一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及活性产物的发酵生产及制备，属于生物工程领域，具体为一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用。该菌为普通变形杆菌Proteus?vulgaris，于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号：CGMCC?No.7815，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌能够发酵产生灵菌红素PG，采用改良的无机盐培养基，培养温度20～28℃、培养时间18～24h、转速150～300rpm，PG产量可达80～120mg/L。所产的灵菌红素对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白色念球菌和铜绿假单胞菌具有抑制活性，该菌在活性灵菌红素的生物制备方面有很好的应用前景。
【专利说明】一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及活性产物的发酵生产及制备，属于生物工程领域，具体为一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]灵菌红素(Prodigiosins，PG)是一类具有三吡咯环的天然红色素的总称，又名灵杆菌素、灵菌素，分子式为C2tlH25N3O (M=323.1968)，是一类脂溶性红色素。PG固体是一种呈暗红色的色素，具有绿色反光，熔点151?152°C，几乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和苯等有机溶剂。在碱性或中性溶液中呈橙黄色，酸性溶液中呈红色。在不同的酸碱条件下呈特有的最大紫外吸收波长:酸性条件在530?540nm之间有特征吸收峰，碱性条件在466?480nm之间有特征吸收峰。该色素具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制、抗肿瘤等活性，在染色、抑制赤潮方面也受到关注，在抗肿瘤方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质。
[0003]PG可由一些 链霉菌属(streptomyces)、沙雷氏菌属(serratia)及假单胞菌属(pseudomonas)等部分菌株产生的次级代谢产物，1929年由Amok等在研究Serratia生长时发现，并由Harashima等首次从粘质沙雷菌(Serratia marcescens)中分离并纯化出来。关于PG的研究始于美国，而后在欧美一些发达国家有了长足的发展，其中关于沙雷氏菌属(Serratia)产PG的研究最多。Williams以粘质沙雷氏菌(S.marcescens)Nima株为出发菌株，摇瓶培养96h后得到PG的最高产量为0.0235g/L ;Α1οηζο等以S.marcescens为出发菌株，通过调节培养基的碳氮比，利用摇瓶培养48h得到PG的最高产量为0.lg/L ；Katsumt与Nakamura以S.marcescens R-2为出发菌株,摇瓶培养48h得到灵菌红素的最高产量为
0.17g/L ;Sole等以S.marcescens为出发菌株,通过调节培养基的pH,摇瓶培养48h得到PG的最高产量为0.2g/L ;由于PG更多的活性为人们所发现，其生产亦逐渐受到人们的重视。CangS等以一株可以利用乙醇的S.marcescens S389为出发菌株,摇瓶培养48h,使得PG的产量提高了数十倍，达到了 2.95g/L Jungdon B 等以 Serratia sp.KH-95 (KFCC10970)为出发菌株，尝试利用反应器扩大发酵合成PG，通过一系列的工艺条件优化，在有内置吸附剂的生物反应器中，得到了 PG产量最大为13.lg/L。
[0004]产PG的菌多自海水或土壤中分离，在PG的产量上还不是很理想，从自然资源中筛选得到具有高产PG的微生物的途径很有应用前景；PG的生产和另外一些表型(如:酪蛋白酶活性、血细胞凝集素活性)的产生也有一定联系，从遗传学角度解释这些现象需要做进一步研究。目前，PG的摇瓶生产产量可观，但是与工业化大生产有一定距离。PG属天然色素，可大量用于食品工业，医疗事业等，现研究主要集中在PG诱导肿瘤细胞凋亡的作用上，PG的药理功效，药理机制以毒副作用等方面都尚未解决，这些方面都有待进一步深入研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用，解决发酵制备活性灵菌红素中存在的优质菌株缺少、发酵周期长等问题。
[0006]本发明的技术方案是:
[0007]一种灵菌红素产生菌,该菌为普通变形杆菌Proteus vulgaris,于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号=CGMCCN0.7815，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0008]所述的灵菌红素产生菌，该菌代号为P3，在LB培养基上菌落呈红色，呈波纹状分布，革兰氏染色阴性。
[0009]所述的灵菌红素产生菌，该菌的菌株16SrDNA的GenBank登陆号为:KF657723。
[0010]所述的灵菌红素产生菌的制备方法，采集海边泥土，取样品lg，加入IOOml无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB固体培养基平板，28°C倒置培养24h?48h，筛选红色菌落；经反复驯化分离纯化，得到灵菌红素产生菌；其中，LB固体培养基的成分为:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L，氯化钠10g/L，pH7.0?7.5。
[0011 ] 所述的灵菌红素产生菌的应用，灵菌红素产生菌应用在灵菌红素发酵制备中。
[0012]所述的灵菌红素产生菌的应用，种子培养基采用LB液体培养基，其成分为IL培养基中含有=IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl，余量为水；取10?100 μ L_80°C保存的灵菌红素产生菌浓度为50?70wt%的甘油菌液，加入5?IOmL所述的LB液体培养基中，28?30°C培养12?24h至OD6c?达0.6?1.0，以此作为种子液，进行发酵；发酵培养基采用改良的无机盐培养基，IL培养基中含有:氯化钠0.5?lg，磷酸二氢钾lg，磷酸氢二钾3g，氯化铵I?1.2g，硫酸镁lg，硝酸铵2g，果糖或蔗糖20?50g，酵母粉0.1?0.5g，余量为水，ρΗ7.0 ?8.0 ;.[0013]将上述种子液按照0.5?2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20?280C，转速150?300rpm，培养18?24h得到发酵液。
[0014]所述的灵菌红素产生菌的应用，将发酵液经6000?10000rpm，4?10°C离心8?lOmin，所得菌液的上清液用体积比为1:1?1:2的乙酸乙酯萃取，混匀后静置10?20min，利用分液漏斗分离保存有机相；菌液沉淀用3?5倍体积的丙酮萃取，充分混匀，静置5?IOmin,在4?10°C下,6000?8000rpm离心3?5min,取有机相；将获得的乙酸乙酯萃取液和丙酮萃取液经50?60°C减压蒸馏至总体积的I?2%，混合后冷冻干燥得灵菌红素粗品，灵菌红素产量80?120mg/L。
[0015]所述的灵菌红素产生菌的应用，将获得的灵菌红素溶于二甲基亚砜或酸性甲醇，配制浓度为0.5?lg/L，对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白色念球菌或铜绿假单胞菌具有抑制活性。
[0016]本发明的优点及有益效果是:
[0017]1、本发明所提供的灵菌红素产生菌P3来自山东省烟台市莱山区海岸带的泥土中，经人工富集、筛选、分离及纯化获得，能够高效发酵产生灵菌红素的细菌。经生理生化指标鉴定及16SrDNA分析，该菌为普通变性杆菌(Proteus vulgaris)，代号P3。在常规LB固体培养基上菌落呈红色，革兰氏染色为阴性。
[0018]2、本发明能够发酵生产灵菌红素的细菌及其在灵菌红素发酵生产与制备中的应用。该菌的纯培养物在改良的无机盐培养基和优化的培养条件下，24h灵菌红素的产量可达120mg/L。与现有的菌株相比，大幅缩短了发酵周期，有效提高了单位时间内灵菌红素的产量。
[0019]3、本发明针对灵菌红素的制备，提供一种低温萃取的制备工艺，利用低温高速离心、乙酸乙酯和丙酮萃取、低温浓缩、冷冻干燥，有效的保护了所制备的灵菌红素的活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:灵菌红素P3PG在甲醇溶液中紫外可见光吸收光谱扫描图。
[0021]图2:灵菌红素P3PG质谱图(LC-MS)。其中，A谱为总离子流图；B、C谱为3.94min的质谱图。
【具体实施方式】
[0022]针对本发明所用菌种及其灵菌红素的发酵制备及活性分析，采用下述方式具体实施。但本发明所述的实施方式不限于此。
[0023]实施例1:灵菌红素产生菌的筛选分离
[0024]采集山东省烟台市莱山区海边泥土，取样品lg，加入IOOml无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB固体培养基平板，28°C倒置培养24h?48h，筛选红色菌落。经反复驯化分离纯化，得到一株灵菌红素产生菌P3。其中，LB固体培养基的成分为:胰蛋白胨(Tryptone)IOg/L，酵母粉(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L，余量为水；ρΗ7.0 ?7.5，121 °C，20min高压灭菌，待冷却至50?60°C时，倒制平板。
[0025]平板观察该菌落呈明亮的红色，呈波纹状分布，革兰氏染色为阴性。该菌于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，经鉴定该菌的分类命名为普通变性杆菌(Proteus vulgaris)。
[0026]对获得的菌株进行16SrDNA序列测定，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，反应总体系为，取PCR产物2?5 μ I进行lwt%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测.用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(购自大连宝生物公司)切胶回收1.5kb大小的PCR产物进行测序分析。菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank,并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利用MEGA4.0软件，构建系统发育树，分析各分离菌株的进化地位。经鉴定:该菌株16SrDNA的GenBank登陆号为:KF657723。
[0027]实施例2:灵菌红素产生菌P3的发酵培养
[0028]种子培养基采用LB液体培养基，其成分为IL培养基中含有:10g胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl，余量为水。
[0029]取10?100 μ L_80°C保存的灵菌红素产生菌P3浓度为50?70wt%的甘油菌液，加入5?IOmL LB液体培养基中，28?30°C培养12?24h至OD6tltl达0.6?1.0，以此作为种子液，进行发酵。
[0030]发酵培养基采用改良的无机盐培养基，IL培养基中含有:氯化钠(NaCl)0.5?lg，磷酸二氢钾(KH2PO4) lg，磷酸氢二钾(K2HPO4) 3g，氯化铵(NH4Cl) I?1.2g，硫酸镁(MgSO4)lg，硝酸铵(NH4H03)2g，果糖或蔗糖20?50g，酵母粉0.1?0.5g，余量为水，pH7.0?8.0。
[0031]将种子液按照0.5?2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20?28°C，转速150?300rpm (转/分钟)，培养18?24h得到发酵液。
[0032]实施例3:灵菌红素P3PG的制备[0033]将实施例2所述的发酵液分别置于离心管，温度为4?10°C，转速6000?lOOOOrpm，离心8?lOmin。所得上清液加入1:1?1:2 (v/v)的乙酸乙酯，混匀后静置10?20min，利用分液漏斗分离保存有机相；菌液沉淀加入3?5倍体积的丙酮，充分混匀，静置5?lOmin，在4?10°C下，6000?8000rpm离心3?5min，取有机相。将获得的乙酸乙酯和丙酮萃取液在50?60°C下减压蒸馏至总体积的I?2%，冷冻干燥得灵菌红素粗品P3PG。
[0034]实施例4:P3PG结构鉴定
[0035]将实施例3获得的P3PG溶解于酸性甲醇中，利用紫外可见分光光度计扫描其在190?800nm波长段的吸光度。发现具有537nm的特征吸收峰。与已报道的灵菌红素的吸收光谱图一致。
[0036]将P3PG做液质分析=Agilent1200型液相色谱仪；色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18(50.0mmX 2.1mm，1.8 μ mid)，流动相为甲醇:浓度为0.lwt%的甲酸水溶液=70:30(体积比)，分析时间IOmin ;柱温25°C;流速0.35mL/min。质谱条件如下:AgilentG6220A飞行时间质谱仪；离子化方式为ESI(+);质量扫描范围m/zllO?1000 ;毛细管电压4000V ;雾化气压力206844Pa ;干燥气流速度10L/min ;干燥温度350°C ;碎片电压180V ;选择参比液作实时质量数矫正。结果得到相对分子量为324.27，由此可计算其分子式为C2tlH25N3O,与报道的PG的分子式一致。
[0037]如图1所示，从P3PG在甲醇溶液中紫外可见光波长扫描图可以看出，该色素在537nm处有最大吸收峰，与文献中报道的灵菌红素的紫外吸收峰535nm略有不同，可以通过测定537nm的吸收值来研究色素的表达量。
[0038]如图2所示，从P3PG质谱图可以看出，对3.94分钟相对丰度最高(图2A)的峰进行分析，发现存在m/z324.27 [M+H]，判断该色素的相对分子质量为323.27 (图2B)。逐级质谱获得的离子碎片中存在 m/z309 (图 2C)、m/z252、m/z224、m/z236、m/zl61 和 m/zl49 等，与目前已知的灵菌红素碎片数据基本一致。综合紫外可见吸收光谱和质谱分析的结果，判定该红色素主要成分为灵菌红素。
[0039]实施例5:P3PG的抑菌性能
[0040]将实施例3获得的P3PG溶于二甲基亚砜(DMS0)，配制浓度为0.7g/L。将滤纸片浸入其中，50°C干燥后，分别置于涂布金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)平板上。37°C培养24h后，观察抑菌圈的产生。
[0041]其中，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的成分为:胰蛋白胨1.5% (g/100ml)，大豆蛋白胨0.5% (g/100ml)，氯化钠0.5% (g/100ml)，余量为水。用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121°C压力蒸汽灭菌后使用。
[0042]实施例结果表明，采用本发明能够发酵产生灵菌红素(Prodigiosins),通过改良的无机盐培养基，培养温度20?28°C、培养时间18?24h、转速150?300rpm，PG产量可达80?120mg/L。所产的灵菌红素对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白色念球菌和铜绿假单胞菌具有抑制活性，该菌在活性灵菌红素的生物制备方面有很好的应用前景。
【权利要求】
1.一种灵菌红素产生菌，其特征在于:该菌为普通变形杆菌Proteus vulgaris,于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号:CGMCC N0.7815，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.按照权利要求1所述的灵菌红素产生菌，其特征在于:该菌代号为P3，在LB培养基上菌落呈红色，呈波纹状分布，革兰氏染色阴性。
3.按照权利要求1所述的灵菌红素产生菌，其特征在于:该菌的菌株16SrDNA的GenBank 登陆号为:KF657723。
4.一种权利要求1所述的灵菌红素产生菌的制备方法，其特征在于:采集海边泥土，取样品lg，加入IOOml无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB固体培养基平板，28°C倒置培养24h?48h，筛选红色菌落；经反复驯化分离纯化，得到灵菌红素产生菌；其中，LB固体培养基的成分为:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L，氯化钠10g/L，pH7.0?7.5。
5.一种权利要求1所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于:灵菌红素产生菌应用在灵菌红素发酵制备中。
6.按照权利要求5所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于:种子培养基采用LB液体培养基，其成分为IL培养基中含有:10g胰蛋白胨，5g酵母粉，IOgNaCl,余量为水；取10?ΙΟΟμ L-80°C保存的灵菌红素产生菌浓度为50?70wt%的甘油菌液，加入5?IOmL所述的LB液体培养基中，28?30°C培养12?24h至OD6tltl达0.6?1.0，以此作为种子液，进行发酵；发酵培养基采用改良的无机盐培养基，IL培养基中含有:氯化钠0.5?lg，磷酸二氢钾lg，磷酸氢二钾3g，氯化铵I?1.2g，硫酸镁lg，硝酸铵2g，果糖或蔗糖20?50g，酵母粉0.1?0.5g，余量为水，pH7.0?8.0 ; 将上述种子液 按照0.5?2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20?28°C，转速150?300rpm，培养18?24h得到发酵液。
7.按照权利要求6所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于:将发酵液经6000?10000rpm，4?10°C离心8?lOmin，所得菌液的上清液用体积比为1:1?1:2的乙酸乙酯萃取，混匀后静置10?20min，利用分液漏斗分离保存有机相；菌液沉淀用3?5倍体积的丙酮萃取，充分混勻，静置5?IOmin,在4?10°C下,6000?8000rpm离心3?5min,取有机相；将获得的乙酸乙酯萃取液和丙酮萃取液经50?60°C减压蒸馏至总体积的I?2%，混合后冷冻干燥得灵菌红素粗品，灵菌红素产量80?120mg/L。
8.按照权利要求7所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于:将获得的灵菌红素溶于二甲基亚砜或酸性甲醇，配制浓度为0.5?lg/L，对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白色念球菌或铜绿假单胞菌具有抑制活性。
【文档编号】C12P17/16GK103436476SQ201310425907
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】焦绪栋, 秦松, 崔玉琳, 李莉莉 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所