专利名称：一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用。
背景技术：
自1944年青霉素等抗生素投入使用以来，不仅仅是脑膜炎双球菌，其它很多威胁生命的致病菌，如金葡球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、结核杆菌都已对其产生了耐药性。据美国疾病控制中心(⑶C)历年发表的有关报告预测，再过10年至20年，这些抗生素将可能完全失效。目前常用的抗生素主要通过抑制细胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质代谢与合成途径来达到抗菌目的。然而这些抗菌方式容易诱导细菌发生突变而产生耐药性。 因此人们一直在致力于开发新型的抗生素。模仿同种异株细菌之间互相杀伤的工作方式来开发新型抗生素是比较有前途的方向之一。自然界中有不少细菌毒素直接在细菌胞膜上形成离子通道来杀死细菌。其模式标本就是大肠杆菌分泌的一种细菌毒素-大肠菌素。其中大肠菌素Ia自1952年被Jacob发现之后，经过数代人的努力，1996年终于揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上所形成离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构Oiiu et al, Major transmemebrane movement soociated with colicin Ia channel gating. J. Gen. Physiology, 107 :313-3 (1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论 ■石出。如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗生素原型，但野生型大肠菌素只能作用于同种异株的大肠杆菌，因此必需改变它的靶向性，才能使大肠菌素转而攻击其它致病菌；膜孔蛋白Porin是存在于细菌质膜的外膜、线粒体和叶绿体的外膜上的通道蛋白，它们允许较大的分子通过，，具有较强的免疫原性，能在宿主体内诱导出特异性的高水平的单抗，如能利用对抗细菌表面Porin蛋白的抗体作为原型，设计出具有更理想识别性能的抗体模拟物，用这个模拟物来改变大肠菌素的靶向性，应该是一种理想的抗生素开发方向。
发明内容
本发明针对上述领域的空白，提供一种的新型抗生素，该抗生素的杀菌能力是常用抗生素千倍以上，由于其作用机理特殊，因此致病菌很难产生耐药性，杀菌过程中不会伤害人体正常细胞。一种含抗体模拟物的新型抗生素，由大肠菌素El、la、lb、A、B、N或其水性孔道结构域及共价连接在所述大肠菌素或其水性孔道结构域的肽链羧基端的抗体模拟物构成，所述抗体模拟物是由免疫球蛋白的VhCDRI的羧基端连接VhFR2的氨基端，VhFR2的羧基端再连接&CDR的氨基端构成；所述免疫球蛋白特异性识别细菌膜孔蛋白。所述细菌指脑膜炎双球菌，所述膜孔蛋白指脑膜炎双球菌表面的膜孔蛋白PorA。所述免疫球蛋白指在具有PUBMED登录号为2MPA_H所记载的氨基酸序列的肽链与具有登录号为2MPA_L所记载的氨基酸序列的肽链共价结合而得的抗体蛋白。所述大肠菌素为la。一种肽链分子，其特征在于由大肠菌素El、la、lb、A、B、N或其水性孔道结构域的肽链及共价结合在其羧基端的抗体模拟物肽链连接而成，所述抗体模拟物肽链由免疫球蛋白的三个区域VHOTRl、VHFR2、VfDR3的肽链顺次以羧基端连接下一区域肽链的氨基端构成； 所述免疫球蛋白特异性识别细菌膜孔蛋白。所述肽链分子，具有kq ID No. 6所示氨基酸序列。编码上述肽链分子的核苷酸序列。所述核苷酸序列，如kq ID No. 5所示。包含上述核苷酸序列的重组表达载体。上述的新型抗生素的制备方法，指将上述的重组表达载体导入到表达系统中进行表达；分离纯化表达的多肽获得抗生素。所述的新型抗生素在制备抗细菌药物中的应用。所述抗细菌药物指抗脑膜炎双球菌、抗耐万古霉素肠球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐药绿脓杆菌的药物。本发明利用大肠菌素能在靶细菌膜上形成离子通道，使靶细胞内胞质泄漏而死， 而本发明中起靶向性作用的结构是对抗细菌表面膜孔蛋白即Porin蛋白的免疫球蛋白的部分区域被重构后获得的模拟抗体物，包含该免疫球蛋白的重链可变区的第一互补决定区 VhCDRI、重链可变区的第二骨架区VHFR2、轻链可变区的第三互补决定区\CDR3，三个区域顺次以羧基端链接下一区域的氨基端构成VhCDR1-VhFR2-\CDR3的线性分子；众所周知，免疫球蛋白起识别作用的活性区域称为互补决定区，互补决定区仅有几个到十几个氨基酸组成，与完整的免疫球蛋白或者目前有报道的单链抗体seFv、Fab等人工改造抗体相比，本发明的分子量极小，组织透过性好，同时由于其结构简单，去除了完整免疫球蛋白分子的大部分框架结构及Fc段，使其对患者的免疫原性大大降低，非常利于带领大肠菌素到达致病部位识别致病菌。在治疗中，大肠菌素被引向致病菌细胞膜表面，大肠菌素在靶细菌膜上形成离子通道，使靶细胞内胞质泄漏而死，对于目前已经产生耐药性的菌株也具有相同的杀菌能力。由于其识别位点为细菌表面特有的抗原物质，人体组织细胞膜上不存在这样的识别位点，因此其对于人体是安全的。相对于其他易于产生耐药性的抗生素，本发明的抗生素， 由于其起靶向作用的抗体模拟物仅仅需将大肠菌素引向致病菌就完成了任务，我们并不需要通过膜孔蛋白位点作用致死细菌，而是通过大肠菌素作用于细菌的生物膜，使生物膜产生离子通道导致细胞泄漏而死，传统的细菌耐药性一般通过改变膜孔蛋白的结构对抗生素进入细菌细胞内造成障碍而产生耐药性，而本发明仅仅需要膜孔蛋白的抗体识别位点的活性即可到达杀菌的目的，可以说，是一种声东击西的策略，即识别膜孔蛋白位点，但大肠菌素结合在细胞膜的另外一个位点形离子通道致死细菌，真正的作用位点不在Porin蛋白， 因此细菌很难通过变异、进化而丢掉或改变膜孔蛋白这种生存必须的结构，因此细菌很难对本发明的抗生素产生耐药性。由于本发明根据不同细菌表面膜孔蛋白的多样性及与其识别的免疫球蛋白的多样性，根据本发明这一设计构思获得的新型抗生素也是多样的。由于脑膜炎双球菌引起的脑膜炎对国内外的婴儿以及青少年的健康造成了极大的威胁，且其对目前常用药的抗药性表现非常明显，为了有效抑制该菌而使药剂量越来越高，这严重危害患者健康，因此，发明人采用本发明的构思，针对脑膜炎双球菌的膜孔蛋白 PorinA的抗体，其重链肽链的PUBMED登录号为2MPA_H，轻链肽链的PUBMED登录号为2MPA_ L，进行重构获得抗体模拟物，即如^^ ID No. 2所示的氨基酸序列；并可操作地连接在大肠菌素Ia的肽链的羧基端，获得具有如^^ ID No. 6所示的氨基酸序列的新型抗生素 PMC-AMl0如图7所示，在脑膜炎双球菌致死量感染小鼠的存活实验中，注射本发明抗生素 PMC-AMl的小鼠的8天存活率为90%，说明本发明的抗生素比现用抗生素青霉素、庆大霉素等具有无法比拟的抗菌活性和体内保护效果；同时，通过杀菌效果比较，如图6A所示，比较本发明的抗生素PMC-AMl与头孢它啶、氨苄青霉素对脑膜炎双球菌的最低抑菌浓度(MIC 值)，实验结果显示PMC-AMl的MIC 0. llnMol，头孢它啶的MIC 3. 02nMol，氨苄青霉素的 MIC1. 35nMol ；说明其杀菌能力明显高于目前常用于抑制脑膜炎双球菌的抗生素。发明人用本发明的新型抗生素PMC-AMl对其他目前产生耐药性严重的致病菌进行试探性实验，发现PMC-AMl还对多重耐药绿脓杆菌、耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金葡菌有极强的抗菌效力，如图5所示，PMC-AMl对多重耐药绿脓杆菌的杀菌效果比头孢它啶、 左氧氟沙星、庆大霉素等现用抗菌素强127 3800倍以上；PMC-AMl对耐万古霉素肠球菌、 耐甲氧西林金葡菌有明显的抑制效果，如图6B、C所示。本发明的抗生素可用于制备抗菌药物，特别是在制备抗脑膜炎双球菌、抗绿脓杆菌、抗耐万古霉素肠球菌及抗耐甲氧西林金葡菌的药物中的应用。可将编码本发明抗生素的核苷酸克隆到表达载体中构建重组表达载体，这些载体可在宿主中表达融合蛋白，分离融合蛋白获得本发明的抗生素蛋白。根据密码子的兼并性，编码本发明的抗生素或者抗体模拟物的核苷酸序列是可调整的，可根据宿主细胞对密码子的偏好性调整核苷酸序列，只要编码的氨基酸不变，都属于本发明要求保护的范围。
图1含抗体模拟物和大肠菌素Ia的重组质粒pBHC-PorAl的结构其中抗体模拟物的肽链连接在Ia的肽链羧基端，抗体模拟物的氨基酸序列如Seq ID No. 2 所示。图2含抗体模拟物肽链和大肠菌素Ia的重组质粒pBHC_PorA2的结构其中抗体模拟物肽链连接在Ia的羧基端，抗体模拟物肽链是重链可变区的第一互补决定区的羧基端链接重链第二骨架区，轻链可变区的第三互补决定区的肽链羧基端氨基酸链接在重链第二骨架区的羧基端氨基酸上，如kq ID No. 4所示。图3本发明新型抗生素的结构其中T和R是大肠菌素Ia位于氨基端的两个信号识别结构域；channel-forming 是大肠菌素Ia位于羧基端的形成离子通道结构域；AM是抗体模拟物。图4为本发明新型抗生素PMC-AMl对脑膜炎双球菌的抑制实验图中曲线从左到右依次为对照，5 μ g/ml氨苄青霉素，5 μ g/ml PMC-AM2, 5 μ g/ mlPMC-AMl，10 μ g/ml PMC-AMI。本图横座标为细菌生长时间，单位为小时；纵座标为培养液600nm光密度，显示细
菌生长数量。
图5琼脂二倍稀释法测定新型抗生素的最低抑菌浓度(MIC)平皿显示(Con)，空白对照，(A)，头孢它啶为16μ g/ml、(B)，左氧氟沙星为8 μ g/ ml、(C)，庆大霉素大于512yg/ml、(D)，新型抗生素(PMC-AMl)对多重耐药绿脓杆菌的最低抑菌浓度为8yg/ml。图6本发明新型抗生素与常用抗菌素对耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)、耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)、多重耐药绿脓杆菌(华西医院临床分离株13578)和脑膜炎双球菌(中国菌种保存中心四33幻最小抑菌浓度的比较实验纵座标为最小抑菌浓度(nMol)；其中A图为脑膜炎双球菌，(l)PMC-AMl，MIC = 0. 1 InMol, (2)头孢它啶，MIC = 3. 02nMol, (3)氨节青霉素，MIC = 1. 35nMol ；B图为耐万古霉素肠球菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol，(2)万古霉素，MIC = 21. 54nMol, (3)氨节青霉素，MIC = 10. 78nMol ；C图为耐甲氧西林金葡菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 06nMol, (2)氨苄青霉素，MIC = 21. 55nMol, (3)苯唑西林，MIC = 14. InMol ；D图为多重耐药绿脓杆菌，(l)PMC-AMl, MIC = 0. 9InMol, (2)左氧氟沙星，MIC = 43. 2nMol, (3)头孢它啶，MIC = 29. 3nMol, (4)庆大霉素，MIC > 889. 4nMol。图7本发明新型抗生素与野生型大肠菌素、抗金葡菌多肽(ZL 01128836. 1)对耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)、耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)、多重耐药绿脓杆菌 (华西医院临床分离株13578)抑制作用的比较之生存曲线纵座标为最小抑菌浓度(nMol)；其中A图为耐万古霉素肠球菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大肠菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol ；B图为耐甲氧西林金葡菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 06nMol, (2)野生型大肠菌素 Ia，MIC = 0. 23nMol, (3)PMC-AMI, MIC = 0. 06nMol ；C图为多重耐药绿脓杆菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大肠菌素 Ia, MIC = 0. 9InMol, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol。图8本发明新型抗生素对脑膜炎双球菌感染动物的体内保护试验之生存曲线横座标为鼠存活时间，单位为天；纵座标为动物存活数，单位为每只鼠1) PMC-AMl，本发明新型抗生素；2)Gen，庆大霉素；3) PEN，青霉素；4) Con.，对照； 所有药物注射浓度均为1. 5mg/kg。
具体实施例方式结合附图，通过本发明较佳实施例的描述具体说明本发明。实施例1表达新型抗生素的质粒的构建和新型抗生素制备原始质粒为装载了大肠菌素和immunity蛋白基因的pSELECT -l质粒(8. 3kb)。 经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChange Kit, Strategene公司)将编码抗体模拟物基因，如^^ ID No. 1和％(1 ID No. 3所述的核苷酸序列分别插入到大肠菌素变构多肽基因的6 位点上，制备了新型抗生素的突变质粒pBHC-PorAl、pBHC-PorA2 (如图1-图2所示)。突变质粒转染入E. coli BL-21工程菌里制备新型抗生素。
突变禾呈序按 Strategene QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit (catalog #200518)药箱手册进行即1.准备点突变反应物5ul IOX buffer2ul (IOng)装载了大肠菌素变构多肽和immunity蛋白基因的原始质粒1. 25ul (125ng)设计的5’ _3’寡聚核苷酸引物(见所列引物序列)1. 25ul (125ng)设计的3’ _5’寡聚核苷酸引物(见所列引物序列)Iul dNTP双蒸水50ulIul pfu(除质粒、引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)2.进行PCR扩增，扩增条件变性950C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分， 共20个循环；3.加入Dpn 1内切酶Iul消化母体DNA链后(37°C，1小时)，取Iul反应物与 XLl-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，热冲击42°C，45秒，再置入冰中2分钟；4.加入NZY培基0. 5ml，220rpm，37°C摇菌1小时，取50_100ul反应物铺板(LB培基加琼脂，加50ug/ml氨苄青霉素，37 °C过夜)；5. 18小时后挑菌，提取质粒后测序确定突变成功；6.将突变质粒IOOng与制备的BL-21工程菌感受态细胞40ul冰孵5分钟，热冲击 42°C，30秒，再置入冰中2分钟，加入SOC培基160ul，220rpm，37°C摇菌1小时后铺板(LB 培基加琼脂，加50ug/ml氨苄青霉素，37°C过夜)，挑取单克隆菌落大量增菌；7.大量增菌，8-10 升 FB 培基，250rpm，30°C，3-4 小时；升温至 42°C，250rpm 生长 0. 5小时；降温至37°C,250rpm生长1. 5小时；4°C，6000g，20分钟离心沉淀菌体，取4°C， 50mM硼酸缓冲液(pH 9. 0, 2mMEDTA) 80-100ml悬浮菌体，加入PMSF 50ug后超声破碎菌体 (4°C,400ff, 1分钟，重复4-5次，间歇2-3分钟确保菌液温度)，高速离心沉淀破碎的菌体 (475, OOOg,90分钟)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA0°C搅拌1小时)， 10，000g, 40C，10分钟离心沉淀后，取上清装入分子量15，000透析袋于4°C，50mM硼酸缓冲液10升透析过夜后，再次10，000g, 40C，10分钟离心沉淀，取上清上样于CM离子交换柱，充分冲洗后，0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液洗脱即可得到所制备的新型抗生素。对应于以上2 种质粒，可分别获得PMC-AMl和PMC-AM2两种抗生素，其氨基酸序列分别如kq ID No. 6、 Seq ID No. 8 所示。其中AMl是重链可变区的第一互补决定区、重链第二骨架区、轻链可变区第三互补决定区，三个区域顺次以羧基端链接下一区域的氨基端，氨基酸序列如^^ ID No. 2所示；AM2是重链可变区的第一互补决定区的羧基端链接重链第二骨架区，轻链可变区的第三互补决定区的肽链羧基端氨基酸链接在重链第二骨架区的羧基端氨基酸上，氨基酸序列如kqlD No. 4所示。将PMC-AM2作为PMC-AMl的对照，验证本发明设计的抗体模拟物的氨基酸区段之间在不同连接方式下产生的抗生素的功能。上述制备质粒中所设计的寡聚核苷酸引物序列如下
5，-3，(SEQ ID NO. 9)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG CTG CAT TGG ATT AM CAG taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 10)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG TTT AAT CCA ATG CAG CCA ATA AGA aat acc cca gaa ctt att cgc5，-3，(SEQ ID NO. 11)tgg ctg cat tgg att aaa cag AGA CCT GGT CAG GGA CTG TGG ATC GGA taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 12)gcc tgt ctt ata ttt tat tta TCC GAT CCA CAG TCC CTG ACC AGG TCT ctg ttt aat cca atg cag cca5，-3，(SEQ ID NO. 13)ggt cag gga ctg tgg ate gga TCT CAG TCC ACG CAT GTG CCG AGA ACC taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 14)gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT TCT CGG CAC ATG CGT GGA CTG AGA tcc gat cca cag tcc ctgaccpBHC-PorA 25，-3，(SEQ ID NO. 15)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG CTG CAT TGG ATT AM CAG taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 16)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG TTT AAT CCA ATG CAG CCA ATA AGA aat acc cca gaa ctt att cgc5，-3，(SEQ ID NO. 17)tgg ctg cat tgg att aaa cag AGA CCT GGT CAG GGA CTG TGG ATC GGA taa ata aaa tat aag acaggc3，-5，(SEQ ID NO. 18)gcc tgt ctt ata ttt tat tta TCC GAT CCA CAG TCC CTG ACC AGG TCT ctg ttt aat cca atg cag cca5，-3，(SEQ ID NO. 19)ggt cag gga ctg tgg ate gga ACC AGA CCG GTG CATACG TCC CAG TCT taa ata aaa tat aagaca ggc3，-5，(SEQ ID NO. 20)gcc tgt ctt ata ttt tat tta AGA CTG GGA CGT ATG CAC CGG TCT GGT tcc gat cca cag tcc ctgacc实施例2新型抗生素对脑膜炎双球菌的抑制作用细菌为中国菌种保存中心29332脑膜炎双球菌株，菌液2微升(105CFU/ml)加入兔血巧克力培养液10毫升(牛肉浸膏50mg、胰蛋白胨lOOmg、KH2PO4 30mg、NaCl 50mg、脱纤维兔血0. 5-0. 8ml)中，共准备5组，第一组加入0. 3M NaCl+50mM硼酸缓冲液(即新型抗生素的空白保存液，量与实验组中加入的新型抗生素液体量相同)作为对照，第二组加入 5 μ g/ml氨苄青霉素，第三组加入5 μ g/ml PMC-AM1，第四组加入5 μ g/mlPMC_AM2，第五组加入 10 μ g/ml PMC-AMI。上述各组液体分别置于100毫升三角烧瓶中，200rpm, 37°C C生长，每小时采样100 微升加入96孔酶表板中经分光光度计(A 595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较新型抗生素的抑菌效力，结果如图4所示，显示所试脑膜炎双球菌只能被PMC-AMl 所抑制。实施例3新型抗生素对多重耐药绿脓杆菌的最低抑菌浓度与现用抗菌素的最低抑菌浓度之比较。采用琼脂二倍稀释法测定新型抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。用多点接种仪 (DeneleyA400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点含菌量为105CFU/ml， 37°C孵育18- 小时观察结果，以无细菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。所用菌种为多重耐药绿脓杆菌(华西医院临床分离株13578)，培养基为MH培养基 (每百毫升牛肉浸膏500mg、酪蛋白酸水解物1. 75g、可溶性淀粉150mg、琼脂1. 7g)。结果如图5所示，新型抗生素⑶(PMC-AMl)对多重耐药绿脓杆菌的最低抑菌浓度为8 μ g/ml、头孢它啶㈧为16 μ g/ml、左氧氟沙星⑶为8μ g/ml、庆大霉素(C)大于 512 μ g/ml0若以分子量标化，PMC-AMl对多重耐药绿脓杆菌的最低抑菌浓度为0. 23nMol、 头孢它啶为四.3nMol、左氧氟沙星为43. 2nMol、庆大霉素大于890nMol ； S卩，PMC-AMl对多重耐药绿脓杆菌的抗菌效力强过头孢它啶、左氧氟沙星、庆大霉素等现用抗菌素127-3800余倍。实施例4新型抗生素的体外抗菌活性与现用抗菌素的比较采用琼脂二倍稀释法测定新型抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。用多点接种仪 (DeneleyA400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点含菌量为105CFU/ml， 37°C孵育18- 小时观察结果，以无细菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。所用菌种为多重耐药绿脓杆菌(华西医院临床分离株13578)，MH培养基(每百毫升含牛肉浸膏500mg、酪蛋白酸水解物1. 75g、可溶性淀粉150mg、琼脂1. 7g)；耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA-42)，BM培养基(每百毫升含胰蛋白胨lg、酵母0. 5g、葡萄糖0. lg.NaCl lg、KH2PO4 lOOmg、琼脂lg)；耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)，MH培养基；脑膜炎双球菌 (中国菌种保存中心四33幻，培基同实施例2 (另加哥伦比亚血琼脂基础3. 9g)。结果如图6所示，A图为脑膜炎双球菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. IlnMol，(2)头孢它啶，MIC = 3. 02nMol, (3)氨苄青霉素，MIC = 1. 35nMol ；B图为耐万古霉素肠球菌， (1)PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol, (2)万古霉素，MIC = 21. MnMol，(3)氨苄青霉素，MIC = 10. 78nMol ；C图为耐甲氧西林金葡菌，(1)PMC-AMl，MIC = 0. 06nMol, (2)氨苄青霉素，MIC =21. 55nMol, (3)苯唑西林，MIC = 14. InMol ；D 图为多重耐药绿脓杆菌，(1) PMC-AMl，MIC =0. 9InMol, (2)左氧氟沙星，MIC = 43. 2nMol，(3)头孢它啶，MIC = 29. 3nMol，(4)庆大霉素，MIC > 889. 4nMol。实施例5新型抗生素的体外抗菌活性与抗金葡菌多肽和野生型大肠菌素Ia的比较采用琼脂二倍稀释法测定新型抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。以无细菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。所用菌种为多重耐药绿脓杆菌(华西医院临床分离株13578)，耐甲氧西林金葡菌 (ATCC BAA-42)，耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)，MH培养基；脑膜炎双球菌(中国菌种保存中心四332)，培基同实施例4。结果如图7所示，A图为耐万古霉素肠球菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0.91nMol， (2)野生型大肠菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl，MIC = 0. 23nMol ；B 图为耐甲氧西林金葡菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 06nMol, (2)野生型大肠菌素la,MIC = 0. 23nMol，(3) PMC-AM1,MIC = 0. 06nMol ；C图为多重耐药绿脓杆菌，(1)抗金葡菌多肽，MIC = 0. 9InMol, (2)野生型大肠菌素 Ia，MIC = 0. 9InMo 1, (3) PMC-AMl, MIC = 0. 23nMol。实施例6新型抗生素的脑膜炎双球菌感染动物的体内保护试验一、实验材料(1)药物PMC-AMl、庆大霉素、青霉素。(2)细菌脑膜炎双球菌(中国菌种中心(北京天坛国家药监局中检所)29332)。二、实验方法如图7所示，实验组共40只昆明小鼠，分为4个实验组，每组10只。腹腔注射葡萄糖亚铁溶液(20mg/kg) 1个小时后，再注射0. 5ml菌液。该菌液由1份脑膜炎双球菌培养液(CFU为2. 36xl09)比1. 5份灭活5%干酵母溶液组成。腹腔注射致死剂量的细菌1小时后，尾静脉注射药物以及对照生理盐水(所有药物注射浓度均为1. 5mg/kg)，每2小时观察结果，连续8天，以小鼠死亡为阳性结果。如图7所示1PMC_AM1，本发明新型抗生素；2Gen，庆大霉素；3PEN，青霉素； 4Con.，对照。三、结果如图7所示小鼠生存曲线，腹腔注射致死剂量脑膜炎双球菌后，1)，对照组在2天内全部死亡，2)，青霉素组在2天内全部死亡，3)，庆大霉素组8天存活率为50 %，4)，本发明新型抗生素的8天存活率为90%。结果显示，对脑膜炎双球菌致死性感染，本发明的新型抗生素PMC-AMl表现出了所试现用抗生素无法比拟的抗菌活性。
权利要求
1.一种含抗体模拟物的新型抗生素，由大肠菌素El、la、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域及共价连接在所述大肠菌素或其水性孔道结构域的肽链羧基端的抗体模拟物构成，所述抗体模拟物是由免疫球蛋白WVhCDRI的羧基端连接VhFR2的氨基端，VhFR2的羧基端再连接 VLCDR的氨基端构成；所述免疫球蛋白特异性识别细菌膜孔蛋白。
2.根据权利要求1所述的新型抗生素，所述细菌指脑膜炎双球菌，所述膜孔蛋白指脑膜炎双球菌表面的膜孔蛋白PorA。
3.根据权利要求2所述的新型抗生素，所述免疫球蛋白指在具有PUBMED登录号为 2MPA_H所记载的氨基酸序列的肽链与具有登录号为2MPA_L所记载的氨基酸序列的肽链共价结合而得的抗体蛋白。
4.根据权利要求1或2或3所述的新型抗生素，所述大肠菌素为la。
5.一种肽链分子，其特征在于由大肠菌素El、la、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域的肽链及共价结合在其羧基端的抗体模拟物肽链连接而成，所述抗体模拟物肽链由免疫球蛋白的三个区域VfDRl、VhFR2、VfDR3的肽链顺次以羧基端连接下一区域肽链的氨基端构成； 所述免疫球蛋白特异性识别细菌膜孔蛋白。
6.根据权利要求5所述肽链分子，具有kqID No. 6所示氨基酸序列。
7.编码权利要求5或6所述肽链分子的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述核苷酸序列，如kqID No. 5所示。
9.包含权利要求7或8所述核苷酸序列的重组表达载体。
10.权利要求1至4任一所述的新型抗生素的制备方法，指将权利要求9所述的重组表达载体导入到表达系统中进行表达；分离纯化表达的多肽获得抗生素。
11.权利要求1至4任一所述的新型抗生素在制备抗细菌药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，所述抗细菌药物指抗脑膜炎双球菌、抗耐万古霉素肠球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐药绿脓杆菌的药物。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，特别是涉及“一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用”，一种含抗体模拟物的新型抗生素，由大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域及抗体模拟物构成，所述抗体模拟物是由免疫球蛋白的VHCDR1的羧基端连接VHFR2的氨基端，VHFR2的羧基端再连接VLCDR的氨基端构成；所述免疫球蛋白特异性识别细菌膜孔蛋白。该抗生素的杀菌能力是常用抗生素千倍以上，由于其作用机理特殊，因此致病菌很难产生耐药性，杀菌过程中不会伤害人体正常细胞；可用于制备抗抗脑膜炎双球菌、抗耐万古霉素肠球菌、抗耐甲氧西林金葡菌或抗多重耐药绿脓杆菌的药物中。
文档编号C12N15/63GK102558361SQ20121002770
公开日2012年7月11日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者丘小庆 申请人:畿晋庆堂国际生物技术有限公司