是第一例被发现具有模块结构。随着越来越多大环内酯聚酮的 分离与鉴定，它的模块化核心概念始终没有发生改变。I型聚酮合酶的模块结构包括重复 的酮基合成酶结构域(KS)，酰基转移酶结构域(AT)，酰基载体蛋白结构域(ACP)(也可 能包含酮基还原酶结构域(KR)，脱氢酶结构域(DH)，烯酰还原酶结构域(ER))，每个 模块负责聚酮链延伸的一次反应，它们决定着加入的延伸单位的还原步骤。此外，还需 要硫酯酶(TE)结构域的作用催化聚酮链的环化与释放。最后，还要经过糖基化、羟基 化、甲基化和酰基化等修饰步骤。例如免疫抑制剂FK506通过抑制T细胞激活与生长所 需的信号传导途径来阻碍免疫应答。FK506被用来防止移植排拒反应。并被用于某些自 动免疫疾病的治疗。在结构上，FK506也是一个大环内酯，可由一些链霉菌产生。聚酮生物合成PKS的模块结构组成具有一定的可塑性，使得人们能够通过改变 模块的数目、延伸模块的特异性或结构域的插入或失活等基因工程操作获得新的聚酮衍 生物。天然大环内酯抗生素多样性的一个重要资源是中心配基特定位点上所结合的糖 基。这些糖基组分被发现几乎均与抗生素和其细胞内作用对象之间分子识别有关。许 多天然存在的生物活性代谢物携带有不寻常的糖基，作为生物活性分子识别的要素。近 来，对于糖苷转移酶及其它糖基合成基因的深入了解越来越多地被用来产生新型糖基杂 合的抗生素。糖苷转移酶对底物的一定适应性使糖苷转移酶成为组合生物合成的引人注 目的工具。氨基海藻糖基团存在于很多大环内酯抗生素分子中，大部分多烯抗生素分子携带这种特殊的氨基海藻糖基团。预测的氨基海藻糖合成途径包括来自主代谢中的 GDP-甘露糖在GDP-甘露糖脱水酶的作用下转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖， 然后异构化为GDP-3-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，最后通过GDP-酮糖转氨酶的转氨作用 形成GDP-氨基海藻糖。其中异构化可能并不需要酶的参与。天然抗生素的另一个重要特点是已合成好的中心配基特定位点上可经过氧化酶 的后修饰而获得很大范围的结构特征。这些氧化酶介导的后修饰包括羧基化，羟基化， 环氧化等。大多数情况下这些后修饰步骤导致产生药效团特性。因而这些后修饰氧化 酶基因具有很大的化学和药理学重要性。在组合生物合成中，这些后修饰的氧化酶基因 扮演着重要的角色。考虑到聚酮化合物后修饰蛋白在生物活性及结构多样性方面的重要 作用，更加广泛的后修饰氧化酶基因可以得到应用并扩大可应用后修饰酶的工具箱。近 来，对于后修饰氧化酶基因的深入了解越来越多地被用来产生新型的杂合的抗生素。后 修饰氧化酶基因对底物的一定适应性也使其成为组合生物合成的引人注目的工具。聚酮细胞色素P450单氧化酶催化前体聚酮位点特异性氧化而得到最终的大环内 酯抗生素，包括红霉素，泰乐菌素，竹桃霉素，阿维菌素等。这些聚酮细胞色素P450单 氧化酶的作用底物以及在相同底物的作用位点都有很大的不同。底物结构的微小变化就 会给这些氧化酶作用活性造成很大影响。另一方面，一直以来，提高产量是抗生素工业生产致力于解决的优先问题。然 而，传统的通过改善发酵条件，或通过化学诱变筛选产量提高的抗生素产生菌越来越受 到限制，并且很容易达到饱和。随着生物技术的发展特别是基因工程的飞速发展，提供 了通过改造抗生素产生菌中相关基因而大幅度提高抗生素产量的途径。这其中增加正调 节基因拷贝数或打断负调节基因是最重要的途径之一。多烯大环内酯是一类在大环内酯中包含3-8个连续双键的聚酮化合物。多烯抗 生素通过与真核细胞膜的固醇相互作用形成通道而引起小分子的丢失而导致细胞死亡。多烯大环内酯类抗生素两性霉素B是结核链霉菌产生的一种在医药上具有重要 用途的抗真菌抗生素。两性霉素B对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的 亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。然而它也会与哺乳动物细胞膜中的胆固醇 发生作用而具有毒性，尤其是肾毒性。尽管如此，两性霉素B仍然是人类严重系统性真 菌感染最重要的抗生素。两性霉素B还可使培养细胞免受艾滋病毒(HIV)的感染。多 烯大环内酯类抗生素制霉菌素也是人类真菌感染重要的医用抗生素。杀念菌素D是由灰 色链霉菌IMRU3570产生的一种芳香七烯大环内酯抗生素。它对念珠菌有很强的抑制活 性。
发明内容
本发明根据背景技术中存在的不足和需要解决的技术问题，提供一种FR-008聚 酮抗生素生物合成相关的基因簇，其产生的一种多烯聚酮抗生素FR-008具有抗真菌活性 和对蚊子幼虫的高毒性，而且可以防止前列腺肿大以及可以防止阴道滴虫感染和念珠菌 阴道炎。本发明提供一种链霉菌FR-008中多烯聚酮FR-008生物合成基因簇，即包含 fscA, fscB, fscC, fscD, fscE, fscF, fscTI, fscTII, fscRI, fscRII, fscRIII, fscRIV,fscP, fscFE, fscTE, fscMI, fscMII, fscMIII, fscO, pabAB, pabC 这一系列共 21 个基
因及其DNA序列，即序列1，并提供了这些基因及其DNA序列所编码FR-008生物合成 酶的氨基酸序列，即序列2-22 ；包括包含序列1中碱基20,927-26,158的基因fscA，包含 序列1中碱基60,860-28,983的基因fscC，包含序列1中碱基77,587-60,962的基因fscB， 包含序列1中碱基84,132-77,983的基因fscF，包含序列1中碱基107,485-84,170的基因 fscE，包含序列1中碱基136,148-107,496的基因fscD的核苷酸序列，编码了聚酮合酶； 包括包含序列1中碱基26,333-27,340的基因fscTI，包含序列1中碱基27,561-28,280的 基因fscTII，包含序列1中碱基3,818-3,150的基因fscRI,包含序列1中碱基7,205-4,377 的基因fscRII，包含序列1中碱基10,320-7,210的基因fscRIII，包含序列1中碱基 13,315-10,298的基因fscRIV,包含序列1中碱基16,106-17,287的基因fscP,包含序列1中 碱基17,334-17,528的基因fscFE，包含序列1中碱基17,556-18,413的基因fscTE，包含序 列1中碱基13,522-14,898的基因fscMI，包含序列1中碱基14,953-16,011的基因fscMII， 包含序歹Ij 1中碱基137,766-136,558的基因fscMIII，包含序列1中碱基1,950-574的基因 fscO，包含序歹Ij 1中碱基18,610-20,781的基因pabAB,包含序列1中碱基3,037-2,264的 基因pabC的核苷酸序列，编码了 ABC转运蛋白，调节蛋白，细胞色素P450单氧化酶， 铁氧化还原蛋白，II型硫脂酶，糖基合成酶，糖苷转移酶，依赖FAD的单氧化酶，对氨 基苯甲酸合成酶。共有负责FR-008生物合成的6个聚酮合酶基因，4个调节基因，2个 转运基因，2个对氨基苯甲酸合成基因，2个糖基合成酶，1个糖苷转移酶基因和4个修饰 基因获得确认，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列。本发明是根据如下技术方案实现的，本发明提供了一种来自于链霉菌FR-008中 编码了聚酮合酶，ABC转运蛋白，调节蛋白，细胞色素P450单氧化酶，铁氧化还原蛋 白，II型硫脂酶，糖基合成酶，糖苷转移酶，依赖FAD的单氧化酶，对氨基苯甲酸合成 酶的抗生素FR-008基因簇，并提供了这些核苷酸序列所编码FR-008生物合成酶的氨基 酸序列，也就是说这些酶由序列2-22提供的氨基酸序列来定义，这些核苷酸序列是分别 选自于序歹Ij 1 中包括 fscA(20,927-26,158)，fscC(60,860-28,983)，fscB(77,587-60,962)， fscF (84,132-77,983)，fscE (107,485-84,1 70)，fscD (1 36,148-107,496)， fscTI (26,333-27,340)，fscTII (27,561-28,280)，fscRI (3,818-3,150)， fscRII (7,205-4,377)，fscRIII (10,320-7,2 10)，fscRIV (1 3,3 1 5-10,298)， fscP (16,106-17,287)，fscFE (1 7,334-1 7,528)，fscTE (1 7,556-1 8,4 1 3)， fscMI(13,522-14,898)，fscMII (14,953-16,011)，fscMIII (137,766-136,558)， fscO(1,950-574), pabAB(18,610-20,781), pabC(3,037-2,264)的一系列基因序列。包括包含序列1中碱基20,927-26,158的基因fscA，包含序列1中碱基 60,860-28,983的基因fscC，包含序列1中碱基77,587-60,962的基因fscB，包含序列1中 碱基84,132-77,983的基因fscF，包含序列1中碱基107,485-84,170的基因fscE，包含序 列1中碱基136,148-107,496的基因fscD的聚酮合酶基因编码了包含有聚酮合酶模块的酮 基合成酶结构域即KS结构域，酰基转移酶结构域即AT结构域，酰基载体蛋白结构域即 ACP结构域，也可能包含酮基还原酶结构域即KR结构域，脱氢酶结构域即DH结构域， 烯酰还原酶结构域即ER结构域的聚酮合酶。由序列2-22定义的FR-008生物合成酶对应于FR-008生物合成的每一个合成步
5骤和后修饰过程以及调节，转运，矫正过程。本发明还提供了编码包括ATP依赖性羧酸辅酶A连接酶(CoL)，ACPL, KSl, ATI, ACPl的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域 分别通过序列 2 中氨基酸 51-465，581-647，661-1,094，1,202-1,509，1,596-1,662 来描 述，命名为fscA基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括20,927-26,158的一系列碱基。本发明还提供了编码包括KS10，AT10, DH10, KRlO, ACP10, KS9，AT9， DH9, KR9, ACP9, KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS7, AT7, DH7, KR7, ACP7, KS6, AT6, DH6, KR6, ACP6, KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5 的 FR-008 聚酮合酶 结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列3中氨基酸8,808-9,221 ； 9,330-9,627 ； 9,680-9,867 ； 10,183-10,366 ； 10,469-10,536 ； 6,966-7,383 ； 7,490-7,792 ； 7,845-8,029 ； 8,331-8,514 ； 8,618-8,685 ； 5,253-5,675 ； 5,775-6,074 ； 6,127-6,310 ； 6,590-6,773 ； 6,874-6,941 ； 3,529-3,954 ； 4,059-4,356 ； 4,407-4,595 ； 4,884-5,063 ； 5,163-5,230 ； 1,787-2,212 ； 2,318-2,617 ； 2,670-2,859 ； 3,155-3,338 ； 3,438-3,505 ； 34-460 ； 576-875 ； 928-1,112 ； 1,417-1,596 ； 1,696-1,763 来描述，命名为 fscC 基因的核 苷酸序列选自于序列1中的包括60,860-28,983的一系列碱基。本发明还提供了编码包括KS4，AT4，DH4, KR4，ACP4, KS3，AT3，DH3, ER3，KR3，ACP3, KS2，AT2，KR2，ACP2 的 FR-008 聚酮合酶结构域的 DNA 分
子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列4中氨基酸3,703-4,103 ； 4,247-4,550 ； 4,600-4,722 ； 5,103-5,286 ； 5,389-5,456 ； 1,597-2,023 ； 2,139-2,442 ； 2,494-2,684 ； 2,970-3,322 ； 3,325-3,508 ； 3,610—3,677 ； 33-460 ； 571-874 ； 1,224-1,406 ； 1,508-1,574 来描述，命名为fscB基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括77,587-60,962的一系列碱基。本发明还提供了编码包括KS21，AT21，DH21, KR21，ACP21, TE21 的 FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列5中氨基酸 33-456 ； 545-851 ； 903-1,083; 1,378-1,561; 1,668-1,735; 1,814-2,018 来描述，命名为 fscF基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括84,132-77,983的一系列碱基。本发明还提供了编码包括KS20，AT20, DH20, ER20, KR20, ACP20, KS19, AT19, KR19, ACP19, KS18, AT18, DH18, ERl8, KRl8, ACP18, KS17, AT17，DH17, ERl7, KRl7, ACP17的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸 序列，这些结构域分别通过序列6中氨基酸5,642-6,069 ； 6,158-6,463 ； 6,515-6,693 ； 7,017-7,322 ； 7,330-7,512 ； 7,615-7,682 ； 4,117-4,544 ； 4,633-4,936 ； 5,263-5,445 ； 5,552-5,619 ； 2,071-2,498 ； 2,590-2,896 ； 2,948-3,127 ； 3,428-3,733 ； 3,741-3,924 ； 4,025-4,092 ； 34-460 ； 548-850 ； 902-1,081 ； 1,384-1,689 ； 1,697-1,880 ； 1,982-2,049 来 描述，命名为fscE基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括107,485-84,170的一系列碱 基。本发明还提供了编码包括KS16，AT16，KRl6, ACP16, KS15，AT15， KRl5, ACP15, KS14, AT14, KR14, ACP14, KS13, AT13, KRl3, ACP13, KS12, AT12, KRl2, ACP12, KS11, ATI 1, DHl 1, KRl 1, ACPll 的 FR-008 聚酮合酶结
构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列7中氨基酸7,935-8,352 ；8,464-8,767 ； 9,099-9,280 ； 9,387-9,452 ； 6,425-6,845 ； 6,935-7,241 ； 7,559-7,725 ； 7,838-7,898 ； 4,872-5,297 ； 5,408-5,720 ； 6,049-6,225 ； 6,331-6,398 ； 3,342-3,765 ； 3,872-4,170 ； 4,499-4,676 ； 4,782-4,849 ； 1,788-2,209 ； 2,313-2,621 ； 2,972-3,150 ； 3,254-3,314 ； 38-452; 563-864; 921-1,105; 1,410-1,592; 1,694-1,760 来描述，命名为 fscD基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括136,148-107,496的一系列碱基。本发明还提供了编码2个ABC转运蛋白的基因的核苷酸序列，这两个ABC转运 蛋白分别由序列8和序列9的氨基酸序列组成，命名为fscTI，fscTII基因的核苷酸序列选 自于序列1中包括26,333-27,340，27,561-28,280的一系列碱基。本发明还提供了编码4个调节蛋白的基因的核苷酸序列，这4个调节蛋白分别由 序列10，11，12，13的氨基酸序列组成，命名为fscRI，fscRII, fscRIII, fscRIV基因的 核苷酸序列选自于序列 1 中包括 3,818-3,150，7,205-4,377，10,320-7,210，13,315-10,298 的一系列碱基。本发明还提供了编码一个细胞色素P450单氧化酶的基因的核苷酸序列，这个细 胞色素P450单氧化酶由序列14的氨基酸序列组成，命名为fscP基因的核苷酸序列选自于 序列1中包括16,106-17,287的一系列碱基。本发明还提供了编码一个铁氧化还原蛋白的基因的核苷酸序列，这个铁氧化还 原蛋白由序列15的氨基酸序列组成，命名为fscFE基因的核苷酸序列选自于序列1中包 括17,334-17,528的一系列碱基。本发明还提供了编码一个II型硫脂酶的基因的核苷酸序列，这个II型硫脂酶 由序列16的氨基酸序列组成，命名为fscTE基因的核苷酸序列选自于序列1中包括 17,556-18,413的一系列碱基。本发明还提供了编码2个糖基合成酶和1个糖苷转移酶的基因的核苷酸序列，糖 苷转移酶由序列17的氨基酸序列组成，2个糖基合成酶(GDP-酮糖转氨酶和GDP-甘露 糖脱水酶)分别由序列18和序列19的氨基酸序列组成，命名为fscMI，fscMII，fscMIII 基因的核苷酸序列选自于序列1中包括13,522-14,898，14,953-16,011，137,766-136,558 的一系列碱基。本发明还提供了编码一个依赖FAD的单氧化酶的基因的核苷酸序列，这个依赖 FAD的单氧化酶蛋白由序列20的氨基酸序列组成，命名为fscO基因的核苷酸序列选自于 序列1中包括1,950-574的一系列碱基。本发明还提供了编码2个对氨基苯甲酸合成酶的基因的核苷酸序列，这两个对 氨基苯甲酸合成酶分别由序列21和22的氨基酸序列组成，命名为pabAB和pabC基因的 核苷酸序列选自于序列1中包括18,610-20,781，3,037-2,264的一系列碱基。本发明还提供了从至少携带有部分序列1重组载体中，或从微生物文库中，或 从微生物染色体DNA中分离FR-008生物合成基因的途径。本发明还提供了以至少来自于序列1聚酮合酶序列中的一个片段与来自于其它 聚酮合酶基因簇的聚酮序列来构建重组载体以获得新型聚酮的途径。本发明还提供了在基因工程微生物体中提高FR-008或其衍生抗生素产量的途径。本发明还提供了简化FR-008的有效组分的途径。
本发明还提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体的途径。本发明还提供了产生被至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体转化进 入的宿主细胞的途径，此宿主细胞所产生的聚酮为FR-008或FR-008的结构类似物。本发明还提供了产生被至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体转化进 入的宿主细胞的途径，此宿主细胞所产生的FR-008或FR-008的结构类似物产量得到提 高或所产生的抗生素或某种代谢产物产量得到提高。本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成基因被打断，缺失或加倍的 微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成基因被改造的微生物体的途径。本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成酶中聚酮合酶结构域之一或 至少其中之一被缺失或加倍或改造的微生物体的途径。序列1的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列 或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的酶切相应的DNA或使用其 它合适的技术随时得到。包含发明所提供序列或多个序列的DNA片段或基因可随时得 到。通过本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR) 的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法，从其它生物体得到 与FR-008生物合成基因相似的基因。本发明提供的核苷酸片段可用来从链霉菌FR-008或其它菌种中分离具生物活性 的结构域。例如，聚酮合酶结构域和修饰基因的生物活性位点可以通过聚合酶链式反应 (PCR)，酶切位点或其它合适的技术得到。本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相 应的DNA分子。包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过 打断FR-008生物合成的一个或几个合成步骤而得到新的FR-008衍生物。包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过 打断FR-008生物合成的一个或几个修饰步骤而得到新的FR-008衍生物。包含DNA片段或基因可以用来提高FR-008或其衍生物的产量。例如，转入更 多拷贝的正调节基因或打断负调节基因。包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来从链霉菌 FR-008基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含有本发明中的部分序 列，也包含有链霉菌FR-008基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚 合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，或 通过紫外线或化学试剂。本发明所提供的核苷酸序列可以通过序列的不同部分或其它来源的同源序列进 行直接进化(DNA shuffling)。通过缺失或失活来自于相同或不同聚酮合酶系统的一个或多个聚酮合酶结构 域，模块或基因，或增加一个或多个聚酮合酶结构域，模块或基因而产生新的聚酮化合物。包含本发明的序列或至少部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主 中表达以得到修饰的聚酮合酶或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括链霉 菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物等。包含本发明的核苷酸序列或至少部分序列的片段或结构域或模块或聚酮合酶基 因可以用来构建聚酮合酶库或聚酮合酶衍生库或组合库。包含本发明的核苷酸序列或至少部分序列的修饰基因，调节基因，转运基因或 糖基合成和转移酶基因可以用来构建衍生库或组合库。FR-008生物合成修饰基因，调节基因，转运基因或糖基合成和转移酶基因的核 苷酸序列提供了通过缺失或改造这些修饰基因，调节基因，转运基因或糖基合成和转移 酶基因而得到FR-008结构衍生物或FR-008及其衍生物产量提高的途径。含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的一个片段或几个片段可以克隆到改 造后的细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)或柯斯载体(Cosmid)或表达载 体或其它类型的载体，以应合适的需要。含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表 达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的角色。包含本发明的氨基酸序列或至少部分序列(序列2-22)的多肽可能在去除或替代 某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋 白动力学特征或其它致力于得到的性质。通过合适的技术缺失，连接本发明中的氨基酸序列可以得到新的蛋白或酶，进 而产生新的聚酮或相关连的产物。本发明具有实质性特点和显著的进步，本发明所提供的基因序列可用于产生预 期的基因工程抗生素或杂合抗生素或用于提高抗生素或基因工程抗生素的产量。本发 明所提供的氨基酸序列可以用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备。本发明所提供 的氨基酸序列提供了预测聚酮合酶三维结构的可能，进而为改造或改善蛋白活性提供依 据。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质蛋白质，相应的抗体或多核苷可以用来查 找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。
以下通过附图对本发明进一步描述图1为用来测序覆盖整个FR-008基因簇的文库柯斯质粒和亚克隆图2为负责FR-008生物合成的整个FR-008基因簇的结构。包括结构基因，修 饰基因，调节基因，矫正基因及转运基因等，负责FR-008的生物合成及调节和外运。图3为FR-008化学结构示意图。编号为Cl’ -C6’的为氨基海藻糖基团。羧 基化发生在C-18位，羟基化发生在C-9位。Rl代表羟基或酮基，R2代表羟基或H原 子。图4为调节基因突变株基因置换发生的杂交证明。A为基因置换发生的示意图； B为基因突变株的杂交证明。HJ-1，HJ-2, HJ-3与1.5kb杂交的阳性带(4.3kb)比野生 型的阳性带(1.5kb)大2.8kb，因为HJ-1，HJ-2, HJ-3的染色体中阿泊拉霉素/红霉素 抗性基因置换了调节基因。
图5为调节基因突变株生物活性测定。左右下方3个突变株均不再产生抑菌圈。 正上方为野生型对照。图6为负责FR-008分子中双键和糖基附着的酮基还原酶结构域(KR)控制立体 构型特定氨基酸附近的氨基酸的比较。KR8，KR9和KR12的这个特定氨基酸由天冬氨 酸分别变为甘氨酸(G)，天冬酰氨(N)和丙氨酸(A)。
具体实施例方式如图1和图2所示，本发明序列列表中序列描述序列1为包括21个开放读码框架的138,203bp的核苷酸序列，它们是负责 FR-008 生物合成的基因 fscA，fscB, fscC, fscD, fscE, fscF, fscTI, fscTII, fscRI, fscRII, fscRIII, fscRIV, fscP, fscFE, fscTE, fscMI, fscMII, fscMIII, fscO, pabAB 禾口 pabCo序列2为fscA基因(序列1中核苷酸20,927-26,158)编码的I型聚酮合酶(FscA)
的氨基酸序列。序列3为fscC基因(序列1中核苷酸60,860-28,983)编码的I型聚酮合酶(FscC)
的氨基酸序列。序列4为fscB基因(序列1中核苷酸77,587-60,962)编码的I型聚酮合酶(FscB)
的氨基酸序列。序列5为fscF基因(序列1中核苷酸84,132-77,983)编码的I型聚酮合酶(FscF)
的氨基酸序列。序列6为fscE基因(序列1中核苷酸107,485-84,170)编码的I型聚酮合酶(FscE)
的氨基酸序列。序列7为fscD基因(序列1中核苷酸136,148-107,496)编码的I型聚酮合酶 (FscD)的氨基酸序列。序列8为fscTI基因(序列1中核苷酸26,333-27,340)编码的ABC转运蛋白 (FscTI)的氨基酸序列。序列9为fscTII基因(序列1中核苷酸27,561-28,280)编码的ABC转运蛋白 (FscTII)的氨基酸序列。序列10为fscRI基因(序列1中核苷酸3,818-3,150)编码的调节蛋白(FscRI)的
氨基酸序列。序列11为fscRII基因(序列1中核苷酸7,205-4,377)编码的调节蛋白(FscRII)
的氨基酸序列。序列12为fscRIII基因(序列1中核苷酸10,320-7,210)编码的调节蛋白(FscRIII)
的氨基酸序列。序列13为fscRIV基因(序列1中核苷酸13,315-10,298)编码的调节蛋白 (FscRIV)的氨基酸序列。序列14为fscP基因(序列1中核苷酸16,106-17,287)编码的细胞色素P450单氧 化酶(FscP)的氨基酸序列。序列15为fscFE基因(序列1中核苷酸17,334-17,528)编码的铁氧化还原蛋白(FscFE)的氨基酸序列。序列16为fscTE基因(序列1中核苷酸17,556-18,413)编码的II型硫脂酶 (FscTE)的氨基酸序列。序列17为fscMI基因(序列1中核苷酸13,522-14,898)编码的糖苷转移酶 (FscMI)的氨基酸序列。序列18为fscMII基因(序列1中核苷酸14,953-16,011)编码的GDP-酮糖氨基 转移酶(糖基合成酶)(FscMII)的氨基酸序列。序歹Ij 19为fscMIII基因(序歹丨J 1中核苷酸137,766-136,558)编码的GDP-甘露 糖_4，6-脱水酶(糖基合成酶)(FscMIII)的氨基酸序列。序列20为fscO基因(序列1中核苷酸1,950-574)编码的依赖FAD的单氧化酶 (FscO)的氨基酸序列。序列21为pabAB基因(序列1中核苷酸18,610-20,781)编码的4_氨基_4_脱 氧Chorismate合成酶(对氨基苯甲酸合成酶)(PabAB)的氨基酸序列。序列22为pabC基因(序列1中核苷酸3,037-2,264)编码的4_氨基_4_脱氧 Chorismate合成酶(对氨基苯甲酸合成酶)(PabC)的氨基酸序列。以下进一步对本发明详细描述由于FR-008有抗真菌活性，对蚊子幼虫有高毒性和可以防止前列腺肿大以及 可以防止阴道滴虫感染和念珠菌阴道炎以及在其它工业，农业，医药上所具有的应用潜 能，本发明分离了负责FR-008生物合成的基因簇，覆盖整个基因簇的五个柯斯质粒， pHZ145, pHZ137, pHZ220, pHZ194和pJTUl连同一个亚克隆质粒pJTU6被用来测 序，pJTU6携带了 pHZ141的5.2kb和7.5kb BamHI片段，但是7.5kb对5.2kb片段的方向 与pHZ141或者说染色体中是相反的，pHZ145，pHZ137, pHZ194和pJTUlO的载体为 pHZ132, pHZ220 的载体为 pIJ653，pJTU6 的载体为 pBluescriptll SK(+)。测序获得138,203bp的连续核苷酸序列。在全部21个开放读码框架中有6个I 型聚酮合酶基因(fscA-fscF)。序列分析是使用FramePlot 2.3.2软件和美国国家生物信息 中心的Conserved Domain Database search及其提供的世界范围的Blast引擎。fscA-fscF编 码的氨基酸序列通过与已经得到充分了解的一些I型聚酮合酶的氨基酸序列进行比较从而 得出这些多肽的功能特征(详见图1)。聚酮合酶基因序列序列1中的20,927-26,158和28,983-136,148碱基是负责FR-008内酯环合成的聚 酮合成酶基因的序列，FR-008基因簇中共有6个聚酮合酶基因，在fscA和fscC之间有 一段编码两个ABC转运子的核苷酸序列。FR-008基因簇中各聚酮合酶基因的核苷酸序 列与相应的氨基酸序列，如表1所示表 1
权利要求
1.一种导致链霉菌FR-008中缺乏对氨基苯甲酸的基因，其特征在于，所述基因如 pabAB所示，该基因的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏对氨基苯甲酸。
2.一种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性的基因簇，其特征在于， 所述基因簇如fscA、fscB、fscC、fscF以及fscRI所示，该基因簇的缺失导致链霉菌 FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性。
3.—种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素的基因簇，其特征在于，所述基因 簇如fscRII、fscRIII以及fscRIV所示，该基因簇的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008 抗生素。
4.一种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性的基因簇，其特征在于， 所述基因簇如 fscTI、fscTII、fscP、fscFE、fscTE、fscMI、fscMII、pabC、fscD、fscE、 fscO以及fscMIII所示，该基因簇的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性。
全文摘要
一种链霉菌FR-008中负责FR-008聚酮合成的基因簇，属于基因技术领域，包含fscA、fscB、fscC、fscD、fscE、fscF、fscTI、fscTII、fscRI、fscRII、fscRIII、fscRIV、fscP、fscFE、fscTE、fscMI、fscMII、fscMIII、fscO、pabAB、pabC这一系列共21个基因及其DNA序列，即序列1，并提供了这些基因及其DNA序列所编码FR-008生物合成酶的氨基酸序列，即序列2-22。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质可以用来查找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。
文档编号C12N15/52GK102021187SQ20101050140
公开日2011年4月20日 申请日期2003年10月23日 优先权日2003年10月23日
发明者周秀芬, 李商玉, 邓子新, 郑克俊, 陈实 申请人:上海交通大学, 韩国高等科学技术学院