一种微生物絮凝剂的两步发酵生产方法

专利名称：一种微生物絮凝剂的两步发酵生产方法
技术领域：
本发明属于环境工程中废水处理技术领域，涉及一种微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，本发明所选用的微生物絮凝剂生产菌为红平红球菌。
背景技术：
长期以来，以铁盐、铝盐及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以聚丙烯酰胺及其衍生物为代表的有机高分子絮凝剂，被成功应用于工业废水处理、饮用水净化、污泥脱水、食品加工和发酵工业中。尽管无机絮凝剂和有机絮凝剂具有良好的絮凝效果，而且成本低，但是它们在使用过程中对人体和环境造成了不可忽略的危害和污染。研究表明，铝盐不仅可诱发阿尔茨海默氏病，而且大量使用会导致污泥机械脱水困难；铁盐不仅具有很强的腐蚀性，而且大量使用会增加处理水的色度，影响水质；聚丙烯酰胺是一种强致癌物，具有强烈的神经毒性，而且难以生物降解。这些缺点极大地限制了无机絮凝剂和有机絮凝剂在废水处理中的广泛应用。微生物絮凝剂是微生物在生长过程中产生的可生物降解的代谢产物，具有高效、 无毒、无二次污染等优点，有良好的除浊、脱色、降解有机物的性能。目前，国内外对产絮凝剂微生物和微生物絮凝剂的报道越来越多，如邓叔波等采用曲霉寄生菌生产的絮凝剂对印染废水具有高效的脱色性能，李忠等采用地衣芽孢杆菌生产的絮凝剂对低温饮用水具有较好的除浊降解COD效果，Raichur等采用枯草芽孢杆菌生产的絮凝剂在洗煤废水处理中取得了较好的效果。在微生物絮凝剂的生产方法和使用方法方面，也有着较多的报道，如 中国专利CN101948183A公开了酱油曲霉菌利用啤酒废水、糖蜜废水和味精废水等替代培养基生产微生物絮凝剂的方法，该絮凝剂可与PAC复配使用，对电镀废水中的Cu2+、M2+有一定的去除作用，但是在生产过程中存在以下缺陷种子培养基的碳源用量较大(30g/L)；替代培养基需要外加碳源量也较大(10g/L)；絮凝率只可以达到73. 9% ；絮凝剂的产量较低， 仅为1.5 2. lg/L。中国专利CN101225405A公开了克雷伯氏菌利用淀粉和复合氮源生产微生物絮凝剂的方法，该微生物絮凝剂可与金属离子复配使用，使絮凝剂用量降低2 4倍， 但在生产过程中存在以下缺陷所述的克雷伯氏菌种子液制备技术实施有困难；所复配的含钙离子溶液和含铝离子溶液用量大，一般为2 細1 15 20g/L的含钙离子溶液和2 4ml2 4g/L的含铝离子溶液；生物絮凝剂的产量较低。中国专利CN101327975A公开了戴尔福特食酸菌利用淀粉-硝酸钠培养基生产微生物絮凝剂的方法，该微生物絮凝剂具有较好的絮凝性能，对印染废水的絮凝率可达到93%，但在生产过程中存在一下缺陷发酵培养基接种量较大，达到15% (ν/ν)；絮凝剂的生产过程复杂，不易操作管理，尤其是絮凝剂的提取和纯化过程；没有公开生物絮凝剂的产量。上述专利公开的微生物絮凝剂生产方法中，均采用一步培养发酵工艺生产絮凝剂，即微生物菌种的种子培养的培养温度和发酵生产絮凝剂的发酵温度相同、种子培养的摇床速度和发酵产絮凝剂的摇床速度相同。当温度较高时，微生物生长快，大量消耗营养物质，导致絮凝剂的产量下降；而较低的温度有利于微生物代谢产物的积累，使得微生物絮凝剂产量较高，但絮凝剂生产周期较长。较高的摇床速度可以及时补充培养基中的溶解氧，有利于微生物的生长繁殖，快速生长的微生物消耗大量的营养物质，导致微生物絮凝剂产量低；而较低的摇床速度有利于微生物代谢产物的积累，使得微生物絮凝剂产量较高，但絮凝剂生产周期较长。因此，采用上述专利公开的生产微生物絮凝剂的方法，一方面会导致微生物絮凝剂产量低，絮凝能力低，另一方面会延长微生物絮凝剂的生产周期，即微生物絮凝剂产量达到最大时的所需要的发酵时间。虽然许多微生物絮凝剂已逐渐替代无机絮凝剂和有机絮凝剂应用于水处理领域， 但絮凝能力低和絮凝剂产量低依然是限制微生物絮凝剂在实际水处理中广泛应用的最大因素。因此，优化微生物发酵条件和絮凝剂生产方法，仍然是提高生物絮凝剂絮凝性能和微生物絮凝剂产量的必然选择。

发明内容
本发明在于提供一种采用红平红球菌生产微生物絮凝剂的两步发酵生产方法。两步发酵生产微生物絮凝剂，即在发酵初期采用较高发酵温度和摇床速度的发酵条件，缩短菌体生长的停滞期，使发酵液中菌体浓度在较短时间内达到较高水平；发酵后期采用较低发酵温度和摇床速度的发酵条件，最大限度利用营养物质生产絮凝剂。在提高絮凝效率和絮凝剂产量的同时，缩短生产絮凝剂的周期。本发明所述的微生物絮凝剂生产菌为红平红球菌。本发明公开的微生物絮凝剂的生产方法如下1、选用红平红球菌作为微生物絮凝剂生产菌；2、种子液的培养将菌株从斜面保藏培养基接种到种子培养基中，于观 32°C、 110 130rpm的条件下培养M 30h，获得种子液；3、发酵培养基的确定将种子液按1 2%的接种量接种到碳源测试培养基和氮源测试培养基，于观 32°C、110 130rpm的条件下发酵60 72h，通过检测菌体浓度和发酵液絮凝率，确定发酵培养基的成分(碳源、氮源、C/N、无机盐、pH等)；4、两步发酵生产微生物絮凝剂将种子液按1 2%的接种量接种至发酵培养基， 采用两步发酵生产方法生产微生物絮凝剂第一步，33 36°C、140 160rpm的条件下发酵Mh ；第二步，观 32°C、110 130rpm的条件下发酵30 48h，得到发酵液；5、微生物絮凝剂的提取分析得知，本发明所生产的微生物絮凝剂絮凝成分主要分布在上清液中，微生物菌体的絮凝活性较低。因此将两步发酵工艺所得到的发酵液在 5000 6000rpm条件下离心20 30min，去菌体后即为液体微生物絮凝剂；在液体微生物絮凝剂中加入一定比例的预冷乙醇，得到沉淀物，将沉淀物真空干燥即可获得所述微生物絮凝剂。6、养殖废水的处理将发酵液、(w/v)的CaCl2溶液与养殖废水按照 1 2. 5 150 200的体积比例混合搅拌，20 40min后，过滤，去除残渣。本发明的优点1.由于菌株生长代谢快，生产絮凝剂周期短，微生物絮凝剂产量高，60h内即可达到8. 9g/L的絮凝剂产量，因此可用于产业化生产；2.高效，两步发酵工艺生产的微生物絮凝剂，其絮凝率高达91. 7% ；
3.无毒，两步发酵工艺生产的微生物絮凝剂，经鉴定其絮凝成分为蛋白质和多糖， 含量分别为66. 4%和18. 2%，絮凝成分可生物降解，无二次环境污染；4.微生物絮凝剂处理养殖废水，除浊降解COD效果较好，较低的用量即可达到较好的处理效果。下面结合附表和附图详述本发明。附1 一步发酵和两步发酵对菌体浓度和絮凝率的影响其中a、发酵温度33 36°C，摇床速度140 160rpm的一步发酵对菌体浓度和絮凝率的影响b、发酵温度28 32°C，摇床速度110 130rpm的一步发酵对菌体浓度和絮凝率的影响C、两步发酵对菌体浓度和絮凝率的影响图2 —步发酵和两步发酵对微生物絮凝剂产量的影响图3 两步发酵生产微生物絮凝剂工艺流程

图1、微生物絮凝剂的生产及提取(1)种子培养基及种子液种子培养基成分蛋白胨8. 0 10. Og/L，酵母粉4. 0 5. Og/L，牛肉粉1. 5 2. Og/L, NaCl 8. 0 10. Og/L, pH = 7. 0。105 121°C灭菌 30min。从新鲜的红平红球菌斜面保藏培养基上挑取少许菌落至种子培养基中，于观 32°C、110 130rpm的条件下培养24 30h，获得种子液。将此种子液作为生产微生物絮凝剂时的接种液。(2)发酵培养基碳源测试培养基成分碳源20. Og/L、K2HPO4 5. 0g/L、KH2PO4 2. 0g/L、NaCl 1. Og/ L、脲0. 5g/L、酵母粉5. 0g/L、MgS04 0. 2g/L，pH = 7. 0。氮源测试培养基成分葡萄糖20. Og/ L、K2HPO4 5. 0g/L、ΚΗ2Ρ042· 0g/L、NaCl 1. 0g/L、氮源 5. 0g/L、MgSO4 0. 2g/L, pH = 7. 0。将种子液按1 2%的接种量接种到碳源测试培养基和氮源测试培养基，于观 32°C、110 130rpm的条件下发酵60 72h，通过检测菌体浓度和发酵液絮凝率，确定发酵培养基的成分为蔗糖 16 20g/L、酵母粉 3. 0 4. 0g/L、脲 0. 5 1. 0/L、NaCl 0. 2 1. 0g/L,MgSO4 0. 1 0. 2g/L、K2HPO4 3. 0 5. 0g/L、KH2PO4 1. 0 2. 0/L,发酵培养基初始 pH 为 8. 0 10. 0。(3)两步发酵生产微生物絮凝剂如图1所示，在发酵温度为33 36°C和摇床速度为140 160rpm的一步发酵条件下，发酵60h，菌体浓度最大(0D_，4. 6)，絮凝率达到最高，为87. 5% ；在发酵温度为28 32°C和摇床速度为110 130rpm的一步发酵条件下，发酵66h，菌体浓度最大(0D_，4. 1)， 絮凝率达到最高，为90. 4% ；两步发酵条件下，发酵60h，菌体浓度最大(0D_，4. 9)，絮凝率达到最高，为91. 7%，均高于一步发酵工艺。如图2所示，在发酵温度为33 36°C和摇床速度为140 160rpm的一步发酵条件下，发酵60h，絮凝剂产量为3. 4g/L，絮凝剂产量较低，这是因为菌体生长消耗大量的营养物质所造成的；在发酵温度为观 32°C和摇床速度为110 130rpm的一步发酵条件下，絮凝剂产量为8. 7g/L，但生产絮凝剂周期较长，为66h，这是因为菌株在低温和低溶解氧水平下生长代谢慢，发酵液中菌体浓度低，生长周期长。两步发酵条件下，絮凝剂产量高达8. 9g/ L，同时生产絮凝剂周期缩短到60h。(4)微生物絮凝剂的提取将两步发酵获得的发酵液经5000 6000rpm离心20 30min，收集上清液。在上清液中添加0.5 1.0%三氯甲烷和正丁醇(体积比4 1)，静置6 12h，虹吸上清液，即为液体絮凝剂。在液体絮凝剂中添加1 2倍体积的预冷乙醇，静置30 48h，经5000 BOOOrpm离心20 30min，得到微生物絮凝剂粗制品。采用透析法进行絮凝剂粗产品的纯化。微生物絮凝剂粗品溶于蒸馏水后，置于由半透膜组成的透析袋内进行透析，4°C条件下透析M 30h后，真空干燥获得絮凝剂纯品。2、处理养殖废水将发酵液、(w/v)的CaCl2溶液与养殖废水按照1 2. 5 150 200的体积比例混合搅拌，20 40min后，过滤，去除残渣，检测化学需氧量(COD)和浊度的去除效果。
具体实施例方式1、微生物絮凝剂的生产从新鲜的红平红球菌斜面保藏培养基挑取少许菌落至装有150ml种子培养基的 250ml摇瓶内，于30°C、120rpm的摇条件下培养Mh。将此种子液作为生产絮凝剂时的接种液。配制发酵培养基蔗糖 20g/L、酵母粉 4. Og/L、脲 1. 0/L、NaCl 1. Og/L、MgSO4 0. 2g/L、 K2HPO4 5. 0g/L,KH2PO4 2. 0/L。发酵培养基初始pH为8. 0 10. 0。按2%的接种量将种子液接种至发酵培养基。在发酵初期的24h内采用发酵温度35°C、摇床速度150rpm的发酵条件；发酵后期的36h内采用发酵温度30°C、摇床速度120rpm的发酵条件。将两步发酵获得的发酵液经5000rpm离心30min，收集上清液。在上清液中添加 0.5%三氯甲烷和正丁醇(体积比4 1)，静置他，虹吸上清液，在上清液中添加2倍体积的预冷乙醇，4°C条件下静置48h，经5000rpm离心30min，得到微生物絮凝剂粗制品。采用透析法进行絮凝剂粗产品的纯化。微生物絮凝剂粗品溶于蒸馏水后，置于由半透膜组成的透析袋内进行透析，4°C条件下透析24h后，真空干燥获得絮凝剂纯品。2、微生物絮凝剂沉降高岭土悬浊液将发酵液、(w/v)的CaCl2溶液与4g/L的高岭土悬浊液按1 2. 5 50的体积比混合，300rpm搅拌lmin, 180rpm搅拌4min。静置IOmin后，检测絮凝率，达到91. 7%0 说明红平红球菌生产的絮凝剂是一种高效的生物絮凝剂，较低的用量即可达到较高的处理效果。3、微生物絮凝剂处理养殖废水养殖废水中不添加任何絮凝剂或化学物质时，沉降速度很慢，静置15min后， IOOrnl养殖废水中悬浮颗粒沉降至89ml，40min后，沉降至61ml ；当废水中加入一定量的发酵液后，废水中出现微小絮体，沉降速度加快，静置20min后，沉降至31ml ；当一定量的发酵液和(w/v)的CaCl2溶液同时加入废水中后，废水中出现大而密的絮体，沉降速度更快， 静置15min后，沉降至6ml。说明红平红球菌生产的絮凝剂对养殖废水具有较好的沉降效^ ο将发酵液、(w/v)的CaCl2溶液与养殖废水按1 2. 5 200的体积比混合，300rpm搅拌lmin，180rpm搅拌9min。静置35min后，过滤，去除残渣。所得处理水的化学需氧量(COD)由1431mg/L降至425mg/L，氨氮由1165mg/L降至411mg/L，浊度由159NTU降到43NTU。可见，本发明所生产的微生物絮凝剂具有较好的降解有机物和除浊作用。
权利要求
1.一种微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，包括微生物絮凝剂生产菌的选取、种子液的培养、微生物絮凝剂的两步发酵生产及微生物絮凝剂的提取。
2.根据权利1所要求的微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，其特征在于(1)种子液的培养将菌种接种到种子培养基中，于观 32°C、110 130rpm的条件下培养M 30h，得到种子液；(2)微生物絮凝剂的生产采用两步发酵生产方法生产絮凝剂第一步，33 36°C、 140 160rpm的条件下发酵Mh，第二步，28 32°C、110 130rpm的条件下发酵30 48h ；(3)微生物絮凝剂的提取将两步发酵生产得到发酵液在5000 6000rpm条件下离心 20 30min，收集上清液；在上清液中加入1 2倍体积的预冷乙醇，得到沉淀物；将沉淀物真空干燥获得微生物絮凝剂。
3.根据权利1所要求的微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，其特征在于种子培养基成分蛋白胨8.0 10. Og/L，酵母粉4. 0 5. Og/L，牛肉粉1.5 2. Og/L，NaCl 8. 0 10. 0g/L, pH = 7. 0。
4.根据权利1所要求的微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，其特征在于发酵培养基成分蔗糖 16 20g/L、酵母粉 3. 0 4. 0g/L、脲 0. 5 1. 0/L、NaCl 0. 2 1. 0g/L,MgSO4 0. 1 0. 2g/L、K2HPO4 3. 0 5. 0g/L、KH2PO4 1. 0 2. 0/L,发酵培养基初始 pH 为 8. 0 10. 0。
全文摘要
本发明公开了一种微生物絮凝剂的两步发酵生产方法，包括微生物絮凝剂生产菌的选取、种子液的培养、微生物絮凝剂的两步发酵生产及提取。所述微生产菌为红平红球菌。将菌种接种到种子培养基中，于28～32℃、110～130rpm的条件下培养24～30h，得到种子液；接种1～2％的种子液至发酵培养基，采用两步发酵法生产微生物絮凝剂，第一步，33～36℃、140～160rpm的条件下发酵24h，第二步，28～32℃、110～130rpm的条件下发酵30～48h。两步发酵法可使菌株在较短时间内最大限度地利用营养物质生产絮凝剂，在60h内达到8.9g/L的絮凝剂产量。本发明公开的生产方法简便易行，生产的微生物絮凝剂具有较高的絮凝效率，对废水的有机物降解和浊度去除具有较好的效果。
文档编号C12P1/04GK102559768SQ20121002727
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者何慧军, 吴婷, 曾光明, 李新平, 杨春平, 谢更新, 邱国良, 郭俊元 申请人:湖南大学