专利名称：一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物材料，具体是一种产灵菌红素的微生物菌株 及其应用。经检测，本菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ZSG)，并于2009-9-17 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 209195。(二)现有技术灵菌红素(Prodigiosins)是一类然红色素家族的总称，是由多 种放线菌(str印tomyces)和细菌(serratia，pseudomonas)产生的次级代谢产物。自从 1929年Amako等人在研究Serraria生长时发现，并由HarashimaK等人在1960年首次分离 得到此类物质以来，对该物质性质及生物活性的研究一直倍受相关研究人员的关注，随着 研究的不断深入，它的许多生物学活性被人们所认识，包括抗细菌(antibaeterial)，抗疟 疾(antimalarial)，抗真菌(antifungal和抗原生动物(antiprotozoal)的活性。但人们 最感兴趣的是此物质所具有的免疫抑制活性和引起的肿瘤细胞凋亡作用。灵菌红素的生产现状有生物合成与化学合成，主要以生物合成为主。灵菌红素是 微生物的次级代谢产物，可由多种细菌和放线菌产生，包括链霉菌属(StrePtomyce、)、沙雷 氏菌属(serratia)和假单胞菌属(Pseudomonas)，其中关于沙雷氏菌属(Serratia)的研究 最多。对灵菌红素的研究始于美国，而后在欧美一些发达国家有了长足的发展。1973年， Williams以粘质沙雷氏菌(S. marcescen，)Nima株为出发菌株，摇瓶发酵培养96h后得到 灵菌红素的最高产量为0. 0235g/L。灵菌红素的生产在化学合成上也取得了进展如1961年RapoportH与HoldenKo 首次通过全合成得到了灵菌红素，开创了灵菌红素全合成的先河。1987年Dale等人利用杂 环的Diels — Alder反应，以二甲基一 1，2，3，4 一四嗦一 3，6 —联苯双酷为起始物成功合 成出了灵菌红素。1996年意大利的AlessioRD和RossiA报道了一条新的途径合成十烷灵 菌红素，其中关键的步骤是合成二毗咯环的杂环交叉偶联。灵菌红素生理学作用美国国立癌症研究所(NSI)MelVinMS(2000)等发现灵菌红 素在平均IC5(I为2. 1微摩尔时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列 腺癌、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞系中的57种不同的人癌细胞均有抗性作用。为了阐 明其活性机理，近年来，研究人员们展开了深入的研究，发现这与其诱导细胞凋亡的活性密 切相关。尽管灵菌红素诱导细胞凋亡的详细机理尚有待进一步的研究证明，但医学界目前 就其机理提出了四种可能作为PH调节器；作为细胞分裂周期抑制剂；作为DNA裂解因子； 作为胞外信号调节激酶调节器。近年，国内也有研究人员涉足灵菌红素的研究，但注意力大多集中在灵菌红素潜 在的临床应用上面，而对灵菌红素的生产研究较少。沈亚领、刘建文、魏东芝等人在灵菌红 素对人胰腺癌细胞增殖抑制的实验做了大量研究。研究表明灵菌红素是一种很有潜力的抗 肿瘤药物，灵菌红素对人结肠腺癌细胞DLD与SW — 620及人胃癌细胞株HGT-1的实验均证 实其对这些肿瘤细胞有诱凋亡作用。类似的研究还有张靖的灵菌红素抗癌细胞浸润转移作 用及MMps活性的影响。微生物资源极其丰富，从自然资源中筛选得到具有高产灵菌红素的微生物仍然是 一条非常有应用前景的途径。本发明人从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选得到一株具有生产红色素能力的红色短杆菌，这种菌长期生活在此酸性土壤中，已适应酸性环境，由生理 生化实验和16S rRNA的序列分析表明该短杆菌为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，但 是该菌种生理生化实验中的几种次级产物酶如赖氨酸脱羧酶等与报道的粘质沙雷氏菌的 结果不一致，并且该菌株与所有报道的粘质沙雷氏菌的生长环境和筛选方法(在SM培养基 加入梯度浓度柠檬酸酸钠进行富集分离)有很大的区别，且一般粘质沙雷氏菌在酸性的环 境中产红色素的量少，或者基本不产红色素，而本菌株在PH5. 0-6. 0的酸性环境下能产生 大量的红色素，推断此红色素可能是灵菌红素，由此我们可能得到一株新的能在酸性环境 下产灵菌红素的粘质沙雷氏菌种Serratiamarcescens. zsg，并且将这株菌种用于工业上。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在酸性环境中能高产灵菌红素的菌 株，以及该菌株在制备抗肿瘤药物方面的应用。菌种筛选(一)、材料准备1.实验土壤样品取自湖北省黄石市兴华生化有限公司糖化车间2、培养基SM培养基蛋白胨10g ；牛肉膏5g ；蒸馏水1000ml ；琼脂20g(固)； CaCl2 15. 6g/L，调 pH 至 5. 0-6. 5。( 二 )、菌株的筛选分离与纯化1)初筛制备初筛菌悬液称取土壤样品lg。接种于高压灭菌的SM培养基中， 30-37°C连续培养30天进行富集，得初筛菌悬液；取初筛菌悬液20 u 1涂布于固体SM培养 基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布 分离，经多次纯化、分离，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养 基中，30°C恒温培养过夜，得分离菌悬液；2) 二次筛选制备复筛菌悬液，在一定浓度氯化铵SM培养基内，加入初筛分离菌 的分离菌悬液50ia，30°C恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20 iil涂于固体 SM培养基，30°C恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；然后挑取单菌落 在SM培养基中逐级加入一定梯次浓度的柠檬酸三钠，分离得到纯的此菌株。观察菌落的形态为菌落呈红色、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，红色菌落 周围是乳白色的菌株，推测红色是菌株的次级代谢产物，可能为灵菌红素；最适生长温度 25 37°C。对上述菌株及红色代谢物的鉴定首先，将上述所分离的微生物菌株送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保 藏，并分别进行生理生化特性、全细胞脂肪酸组分、16S rDNA基因序列的测定分析，最终确 定此菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，其菌株生理生化特性及16S rDNA基因 序列的分析报告如下菌株生理生化特性 16S rDNA序列分析主要按照以下步骤进行1)提取细菌核DNAa)集菌用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养18小时，取其菌悬液 lml于1. 5ml的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。b)力卩STE lml洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。
5
c)加600 ill TE，剧烈振荡重悬细菌，加入10%的SDS 65 yl，65°C水浴5-lOmin。d)加等体积酚氯仿抽提三次。e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心 lOmin。彻底弃上清。f)DNA沉淀用70%乙醇洗一次，风干后溶于20 yl TE备用。TE 缓冲液:10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0) ； lmmol/L EDTA_Na2 (pH8. 0)，STE 缓冲液0. lmol/L NaCl lOmmol/L Tris-Cl (pH8. 0) lmmol/L EDTA (pH8. 0)，2) 16S rDNA 基因的 PCR 扩增，PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。P1 正向引物 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，P2 反向引物 5，GGTTACCTTGTTACGACTT3，在50 ii L反应体积中，加入1 y L模板DNA (0. 1 u g), 0. 5 u L PI和P2 (终浓度为 0. 5 u M), 1 U L dNTP (每种 NTP 0. 2mM), 0. 5 u L Taq 聚合酶(2U)禾口 5 ii L 10 XPCR 缓冲液。 PCR扩增条件为94°C预变性5min ；在94°C变性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环 30次；最后72°C终延伸lOmin。3) PCR产物的回收将PCR产物以琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶， 放入1. 5ml离心管中加2倍体积TE，65°C水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后 取上层水相再用酚_氯仿_异戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍体积的lOmol/L乙酸铵和 2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70%乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。4) 16S rDNA的全序列测定和分析PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入1 y L 模板 DNA( < 0. 1 ii g), PCR 扩增 30 个循环(94°C lmin, 55°C 30s, 72°C 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分 析，最终从分子水平上确定该菌的种属。二、16S rDNA 序列测定本发明采用对16S rRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以 细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到 长度为1484bp的扩增带(用1 %琼脂糖凝胶电泳检测)，PCR产物经纯化后，测定其全序列。1) 16S rRNA 基因序列GTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTMTGTCTGGGAMCTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGAMCGGTAGCTMTACCGCATMCTGTCGCMGAGRYCAMGAGGGGAGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGACGATYCCTAGCCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGMCTGAGACMCGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGCGCMGCCTGATGCAGCCATGSCGCGTGTGTGGMGMGGCCTTCGGGTTGTAMGCACTTTCAGCGAGGAGGMGGTGGTGMCTTMTACGTTCATCMTTG
ACGTTACTCGCAGMGMGCACCGGCTMCTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGGAGGGTGCMGCGTTMTCGGMTTACTGGGCGTAMGCGCACGCAGGCGGTTTGTTMGTCAGATGTGAMTCCCCGGGCTCMCCTGGGMCTGCATTTGAMCTGGCMGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGMTTCCAGGTGTAGCGGTGAMTGCGTAGAGATCTGGAGGMTACCGGTGGCGMGGCGGCCCCCTGGACGMGACTGACGCTCAGGTGCGAMGCGTGGGGAGCAMCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAMCGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTMCGCGTTAMTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCMGGTTMMCTCAMTGMTTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGMCTTTCCAGAGATGGCATTGGTGCCTTCGGGMCTCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAMTGTTGGGTGTMGTYCCGCMCGAGCGCMCCCTTATYCTTTGKTGCCAGCGRTTCGGCCGGGMCCTCAMGGAGACTGCMAGTGATAAMCTGRAGGMGGTGGGGATGACGTCMGTCATCATGGCCCTTACGAGATAGGGCTACACACGTGCTACMTGCGCGTATACAWAGAKAAGCGACYTCGCKAGAGCMGCGGGACCTCATAMGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCMCTCGACTCCATGMGTCGGMTCGCTAGTMTCGTAGATCAGMTGCTACGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAMGMGTAGGTAGCTTMCCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGT2)16S rRNA 基因测序 BLAST 结果gb I F.T360759. 11 Serratia marcescens strain PSB19 16S ribosomal RNAgene, partial sequenceLength = 1457Score = 2534bits (1372)，Expect = 0. 0Identities = 1422/1453(97% )，Gaps = 12/1453(0% )Strand = Plus/PlusQuery 1 CATGCMGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGAOGAGOGGCGGACGGG 60| | | | | | | | | | | | | | || || || || || | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | || || || || ||Sbjct 8 CATGCMGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGAOGAGOGGCGGACGGG 67Query 61 TGAGTMTGTCTGGGMACTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGMAOGGTAGCTMT 120| | | | | | | | | | ||||||||||||||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 68 TGAGTMTGTCTGGGMACTGCCTGATGGAGGGGGATMCTACTGGMAOGGTAGCTMT 127Query 121 ACOGCATMCTGTCGCMGAGRYCMAGAGGGGAGACCTTOGGGCCTCTTGCCATCAGATG 180II II II II II III II II I II II II I II II II II II II II II II II II II IISbjct 128 ACOGCATMC"GTCGC-MGACCMAGAGGGG"GACCTTOGGGCCTCTTGCCATCAGATG 184Query 181 TGCCCAGATGGGATTAGCTRGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGAOGATYCCTAGC 240|| | | | | | | | | || || || | | | || || | | | | | | | | | || || | | | | | | | | | | || || | | | | | |Sbjct 185 TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTMTGGCTCACCTAGGCGAOGATCCCTAG- 243Query 241 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCMACACTGGMCTGAGACMCGGTCCAGACTCCTAOGGGA 300| | | | | | | | | | |||||||||||| || | | | | | | | | | | | | | | ||| | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 244 CTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGMCTGAGACACGGTCCAGACTCCTAOGGGA 303Query 301 GGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGOGCMGCCTGATGCAGCCATGSOGOGTGTGT 360|||| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Sbjct 304 GGCAGCAGTGGGGMTATTGCACMTGGGOGCMGCCTGATGCAGCCATGCOGOGTGTGT363 Query 361 GGMGMGGCCTTCGGGTTGTMAGCACTTTCAGCGAGGAGGMGGTGGTGMCTTMTA 420
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^^ o沉淀后得到的混合物用硅胶柱层析，层析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脱，最后去 溶剂得到了灵菌红素粗产品。再利用薄层色谱和柱色谱法对其进行再分，得到灵菌红素纯
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m o选540nm作为检测波长，由自制的灵菌红素标准品作浓度0D540的标准曲线，即可 由吸收值0D540，计算出灵菌红素的含量。此含量比在菌体没有做任何变异诱导和培养基的 选择的情况下都要高。通过赖氨酸脱羧酶普适测定方法，对发酵液中赖氨酸脱羧酶测定分析得到，此酶 在发酵液中存在，而已有的报道中该菌属不产赖氨酸脱羧酶，由此可推测此菌株是一株沙 雷氏菌新菌株。
本发明的菌株与以往的同属菌株相比在酸性环境中也能产具有抗肿瘤作用的灵 菌红素，菌株稳定。因此，本菌株为在医药方面尤其是制备抗肿瘤药物方面提供了广阔前 景。为相关疾病的治疗开拓了新的途径。
具体实施例方式实施例11、菌株的筛选分离与纯化实施例①初筛制备初筛菌悬液称取湖北省黄石市兴华生化有限公司糖化车间土壤 样品lg。接种于高压灭菌的SM培养基(蛋白胨10g;牛肉膏5g;蒸馏水1000ml ；琼脂 20g (固)；CaCl2 15.68/1，调？11至5.0-6.5)中，30_37°C连续培养30天进行富集，得初筛 菌悬液；取初筛菌悬液20 u 1涂布于固体SM培养基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落 在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经多次纯化、分离，最后得到不同菌 落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养基中，30°C恒温培养过夜，得分离菌悬液；②二次筛选制备复筛菌悬液，备一定浓度氯化铵SM培养基内，加入初筛分离菌 的分离菌悬液50ia，30°C恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20 iil涂于固体 SM培养基，30°C恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；然后挑取单菌落 在SM培养基中逐级加入一定梯次浓度的柠檬酸三钠，分离得到纯的此菌株。③观察菌落的形态为菌落呈红色、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，红色菌 落周围是乳白色的菌株。实施例2灵菌红素的制备与纯化实施例取实施例1中培养筛选分离的菌体应用基本培养基(SM培养基)摇瓶培养，发酵 液离心得到上清液和菌体，上清液经过乙酸乙酯萃取，菌体经过酸性甲醇萃取，两者萃取液 经过浓缩去溶剂，用乙酸乙酯溶解，低温静置，沉淀后得到了大量红色素及其它杂质的混合 物，将此混合物用硅胶柱层析，层析柱里采用氯仿和乙酸乙酯洗脱，最后去溶剂得到了灵菌 红素粗产品。再利用薄层色谱和柱色谱法对其进行再分，即得到灵菌红素纯品。实施例3将灵菌红素纯品与药剂学上可接受的赋形剂、辅料一起制备成各种剂型的抗肿瘤 药物。
权利要求
一种产灵菌红素的微生物菌株，为粘质沙雷氏菌(Serra tiamarcescensZSG)，CCTCC NOM 209195。
2.如权利要求1所述的一种产灵菌红素的微生物菌株在制备抗肿瘤药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种产灵菌红素的微生物菌株及其应用，该菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescensZSG)。该菌株与以往的同属菌株相比在酸性环境中也能产具有抗肿瘤作用的灵菌红素，菌株稳定，因此，该菌株为在医药方面尤其是制备抗肿瘤药物的应用方面提供了广阔前景；为相关疾病的治疗开拓了新的途径。
文档编号A61P35/00GK101864373SQ200910266649
公开日2010年10月20日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者冯家骏, 危威, 张佑红, 朱雄伟, 蔡再华 申请人:武汉工程大学;黄石兴华生化有限公司