专利名称：一种水产养殖中细菌耐药性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水产细菌耐药性高通量检测方法。可通过抗性药物的不同选取，扩展到其他细菌的耐药性检测。
背景技术：
抗生素是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。长期以来，抗生素在人类生活与生产中，都起到了至关重要的作用，但重复使用一种抗生素可能会使致病菌产生耐药性。我国是世界第一水产养殖大国，但近年来由于水产养殖污染加剧，造成养殖环境质量不断恶化，病原生物种类增多和传播速度加快，养殖病害日趋严重，水产养殖中的病害问题特别是细菌性病害在密集型养殖系统中发生频繁且影响严重，这极大地限制了我国水产养殖业的发展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素类药物，抗生素作为饲料添加剂在动物养殖业中使用非常普遍。随着抗生素类药物不断的大量使用，许多细菌都有了耐药性，且情况日益严重，使得细菌性病害在水产养殖中更为严重，极大地限制了我国水产养殖业的发展。针对水产养殖业大量使用抗生素这一现状，建立水产养殖细菌对抗生素药物敏感性的检测方法，揭示耐药性细菌在渔业环境中的扩散和传播规律，对于评价细菌耐药性的生态风险十分必要。有助于帮助人们正确使用抗生素，减少抗生素抗性基因的传播，并对新抗生药物的研发有一定的指导意义，从而确保我国水产养殖业的健康可持续发展，对于我国的生态安全和经济发展具有重要的现实意义。传统的方法是利用抗性平板法筛选出抗性细菌，平板配置量大，还需测量抑菌圈大小。因此，以传统微生物培养的方法评价抗性耗材、耗时、耗人力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种快速、有效的检测水产养殖中细菌耐药性的方法，即水产细菌耐药性高通量检测方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种水产养殖中细菌耐药性的检测方法，包括如下步骤
(1)抗菌药物贮备液的制备；
(2)菌液制备；
(3)以步骤(I)所得的抗菌药物贮备液，制备抗生素工作溶液；
(4)将96孔微量滴定板放置培养箱内孵育；
(5)通过酶标仪读取数据，进行数据分析。其中，步骤(I)抗菌药物贮备液的制备优选如下操作方法
(1)称取一定量的抗菌药物； (2)加入MHB培养基稀释药物，使药液终浓度为1024u g/ml ；(3)将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，最好置-80°C以下保存，有效期为半年。注意不能反复冻融。步骤(2)菌液的制备优选如下操作方法
(1)将分离纯化好的细菌，接种于MHB培养基中，28-37°C震荡过夜培养；
(2)用MNB培养基调整菌液浓度，使其0D600值为0.4 (约为5X 108CFU/ml)，并稀释到lX106CFU/ml。步骤(3)抗生素工作溶液的制备优选如下操作方法
(1)在无菌96孔微量滴定板的每排第2孔中加入200ill终浓度为1024 ii g/ml的药
液；
(2)在第3孔到第11孔中加入100u IMHB培养基；
(3)利用两倍稀释法，在每排中，用IOOiU移液器从每排第2孔中移出IOOiU液体加入到各自排的第3孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到每排的第11孔，每稀释混勻一孔，换一次枪头；
(4)在每排第I孔中加入200u IMHB培养基作为阴性对照；
(5)在每排第12孔中加入100u IMHB培养基和100 u I稀释好的菌液作为正常生长对照孔。(6)再在每排第2孔到第11孔中每孔加入IOOiU调好的稀释菌液。这样每排第
2孔到第 11 孔中药液浓度分别为512 V- g/ml、256 u g/ml、128 u g/ml>64 u g/ml、32 u g/ml、16 u g/ml>8 u g/ml>4 u g/ml>2 u g/ml>I u g/ml。步骤(4)培养温度在28-37°C，孵育16_24h。步骤(5)优选如下操作方法
(1)通过酶标仪设定0D600，读取数据；
(2)进行数据处理用第2个孔到第12个孔的数值减去第I个孔(阴性对照)的数值；
(3)绘制折线 (4)确定最小抑制浓度拐点值即为最小抑制浓度；
(5)将最小抑制浓度与抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)进行比较，从而确定敏感(S)、中度敏感(I)或耐药(R)；
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的方法针对水产养殖细菌的耐药性检测均有效，也可扩展到其他细菌的耐药性检测。本发明结合96孔板(8X12)的规格，以及CLSI药物浓度的范围，选取了 8种抗生素药物，10个浓度梯度进行检测。本方法对细菌耐药性的检测无需使用平板，免去了大量配置培养基，制作药敏纸片，测量抑菌圈等步骤，培养液用量小，实用性强，简便快速，结果准确、稳定，重复性好，灵敏度高，具有十分广阔的应用前景，可运用于水产养殖中细菌耐药性检测和耐药菌株的筛选及相关分析，具有很高的理论研究意义和实用价值。
图I根据第11到第2个孔的OD值，绘制的折线图。
具体实施方式
实施例I弗氏朽1檬酸杆菌Citrobacter freundii药敏试验
称取氯霉素(chloramphenicol)、甲氧节唳(Trimethoprim)、硫酸庆大霉素(gentamyciusulfate)、氟苯尼考(Florfenicol )、横胺甲恶唑(sulfamethoxazole)> 横胺11密唳(sulfadiazine)、四环素(Tetracycline)、卡那霉素(Kanamycin sulfate)8 种抗生素药物，加入MHB培养基稀释药物，使药液终浓度为1024 u g/ml，药液经过滤膜过滤，分装于无菌小瓶中_80°C保存。将分离纯化好的弗氏朽1檬酸杆菌，接种于MHB培养基中，30°C振荡过夜培养。用MNB培养基调整菌液浓度，使终浓度为I X 106CFU/ml。在无菌96孔微量滴定板的第一排第2孔中加入200 ill终浓度为1024 y g/ml的氯霉素药液；在第3孔到第11孔中加入IOOii I MHB培养基；利用两倍稀释法,用IOOii I移液器从第2孔中移出IOOiU液体加入到第3孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到第11孔，每稀释混匀一孔，换一次枪头；在第I孔中加入200iaMHB培养基作为阴性对照；在第12孔中加入IOOiUMHB培养基和100 ill稀释好的弗氏柠檬酸杆菌菌液作为正常生长对照孔；再在第2孔到第11孔中每孔加入IOOiU稀释好的弗氏柠檬酸杆菌菌液。这样第2孔到第11孔中药液浓度分别为512 ii g/ml、256 ii g/ml、128 ii g/ml、64 ii g/ml>32 u g/ml、16 y g/ml>8 u g/ml>4 u g/ml>2 u g/ml> I u g/ml。按上述方法，在第二排到第八排，依次加入甲氧苄啶、硫酸庆大霉素、氟苯尼考、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、四环素、卡那霉素这7种抗生素药物。将96孔板放在培养箱中30°C培养18h。培养后的装有菌液的96孔板，通过酶标仪设定0D600，读取数据(见表I);并进行数据处理(见表2)，绘制折线图(见图I);确定最小抑制浓度，将最小抑制浓度与抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)进行比较，从而确定敏感(S)、中度敏感(I)或耐药(R)(见表3)。表I.酶标仪设定0D600时，读取的数据，其中I为阴性对照的OD值，2_11为不同抗生素药物浓度下，的OD值，12为阳性对照的OD值。表2.数据处理用第2个孔到第11个孔的数值减去第I个孔(阴性对照)的数值，并得出的结果。表3.最小抑菌浓度与ESLI的比较结果。
权利要求
1.ー种水产养殖中细菌耐药性的检测方法，其特征在于步骤如下 (1)抗菌药物贮备液的制备； (2)菌液制备； (3)以步骤(I)所得的抗菌药物贮备液，制备抗生素工作溶液； (4)将96孔微量滴定板放置培养箱内孵育； (5)通过酶标仪读取数据，进行数据分析。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)所述抗菌药物贮备液的制备包括如下步骤 (1)称取抗菌药物； (2)加入MHB培养基稀释药物，使药液终浓度为1024μ g/ml ； (3 )将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，置-80°C以下保存。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的菌液制备包括如下步骤 (1)将分离纯化好的细菌，接种于MHB培养基中，28-37°C震荡过夜培养； (2)用MNB培养基调整菌液浓度，使其0D600值为O.4，并稀释到l*106CFU/ml。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述抗生素工作溶液的制备包括如下步骤 Cl)在无菌96孔微量滴定板的每排第2孔中加入200 μ I终浓度为1024 μ g/ml的药液； (2)在第3孔到第11孔中加入100μ I MHB培养基； (3)利用两倍稀释法，在每排中，用100μ I移液器从每排第2孔中移出ΙΟΟμΙ液体加入到各自排的第3孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到每排的第11孔，每稀释混勻一孔，换一次枪头； (4)在每排第I孔中加入200μ I MHB培养基作为阴性对照； (5)在每排第12孔中加入100μ I MHB培养基和100 μ I稀释好的菌液作为正常生长对照孔； (6)再在每排第2孔到第11孔中每孔加入100μ I调好的稀释菌液；这样每排第2孔到第 11 孔中药液浓度分别为512 μ g/ml、256 μ g/ml、128 μ g/ml、64 μ g/ml、32 μ g/ml、16 μ g/ml>8 μ g/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、I μ g/ml。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述培养温度为28-37°C，孵育 16-24h。
6.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)如下步骤 (1)通过酶标仪设定OD值为600，读取数据； (2)进行数据处理用第2个孔到第12个孔的数值减去第I个孔(阴性对照)的数值； (3)绘制折线图； (4)确定最小抑制浓度拐点值即为最小抑制浓度； (5)将最小抑制浓度与抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)进行比较，从而确定敏感(S)、中度敏感(I)或耐药(R)。
全文摘要
本发明公开了一种水产养殖中细菌耐药性的检测方法。包括(1)抗菌药物贮备液的制备；(2)菌液制备；(3)以步骤(1)所得的抗菌药物贮备液，制备抗生素工作溶液；(4)将96孔微量滴定板放置培养箱内孵育；(5)通过酶标仪读取数据，进行数据分析。本发明的方法针对水产养殖细菌的耐药性检测均有效，也可扩展到其他细菌的耐药性检测。本发明结合96孔板(8×12)的规格，以及CLSI药物浓度的范围，选取了8种抗生素药物，10个浓度梯度进行检测。本方法对细菌耐药性的检测无需使用平板，免去了大量配置培养基，制作药敏纸片，测量抑菌圈等步骤，培养液用量小，实用性强，简便快速，结果准确、稳定，重复性好，灵敏度高。
文档编号C12Q1/02GK102676629SQ20121018241
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者何建国, 袁永青, 陈旭凌, 黄志坚 申请人:中山大学, 广州力必拓生物科技有限公司