专利名称：一种纤维素酶产生菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤维素酶产生菌及其应用，所本发明所涉及的纤维素酶产生菌，其具有较好的纤维素酶和半纤维素酶的产酶能力。
背景技术：
纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物，是一类可再生的资源和能源。但是纤维素很难被分解利用，如何将纤维素转化为能直接利用的资源和能源是摆在人们面前的一个难题。纤维素的降解有两条途径化学法和生物法，化学法的特异性差、纯度低、污染环境，而生物酶法可克服这些缺点，因此，纤维素酶一经发现就受到了世界各国科学界的重视。纤维素酶是指能降解纤维素kta-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切Beta-1， 4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和Beta-葡萄糖苷酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，当这三种主要成分活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。纤维素酶的应用现在已经扩展到医药、遗传、纺织、日用化工、造纸、环境、食品发酵、饲料、工业洗涤、石油开采、资源再生、废水处理、农业、生物能源等各个领域，尤其是在生物能源方面的应用，前景十分广阔。纤维素酶的获得是通过纤维素酶产生菌的发酵来得至IJ，而目前存在的主要问题是纤维素酶的酶活力不高，酶解效率不高。选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。因此纤维素酶高产菌株的筛选具有重要的生态效益、经济效益和社会效益。自然界微生物资源丰富，因而从自然界中获得高产纤维素酶的菌株是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于，提供了一种纤维素酶产生菌。本发明的纤维素酶产生菌具有较好的纤维素酶和半纤维素酶的产酶能力，尤其是对Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生产能力。本发明提供的技术方案为一种纤维素酶产生菌，纤维素酶产生菌的分类命名为桧状青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期:2011年10月9日，保藏号CGMCC5314。优选的是，所述的纤维素酶产生菌的应用中，所述纤维素酶产生菌应用于生产纤维素酶和半纤维素酶。本发明所述的纤维素酶产生菌具有较好的纤维素酶和半纤维素酶的产酶能力，尤其是对Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生产能力。本发明的纤维素酶产生菌以及所生产的纤维素酶和半纤维素酶在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业具有广泛的应用前
景ο
图1为本发明所述的纤维素酶产生菌的基因序列的进化树。图2为本发明所述的纤维素酶产生菌的菌株扫描电镜照片。图3为本发明的桧状青霉9_3(在微晶纤维素上生长)的产酶曲线。图4(a)为分别以三种纤维素生物质为底物，里氏木霉的粗酶液单独水解、桧状青霉9-3的粗酶液单独水解以及里氏木霉的粗酶液和桧状青霉9-3的粗酶液共同水解过程中的还原糖浓度变化情况图。图4(b)为分别以三种纤维素生物质为底物，里氏木霉的粗酶液单独水解、桧状青霉9-3的粗酶液单独水解以及里氏木霉的粗酶液和桧状青霉9-3的粗酶液共同水解过程中的葡萄糖浓度变化情况图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本发明提供一种纤维素酶产生菌，纤维素酶产生菌的分类命名为桧状青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏号CGMCC5314。所述的纤维素酶产生菌的应用中，所述纤维素酶产生菌应用于生产纤维素酶和半纤维素酶。一、纤维素酶产生菌的制备方法(1)将采集的可能含有菌种的样品取适量添加到含有纤维素的富集培养基中，培养3-7天后测定纤维素酶的活性，从而确定含有可以产生纤维素酶的菌群的样品；(2)针对上述步骤(1)所确定的含有可以产生纤维素酶的菌群的样品，再筛选该样品中能够产生高活力的纤维素酶的菌株，即将该样品的富集培养液稀释涂布在土豆汁固体平板上，挑取平板上长出的各个菌落到产纤维素酶的产酶培养基中，培养3-7天后测定纤维素酶活，从中筛选出生产纤维素酶酶活力较高的菌株。二、纤维素酶产生菌的鉴定1、纤维素酶产生菌的基因序列的鉴定(1)利用发酵培养基培养过夜，收集菌丝，提取真菌的基因组。发酵培养基葡萄糖10g/l，玉米浆10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l，甘油1 3g/ 1，KH2PO4 2 8g/l，MgS04 0 4g/l，CaC03 0 5g/l，Tween80 0 4g/l，pH4 7，121°C， 灭菌20min。(2)利用真菌18S rDNA的通用引物，以真菌基因组为模板，通过PCR扩增反应，扩增真菌的18S rDNA基因，并对PCR产物进行纯化，送去测序，对该菌18S rDNA 的测序结果进行数据库同源性比较。其中，真菌18S rDNA的通用上游引物序列为 GGAAGGGRTGTATTTATTAG ；通用下游引物序列为TCCTCTAAATGACCAAGTTTG。基于该菌株的18S rDNA序列已登录GenBank数据库，登录号为⑶477623，基于该菌株的18S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，使用MEGA 4. 0软件，制作进化树(见图1)。分析结果显示该菌株与Penicillium piceum代表菌种的亲缘关系最近，最终命名为桧状青霉9-3。被比对分析序列右侧为GenBank中的序列号。2、纤维素酶产生菌的菌株形态特征的表征图2为本发明的纤维素酶产生菌的扫描电镜照片。分生孢子梗发生于气生菌丝， 孢梗茎短，帚状枝双轮生，彼此紧贴。梗基每轮6-10个，瓶梗每轮5-8个，披披针状。分生孢子椭圆形或近球形，壁光滑。右图为菌落在PDA平板上30°C生长7天，菌落边缘的菌丝体薄，质地絮状，边缘兼绒状。分生孢子面暗黄绿色，菌落表面有少量淡黄色渗出液，反面黄褐色。三、纤维素酶产生菌的应用接种该菌到50ml发酵培养基中J8°C，190rpm培养，在一定时间点取样，离心，取上清测定胞外蛋白浓度和各个纤维素酶和半纤维素酶活力。以下实验中，测定滤纸酶酶活、内切葡聚糖酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活。其中，内切葡聚糖酶和 Beta-葡萄糖苷酶属于纤维素酶，且通过滤纸酶活可以确定纤维素酶的存在，并且通过滤纸酶活力可以表征纤维素酶的活力水平；木聚糖酶属于半纤维素酶，通过木聚糖酶测定可以确定半纤维素酶的活力水平。发酵培养基微晶纤维素20 50g/l，玉米浆10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l， 甘油 1 3g/l, KH2PO4 2 8g/l, MgSO4 0 4g/l, CaCO3 0 5g/l, Tween80 0 4g/l, pH4 7，121°C 灭菌 20min。1、纤维素酶活测定方法(1)葡萄糖标准曲线的绘制配置10mg/ml葡萄糖母液，并稀释成2. 0，3. 3，5. O和6. 7mg/ml的葡萄糖溶液样品。取0. 5ml的葡萄糖溶液样品加到Iml的0. 05M, ρΗ4· 8的柠檬酸缓冲溶液中，再加3ml 的DNS反应液，混勻，沸水浴加热5min，冷却至室温。使用分光光度计测定0M40。以0M40 为纵坐标，对应葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。(2)木糖标准曲线的绘制配制O. OlM( = 0. 15g/100ml 缓冲液)，稀释成 10,5,3. 33 禾口 2ymol/ml 的木糖溶液样品，取0. 2ml加到1. 8ml的木聚糖底物溶液中，添加;3mlDNS反应液，混勻，沸水浴加热 5min，冷却并离心。使用分光光度计于波长MOnm下测定上清液吸光度0M40。以0D540为纵坐标，对应木糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。(3)BSA蛋白质标准曲线的绘制采用Bradford法测定蛋白浓度，制作BSA蛋白质标准曲线，即分别吸取10mg/ml 的BSA蛋白质标准液0、10、15、20、25、30μ 1，分别加水定容至lOOul，加入Iml Bradford 试剂，混勻，室温静置lOmin。以不含蛋白质的混合液为空白对照。使用分光光度计测定 0D595。测定三次求平均值。以0D595为纵坐标，对应蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。(4)滤纸酶酶活测定试管内添加1. 0ml,0. 05M，pH4. 8柠檬酸钠缓冲液。添加0. 5ml的稀释酶液。加热至50°C，添加一条滤纸条带混合。50°C水浴反应60min，立即添加3. OmlDNS反应液混勻终止反应。沸水浴加热5min后，转移至冷水浴，冷却。取0.45ml颜色反应后的混合液，加入2. Oml去离子水或蒸馏水，充分混勻。在MOnm下读取吸光度。由标准曲线读取样品的葡萄
糖含量。(5)内切葡聚糖酶酶活测定添加0. 5ml的稀释酶液至试管内。加热至50°C，添加0. 5ml的底物溶液(用0. 05M, PH4. 8的柠檬酸缓冲液溶解，制备2%羧甲基纤维素(钠)，取代度=0. 7)，50°C水浴反应 30min。添加3. Oml的DNS反应液，混勻。沸水浴加热5min。转移样品至冷水浴，添加20ml 蒸馏水或去离子水，充分混勻。540nm处读取样品的吸光度。根据葡萄糖标准曲线，将测定管的样品的吸光度转换为葡萄糖的浓度。(6) Beta-葡萄糖苷酶酶活测定添加Iml酶液溶解于柠檬酸缓冲液中。加热至50 °C，添加1.0ml的底物溶液 (15. OmM纤维二糖，溶解于0. 05M, pH4. 8的柠檬酸缓冲液，该反应液需要现用现配)，混勻。 50°C水浴反应30min。沸水浴加热5. Omin，终止反应。冷却，通过葡萄糖分析仪测定葡萄糖
的含量。(7)木聚糖酶酶活测定添加1. 8ml的底物溶液(用0. 05M，pH5. 3的柠檬酸缓冲液溶解，制备1 %木聚糖悬浮液)和添加0. 2ml的稀释酶液至试管内。50°C水浴反应5min。添加3. Oml的DNS反应液，混勻。沸水浴加热5min。转移样品至冷水浴，然后离心沉淀未反应的底物，上清液于 540nm处读取样品的吸光度。根据木糖标准曲线，将测定管的样品的吸光度转换为木糖的浓度。(8)蛋白质浓度测定使用Bradford方法测定蛋白质浓度，即将蛋白质样品进行适当倍数的稀释，取 100 μ 1加入Iml Bradford试剂，混勻，静置lOmin，后使用分光光度计测定0D595。三次测定求平均值。后根据标准曲线和稀释倍数计算出该样品的蛋白质浓度。2、纤维素酶产生菌产酶的特性分析1、产酶曲线本发明的纤维素酶产生菌培养时间为8天，每隔24h取样。分别测定不同培养时间下的滤纸酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和蛋白浓度，绘制发酵过程曲线。图3为本发明的桧状青霉9-3(在微晶纤维素上生长)的产酶曲线(其中， 代表滤纸酶酶活，▲代表蛋白浓度，■代表Beta-葡萄糖苷酶酶活)。在下，桧状青霉培养 3天时，此时已经具有较高的滤纸酶酶活(1. 47IU/ml)、Beta-葡萄糖苷酶酶活(12. 03IU/ ml)、蛋白浓度(1. 16mg/ml)。证明该菌的产酶周期较短，容易实现工业化生产。并且，由图 3可以看出，桧状青霉培养7天可达到最高产酶。2、纤维素酶产生菌产酶能力的比较将黑曲霉CGMCC 3. 316(购自于中国普通微生物菌种保藏中心)，里氏木霉RUT C-30 (CICC13052,购自中国工业微生物菌种保藏中心)和桧状青霉9_3接种于微晶纤维素酶发酵培养基，培养温度为25 30°C，摇床转速为150 250转/分进行震荡培养，取发酵 5天时培养液，分别测定滤纸酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、内切葡聚糖酶酶活、木聚糖酶活力以及蛋白浓度。表1桧状青霉9-3与黑曲霉CGMCC 3. 316和里氏木霉RUT C-30的产酶能力比较
权利要求
1.一种纤维素酶产生菌，其特征在于，纤维素酶产生菌的分类命名为桧状青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏号CGMCC5314。
2.如权利要求1所述的纤维素酶产生菌的应用，其特征在于，所述纤维素酶产生菌应用于生产纤维素酶和半纤维素酶。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素酶产生菌，纤维素酶产生菌的分类命名为桧状青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NO1所述，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏号CGMCC5314。本发明所述的纤维素酶产生菌具有较好的纤维素酶和半纤维素酶的产酶能力，尤其是对Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生产能力。本发明的纤维素酶产生菌以及所生产的纤维素酶和半纤维素酶在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/80GK102533563SQ20111035166
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者武改红, 蔡鹏丽, 贾文娣, 陈树林, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所, 天津工业生物技术研究所